Biochimica 2

Biochimica modulo 2

Date: February 26, 2024

University of Trento
Biomolecular Science and Technology
Via Sommarive 9, 38123
Povo (TN), Italy

Membrane e trasporti

La cellula è uno spazio compartimentalizzato grazie alla presenza di membrane lipidiche che sono delle barriere che impediscono lo scambio di materiale; per lo scambio di sostanze sono necessari dei canali di trasporto.

Le membrane sono composte da lipidi:

• Gli acidi grassi (catena idrocarburica con testa carbossilica) tendono a formare delle micelle per via della loro struttura e dell’idrofobicità della coda.
• Un lipide con 2 code di acidi grassi (fosfolipide) ha una forma cilindrica; quindi, non tende a formare una micella, ma un doppio strato fosfolipidico che espone le teste idrofobiche all’esterno. Per minimizzare l’esposizione della regione idrofobica al solvente acquoso avviene la formazione di una sfera costituita da doppio strato fosfolipidico, questo è come va a formarsi una vescicola e anche la cellula.

Micelle

Le micelle si formano in una soluzione di molecole anfipatiche che hanno la testa più grande della coda. Sono costituite da acidi grassi e sodio dodecil fosfato. Ogni micella è formata da poche dozzine fino a migliaia di molecole lipidiche.

L’aggregazione avviene quando la concentrazione di molecole è superiore ad una certa soglia. Le singole unità sono a cuneo (sezione trasversale della testa maggiore del lato della catena).

Il doppio strato lipidico

Lo strato lipidico consiste in due “depliant” di monostrati lipidici. La testa idrofilica dei gruppi interagisce con l’acqua, mentre le code idrofobiche degli acidi grassi sono compattate all’interno. Uno strato si affaccia sul citoplasma, l’altro si affaccia sullo spazio extracellulare o all’interno dell’organello racchiuso da una membrana. Le singole unità sono cilindriche (la sezione trasversale della testa è la stessa del lato della catena).

Vescicole (liposomi)

Piccoli doppi strati si sigillano spontaneamente in vescicole sferiche. Le membrane delle vescicole possono contenere proteine inserite artificialmente. La cavità acquosa centrale può racchiudere molecole disciolte. Sono utili vettori artificiali di molecole (ad esempio, farmaci). Le vescicole si fondono facilmente con le membrane cellulari o tra loro.

Che cosa sono le membrane?

Sono strutture complesse a base lipidica che formano fogli pieghevoli e sono composte da una varietà di lipidi e proteine. Alcuni lipidi e proteine della membrana sono glicosilati. Tutte le celle hanno una membrana cellulare, che separa la cella dal suo circostante. Le cellule eucariotiche hanno diverse membrane interne che dividono lo spazio interno in compartimenti.

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Funzioni delle membrane

Esistono membrane esterne ed interne, il cui ruolo è:

• Definire i confini della cellula;
• Compartimentalizzare, ovvero separare ambienti diversi dove si svolgono funzioni diverse;
• Permettere l’import e l’export di nutrienti (come il lattosio) e altre sostanze (di rifiuto e tossine);
• Trattenere ioni e metaboliti all’interno della cellula;
• Percepire segnali esterni che regolano la cellula e trasmettere informazioni all’interno della cellula;
• Produrre e trasmettere segnali nervosi;
• Permette di fare una separazione di carica e quindi creare una differenza di potenziale che permette di creare energia (immagazzinare l’energia come gradiente protonico);
• Supportare la sintesi di ATP.

Caratteristiche comuni delle membrane

• Struttura flessibile simile ad un foglio, spessa 30-60 Å (3-6 nm);
• La struttura principale è composta da due foglietti di lipidi (bilayer), con l’eccezione degli archaebacteria che hanno un monolayer di lipidi bifunzionali;
• Si formano spontaneamente in soluzione acquosa e sono stabilizzati da forze non covalenti, specialmente effetto idrofobico;
• Molecole proteiche sono contenute nel doppio strato lipidico;
• Sono asimmetriche:
  • Alcuni lipidi si trovano principalmente “dentro”;
  • Alcuni lipidi si trovano principalmente “fuori”;
  • Metaboliti a base di carboidrati sono sempre fuori dalla cellula;
  • Sono elettricamente polarizzati (dentro negativamente -60 mV);
• Sono strutture fluide: soluzione bidimensionale di lipidi orientati.

