Appunti secondo semestre Biologia generale e cellulare

Martedì 7 marzo 2023

Microscopia

Biologia

• Microscopia —> gran parte delle cellule e delle loro strutture cellulari sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo —> ciò dipende dal “potere di risoluzione” e dalle dimensioni delle cellule:
• Cellula eucariotica —> 10-100 μm.
• Cellula procariotica —> 1-5 μm.

L’ingrandimento da solo non basta —> la microscopia infatti ci permette, oltre al solo guardare, anche di concentrarci sui particolari (risoluzione).

Risoluzione (“potere risolutivo”) —> distanza minima con la quale si possono riconoscere come distinti due punti estremamente vicini fra loro (nell’occhio umano è di 0,2 mm).

Ottica geometrica —> utilizzate lenti stigmatiche che fanno in modo che i fasci emergenti da un punto poi convergano tutti nello stesso punto.

Lenti reali —> sono stigmatiche solo per raggi che non si allontanano troppo dall’asse ottico (raggi parassiali).

Fuoco e limite di risoluzione

1. Fuoco (“piano focale”) —> punto dove convergono i fasci (esistono diversi piani focali).

Quanto si può ingrandire dipende dalle lenti —> “limite di risoluzione” di un microscopio è la distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti —> si calcola tramite l’equazione di Abbè:

• N α sin —> apertura numerica (N.A.).

Quindi la risoluzione del microscopio dipende da:

• λ Lunghezza d’onda della luce utilizzata ( ) —> diminuendola posso vedere oggetti più piccoli.
• N Indice di rifrazione ( ) —> caratteristica tipica del mezzo che separa il campione dall’obiettivo e dal condensatore, grandezza adimensionale, valore che indica come cambia (diminuisce) la velocità con cui la luce passa da un mezzo all’altro.
• α Apertura angolare dell’obiettivo ( ) —> è metà della larghezza angolare del cono di raggi raccolti dall’obiettivo da un punto tipico del campione, è un valore sempre inferiore a 90º.

Si può dire che:

• Maggiore è l’angolo con cui l’obiettivo è in grado di raccogliere la luce —> maggiore è il potere di risoluzione.
• Maggiore è N.A. —> minore è la distanza di lavoro (distanza tra obiettivo e campione).

In ogni caso —> il limite di risoluzione può essere migliorato (diminuito):

• Diminuendo λ (non è possibile con il microscopio ottico) —> λ è 400-700 nm per la luce visibile, 200-400 nm per la luce UV, e solo 0,04 nm per elettroni accelerati a 100 kV.
• Aumentando N.A. —> si può fare interponendo tra obiettivo e campione un olio con un indice di rifrazione simile a quello del vetro.

Microscopi ottici

Microscopio ottico

A. Microscopio ottico —> la sorgente di radiazioni è luce bianca ed è attaccato allo stativo (il corpo del microscopio) —> formato da:

1. Diaframma

Regola l’ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore in relazione all’obiettivo (N.A.) scelto.

Prima di questo sistema —> inserito un banco di filtri che permette di cambiare il colore della luce bianca proveniente dalla fonte luminosa —> filtro blu che taglia le radiazioni UV che non servono.

Fonte luminosa —> è una lampada alogena o LED munita di sistemi di allineamento e di reostato per la regolazione dell’intensità che produce una luce bianca.

2. Condensatore

Si trova fra il diaframma di campo e l’oggetto da analizzare e serve a mettere a fuoco la luce sul campione regolando la luce che arriva sul vetrino.

Sul lato sx del condensatore —> manopola che serve a regolare la distanza dal campione:

• Se è più vicino, una luce intensa è focalizzata sul campione.
• Se è più lontano, la luce che raggiungerà il campione sarà poco intensa e diffusa.

Il condensatore vicino al campione è usato nel caso in cui questo sia colorato, mentre il condensatore posto lontano dal campione serve ad aumentare il contrasto di campioni non colorati.

Anche il condensatore può essere dotato di un diaframma che regola la quantità di luce da dirigere sul campione.

3. Tavolino traslatore

Serve da base di appoggio per il campione da osservare.

Possiede 2 manopole sulla destra in grado di muovere il tavolino a destra o a sinistra, ed in avanti ed indietro.

4. Revolver con obiettivi

4 diversi tipi di revolver:

• 4x (rosso) —> per osservazioni a secco in campo chiaro con campo largo.
• 10x (giallo) —> per osservazione a secco in campo chiaro o scuro.
• 20x (verde) —> per osservazione a secco in campo chiaro o scuro.
• 40x (blu) —> per osservazione in campo chiaro o scuro.
• 100x (bianco) —> per osservazione in campo chiaro o scuro ad immersione (olio fra il preparato e la lente frontale dell’obiettivo).

Il revolver può essere ruotato portando l’obiettivo desiderato in corrispondenza del preparato.