Modello a mosaico fluido delle membrane

Si tratta di un modello proposto nel 1972 da Singer e Nicholson (UCSD) in cui i lipidi formano una solvente bidimensionale viscoso in cui le proteine sono inserite e integrate più o meno in profondità. Le proteine integrali sono fermamente associate con la membrana, spesso comprendendo il doppio strato. Le proteine periferiche sono debolmente associate e possono essere rimosse facilmente. Molte sono legate non covalentemente, molte sono legate a lipidi di membrana.

Dettagli del modello a mosaico fluido

Le catene di acile grasso all'interno della membrana formano un fluido, regione idrofoba. Le proteine integrali galleggiano in questo mare di lipidi, tenuto dalle interazioni idrofobiche con le loro catene laterali degli amminoacidi non polari. Sia le proteine che i lipidi sono liberi di muoversi lateralmente nel piano del doppio strato, ma il movimento di entrambi da un foglietto del doppio strato all'altro è limitato. Le frazioni di carboidrati attaccate ad alcune proteine e lipidi della membrana plasmatica sono esposte sulla superficie extracellulare.

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La composizione delle membrane

La composizione lipidica delle membrane è diversa in organismi differenti, tessuti e organelli per:

• Rapporto di lipidi e proteine;
• Tipo di fosfolipidi;
• Abbondanza di vari tipi di steroli (i procarioti mancano di steroli);

La specializzazione funzionale di ogni tipo di membrana si riflette nella sua composizione lipidica unica. Il colesterolo è prominente in membrane plasmatiche ma appena rilevabile in membrane mitocondriali.

Le membrane a doppio strato sono asimmetriche

Le membrane sono asimmetriche, infatti lo strato interno è diverso in termini di composizione e funzione rispetto a quello esterno. All’interno del doppio strato sono presenti diverse proteine e lipidi rispetto allo strato esterno della membrana. Anche le proteine di transmembrana espongono domini diversi all’esterno e all’interno; il giusto orientamento è indispensabile per il corretto funzionamento della proteina. Le proteine contenenti zuccheri sono sempre esposte all’esterno. Le lipoproteine collegate ad un’ancora GPI sono sempre esposte all’esterno. Le lipoproteine collegate a degli acidi grassi sono presenti all’interno.

Infine, le membrane presentano una polarità elettrica: -60mV all’interno rispetto che all’esterno: infatti, i lipidi con carica (-) vengono generalmente esposti sul lato interno, ad esempio la fosfatidilserina, che ha carica -1, mentre i lipidi esposti all’esterno sono generalmente carichi positivamente. Questo permette di mantenere una differente carica da una parte all’altra della membrana. Se la fosfatidilserina è esposta all’esterno i macrofagi del sistema immunitario sono in grado di riconoscerla e avviene la degradazione della cellula.

Per le piastrine l’esposizione della fosfatidilserina determina l’inizio del processo di coagulazione. Quindi le membrane sono asimmetriche sia in termini di composizione lipidica che di orientamento e inserimento delle proteine.

Zattere lipidiche

Queste strutture sono zone della membrana più rigide dal momento che sono più ricche di colesterolo. Sono zone in cui sono molto concentrate alcune proteine di membrana, queste zattere lipidiche hanno un ruolo importante nella vescicolazione e nella percezione di segnali extracellulari.

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Proteine di membrana

A seconda del tipo di membrana presa in considerazione è presente una diversa composizione di lipidi caratteristica. All’interno del doppio strato fosfolipidico sono inserite numerose proteine che svolgono diverse funzioni:

• Recettori: captano segnali provenienti dall’esterno come luce, ormoni, neurotrasmettitori e feromoni;
• Trasportatori, canali, porte e pompe per nutrienti (maltaporine), per ioni (canali per gli ioni calcio) e per neurotrasmettitori (proteina di ricaptazione della serotonina);
• Enzimi come biosintesi dei lipidi e sintesi di ATP.

Tre tipi di proteine di membrana

• Le proteine periferiche sono liberate dai cambiamenti nel pH o nella forza ionica: ionico o legami a idrogeno alle proteine e ai lipidi integrali.
• Le proteine integrali sono estraibili con i detergenti, che interrompono le interazioni idrofobiche con il doppio strato lipidico e formano i cluster micelle-simili intorno alle singole molecole della proteina.
• Le proteine anfitropiche possono o non possono associarsi con le membrane, secondo processi regolatori reversibili quali fosforilazione, modificazioni covalenti con i lipidi o l'associazione con dei ligandi.

Proteine integrali di membrana

Si trovano in tutta la membrana e hanno simmetrie come le membrane: differenti domini in differenti compartimenti. Possiedono un’a elica di 20-25 amminoacidi che spazia all’interno della membrana (1.5 Ang per amminoacido dell’a elica; 20 aa = 30 Ang). Le proteine di transmembrana sono costituite da amminoacidi idrofobici; le eliche permettono di esporre i gruppi R apolari all’esterno e i gruppi polari all’interno, quali i gruppi ammidici della backbone che svolgono legami idrogeno tra loro; quindi, questo permette di minimizzare l’energia e determinare la formazione di una molecola localmente idrofobica.

La membrana è 30 A, considerando che l’alfa elica avanza di 1,5 A per ogni amminoacido significa che sono necessari almeno 20 aa per attraversare la membrana, ma se l’alfa elica è disposta in diagonale ne servono anche di più.

Variando la composizione salina del solvente, le proteine periferiche si staccano dalla membrana, mentre quelle integrali di membrana restano attaccate al doppio strato fosfolipidico. Per solubilizzare una proteina integrale di membrana è necessario utilizzare un detergente che forma una micella attorno alla zona idrofobica della proteina.

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I grafici di idropatia possono predire i domini di transmembrana

Si basano sulla variazione di energia libera di Gibbs quando un segmento di una proteina si sposta da un DG solvente apolare ad un solvente polare. È misurata per tutti gli amminoacidi quando soggetti al cambio di solvente. Questo significa che una proteina, per essere di membrana, deve avere una struttura primaria specifica. Infatti, in base alla sequenza amminoacidica data è possibile prevedere il dispendio energetico necessario per DG inserire questa proteina nel doppio strato fosfolipidico. Negativo significa che si tratta di un processo spontaneo.

Quindi se esposti ad un ambiente idrofilico, gli amminoacidi devono presentare un ΔG positivo, quindi analizzando la sequenza di una proteina se sono presenti stretch di circa 20-40 aa idrofobici intervallati da brevi tratti idrofili, si tratta molto probabilmente di una proteina di transmembrana.

Amminoacidi in cluster di proteine di membrana in regioni distinte

• Segmenti di transmembrana sono predominantemente idrofobici.
• Gli amminoacidi basici vengono esposti vicino ai lipidi con carica negativa (quindi sullo strato interno della membrana), mentre gli amminoacidi negativi sono esposti all’esterno. Amminoacidi carichi si trovano solo nei domini acquosi. Lys e Arg si trovano comunemente all’interno (citoplasma).
• Tyr e Trp sono amminoacidi aromatici, ma anche polari; quindi, sono caratterizzati da anfipaticità questo permette di posizionarli in corrispondenza dell'interfaccia tra lo strato fosfolipidico e l’ambiente polare.

Le proteine di membrana contengono anche foglietti

Sono proteine che si trovano prevalentemente all’interno di batteri, dei mitocondri e dei cloroplasti, mentre nelle cellule eucariotiche sono rare. Queste proteine sono costituite da tanti sheets, che sono strutture dritte; quindi, per passare lo spessore della membrana sono necessari meno amminoacidi (7-9 aa idrofobici) seguiti da un loop. Quindi in questo caso è più difficile capire se si tratta di una proteina di transmembrana o meno dal momento che il numero di aa idrofobici consecutivi è minore e quindi potrebbe trattarsi di una cosa non collegata alla necessità di attraversare la membrana.

Le proteine anfipatiche sono legate alla membrana non covalentemente perché contengono gruppi idrofobici che sono a contatto con la membrana e gruppi polari che sono esposti al solvente acquoso. Esistono anche le lipoproteine che sono legate alla membrana grazie ad una coda lipidica: se è presente una coda GPI, allora la proteina viene esposta all’esterno della cellula, mentre se è legata ad una coda di acidi grassi generica, allora la proteina viene esposta sul lato citosolico. Le proteine contenenti oligo o polisaccaridi sono esposte sempre all'esterno della membrana, quindi i glicolipidi sono esposti all’esterno.