5. Oculari

Sono 2 con ingrandimento 10x e con possibilità di messa a fuoco differenziale e regolazione della distanza interoculare.

I microscopi dal circo sono muniti spesso di una macchina fotografica o di una telecamera interfacciate con un computer, che permette di acquisire ed analizzare le immagini.

Ingrandimento totale = ingrandimento obiettivo x ingrandimento oculare.

6. Vite macrometrica e micrometrica

Regolano la distanza tra campione da osservare ed obiettivo, alzando o abbassando il tavolino traslatore.

Permettono la messa a fuoco del campione:

• Macrometrica —> permette di compiere movimenti ampi, consentendo una regolazione grossolana.
• Micrometrica —> permette una regolazione più fine.

Stereomicroscopio

B. Stereomicroscopio —> vantaggio di avere 2 cammini ottici separati ed ha la possibilità di illuminare il campione da diversi angoli (anche dal basso).

Consente ingrandimenti limitati —> infatti ha solo un ingrandimento intorno ai 40x totale (non tanto).

Riesco a vedere il mio campione in maniera tridimensionale grazie ai 2 cammini ottici che forniscono all’occhio destro e all’occhio sinistro immagini diversamente angolate, e qui l’ombreggiatura aiuta molto.

Si può utilizzare una sorgente di luce sotto il campione o una sorgente di luce che illumina il campione da sopra o da lato (luce riflessa).

Microscopio invertito o rovesciato

C. Microscopio invertito o rovesciato —> qua la luce arriva da sopra mentre gli obiettivi sono sotto al campione.

Qui non ho gli oculari in mezzo —> vantaggio di poter mettere direttamente le mani sul campione.

Meccanismi di contrasto con microscopia ottica

Un problema che si pone nello studio al microscopio di campioni biologici è il loro scarso contrasto —> soltanto in presenza di contrasto infatti si possono distinguere le diverse strutture.

Diversi tipi di contrasto:

• Contrasto di ampiezza (bright field).
• Contrasto di diffrazione (dark field).
• Contrasto di fase.
• Differential Interference Contrast (DIC).
• Polarizzazione.
• Fluorescenza.

1. Campo chiaro (bright field)

È la tecnica normale (l’obiettivo raccoglie tutta la luce che è trasmessa o riflessa dal campione).

È basata sull’assorbimento della luce (o di alcune lunghezze d’onda) maggiore o minore da parte di aree diverse del campione che quindi risultano più o meno chiare (o di colore diverso).

È una tecnica che si basa direttamente sul contrasto di intensità (o di colore) —> ecco perché si chiama “contrasto di ampiezza” (l’intensità è il quadrato dell’ampiezza dell’onda).

Problema —> molte strutture sono incolori o trasparenti e sul campo chiaro c’è il rischio di non vederle, allora le coloro, ma la colorazione presenta alcuni problemi (devo uccidere le cellule per colorarle e quindi guarderò una struttura morta e manipolata).

2. Campo scuro (dark field)

Tecnica usata per oggetti che assorbono poco, ma diffondono —> l’obiettivo raccoglie solo la luce che è diffusa dal campione.

Al posto di far arrivare la luce direttamente sul campione, uso un filtro o una lente che permette al fascio filtrato di illuminare il campione con un certo angolo —> l’obiettivo quindi raccoglie solo la luce che è diffusa dal campione.

Risultano chiari solo gli oggetti che diffondono o diffrangono, mentre il fondo risulta scuro.

Vantaggioso quando ci sono oggetti trasparenti, per alcuni batteri ecc.

3. Contrasto di fase

Tecnica per oggetti trasparenti e che non diffondono.

Nell’attraversamento del campione la luce subisce un cambiamento di fase che può venir sfruttato per creare interferenza con il fascio diretto.

I cambiamenti nell’intensità luminosa sono percepiti dall’occhio come zone più chiare e zone più scure.

Contrasto —> ottenuto grazie al cambiamento di fase del raggio luminoso che attraversa una certa regione dell’oggetto esaminato —> la fase del raggio luminoso può essere cambiata a seconda della consistenza del materiale che l’attraversa (cambiamenti da attribuire alla diversa velocità con cui le diverse lunghezze d’onda attraversano il materiale).

Zone più chiare e zone più scure —> permettono di visualizzare il campione in esame (si possono vedere strutture trasparenti).

Cambiamento di fase della luce indotto dal campione —> utilizzato per generare contrasto.

4. Fluorescenza

Microscopio a fluorescenza —> geometria di illuminazione differente (non da sotto, ma da lato).

Il composto fluorescente emette luce sul background scuro di un campione —> permette la localizzazione di specifiche molecole, strutture cellulari o compartimenti all’interno della cellula.