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Dinamiche della membrana μm/s)

Un lipide si muove facilmente e velocemente (1 lungo il piano della membrana senza invertire il suo orientamento (diffusione laterale non catalizzata), mentre spostarsi da uno strato all’altro della membrana (diffusione trasversale) è molto più dispendioso a livello energetico e quindi è necessario l’utilizzo di enzimi per catalizzare questo spostamento. I salti spontanei da un foglietto all'altro sono rari perché il gruppo di testa carico deve attraversare la regione della coda idrofoba della membrana. Questa tipologia di spostamento prende il nome di diffusione ‘flip-flop’ e se non viene catalizzata avviene in un tempo molto lungo (1-2 gg).

Ci sono delle proteine che creano asimmetria, ovvero le flippasi che catalizzano la diffusione trasversale e le floppasi; sono delle ATPasi dato che è necessario fornire ATP come forma di energia necessaria a svolgere questo processo. Utilizzano l’ATP per spostare lipidi contro gradiente.

La scramblasi è una proteina che crea disordine, quindi sposta i lipidi rispetto al loro gradiente creando una situazione di disordine. La scramblasi tende a essere mantenuta spenta da parte della cellula fin quando non si verificano condizioni che determinano la sua attivazione, ad esempio l’iniziazione dell’apoptosi.

Fusione delle membrane

Le membrane si possono fondere tra di loro senza perdere continuità. La fusione può essere spontanea o mediata da proteine.

Rilascio di neurotrasmettitori

La membrana vescicolare secretoria contiene la sinaptobrevina v-SNARE (rossa). La membrana del bersaglio (plasma) contiene le t-trappole Syntaxin (blu) e SNAP25 (viola). Quando un aumento locale in [Ca2+] segnala il rilascio di neurotrasmettitore, v-SNARE, SNAP25 e t-SNARE interagiscono, formando un fascio a spirale di quattro eliche α, tirando insieme le due membrane e interrompendo localmente il doppio strato. Questo porta prima all'emifusione, unendo le foglioline esterne delle due membrane, quindi a completare la fusione della membrana e il rilascio del neurotrasmettitore. NSF (fattore di fusione sensibile all'N-etilmaimmide) agisce nello smontaggio del complesso SNARE quando la fusione è completa. Le tossine botuliniche e tetano sono proteasi che degradano le proteine SNARE, bloccando quindi la neurotrasmissione.

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Trasporto attraverso le membrane

Le cellule sono permeabili a piccole molecole non polari che diffondono passivamente attraverso la membrana. La diffusione passiva di molecole polari coinvolge la desolvatazione e questo ha un’alta barriera di attivazione. Il trasporto attraverso la membrana può essere facilitato da proteine che forniscono un percorso di diffusione alternativo. Queste proteine sono chiamate trasportatori o permeasi.

Tipi di trasporto

Alcuni tipi (ionofori, canali ionici e trasportatori passivi) semplicemente accelerano il movimento transmembrana dei soluti lungo i loro gradienti elettrochimici, mentre altri (trasportatori attivi) possono pompare soluti contro un gradiente, utilizzando ATP o un gradiente di un secondo soluto per fornire l'energia.

Nella semplice diffusione, la rimozione del guscio di idratazione è altamente endergonica e l'energia di attivazione (DG‡) per la diffusione attraverso il doppio strato è molto alta. Una proteina trasportatore riduce la DG‡ per la diffusione transmembrana del soluto. Lo fa formando interazioni non covalenti con il soluto disidratato per sostituire il legame idrogeno con l'acqua e fornendo una via transmembrana idrofila.

Proteine di trasporto: canali vs trasportatori

• Canali: un canale è un passaggio poco selettivo per l’entrata e l’uscita di molecole in risposta ad un segnale e la velocità del trasporto è molto più elevata rispetto a quella dei trasportatori. Ha un filtro di selettività che seleziona le molecole in base alla dimensione. Nei canali avviene un trasporto secondo gradiente di concentrazione, quindi, sono caratterizzati da trasporto passivo e libera diffusione. Il canale di trasporto però può essere chiuso all’occorrenza.
• Trasportatori: sono costituiti da due cancelli che non si aprono mai simultaneamente. Sono molto più lenti dei canali e possono essere saturati dal soluto. Hanno un sito di legame specifico per una molecola e permettono il trasporto selettivo della molecola riconosciuta da esso. Dal momento che c’è un sito di legame specifico per un substrato,