Quindi si utilizza luce emessa dal campione —> il composto fluorescente può essere associato direttamente o indirettamente alla molecola da osservare nelle cellule (si può avere qualcosa di naturalmente fluorescente nel campione come la clorofilla nelle foglie, oppure posso aggiungere io elementi fluorescenti, come i fluorofori, sonde fluorescenti, proteine fluorescenti della cellula stessa, anticorpi fluorescenti, che presentano colori diversi).

Le cellule possono essere osservate fissate oppure vive —> fluorescenza molto utile per lo studio di tessuti vitali e tessuti intatti.

L’energia luminosa assorbita da un pigmento viene ri-emessa come calore e fluorescenza (vedo sempre luce emessa che ha lunghezza d’onda maggiore della lunghezza d’onda della luce assorbita).

La luce che uso per illuminare deve arrivare al campione per eccitare le molecole e poi queste diventano fluorescenti e io vedo la fluorescenza (e non la luce che eccita le molecole).

5. Microscopia confocale in fluorescenza

Usa la fluorescenza e permette di visualizzare l’immagine generata dalla radiazione fluorescente emessa da un campione biologico.

Per mettere in evidenza particolari strutture o molecole si ricorre a:

• Molecole fluorescenti.
• Proteine fluorescenti emesse dalla cellula stessa.

Questo tipo di microscopia permette di effettuare studi in tessuti vitali ed intatti.

6. Microscopio confocale a scansione laser

Percorso ottico del microscopio confocale (presenti più canali per la separazione delle radiazioni luminose di emissione diverse):

• Sorgente laser di eccitazione (deve poter concentrare in una zona puntiforme una certa intensità luminosa).
• Specchio dicroico principale (riflette e trasmette).
• Obiettivo (focalizza la radiazione in un intenso spot).
• Specchi (per la scansione bidimensionale).
• Filtri di emissione (per la selezione delle radiazioni).
• Pinhole —> diaframma che agisce da filtro spaziale, riduce i segnali di background —> impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori gioco di raggiungere il detector.
• Rivelatore.

Acquisizione delle immagini:

• Sezioni ottiche estremamente sottili (0,5-1,5 μm).
• Ricostruzioni tridimensionali del campione.
• Immagini tridimensionali raccolte in funzione del tempo.

Sonde e proteine fluorescenti —> permettono di marcare specifiche molecole o macromolecole, più in particolare:

• Mettere in evidenza specifici compartimenti, organelli o strutture cellulari.
• Monitorare parametri cellulari.
• Seguire la produzione di metaboliti.

Green fluorescent protein (GFP) —> proteina naturalmente fluorescente che forma un fluoroforo (fluorescenza data da un gene specifico sul GFP).

Fluoresceina —> è una sonda fluorescente, quindi fa diventare fluorescente qualcosa che non lo è.

Tra i derivati della fluoresceina c’è la CFDA (carbossifluoresceina diacetato).

Microscopia elettronica

Microscopio elettronico a trasmissione

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) —> usato un fascio di elettroni.

La sorgente è un catodo che fa un fascio di elettroni che viene condensato grazie a delle lenti che sono dei magneti che focalizzano il fascio di elettroni sul campione che viene attraversato da esso, poi il fascio viene di nuovo focalizzato da dei magneti su una lastra che mi permette di osservare l’immagine.

Maggiore è la massa degli atomi maggiore è la dispersione —> vengono messi dei metalli pesanti che aumentano l’assorbimento dei fasci di elettroni (aumentano il contrasto).

Osservazioni TEM —> sono in bianco e nero e bidimensionali.

Microscopio elettronico a scansione

Microscopio elettronico a scansione (SEM) —> produce immagini tridimensionali della superficie di un campione e utilizza elettroni dispersi o riemessi dalla superficie del campione.

Campione biologico —> di per sé non è in grado di riflettere gli elettroni, quindi è generalmente rivestito con uno strato sottile di metallo pesante quale oro per rifletterli.

I campioni di microscopia elettronica sono sempre fissati (morti).

Il sistema di tessuti vegetali

Cellula vegetale si distingue dall’animale per 3 principali caratteristiche:

• Presenza di cloroplasti (centrali elettriche della pianta —> trasformano l’energia elettrica per sintetizzare zuccheri da CO²).
• Presenza di vacuolo (cisterna delimitata da membrana che funge da magazzino —> lì la cellula butta quello che non le serve, ciò che è tossico e quello che serve alla cellula per uno scopo preciso, es. raccolta di soluti porta ad osmosi).
• Presenza di una parete cellulare (determina forte rigidità piante) —> fatta di 3 componenti:

1. Parete primaria —> è fatta principalmente di cellulosa ed emicellulosa.
2. Parete secondaria —> fatta di lignina (dà ispessimento).
3. Lamella mediana —> è un gel di pectina che tiene unite le diverse cellule.

Espansione cellulare —> guidata da aumento di pressione all’interno del vacuolo.

Tutte le piante attuano processi molto simili e sono basate sullo stesso schema architettonico —> ciascun elemento strutturale riflette un processo fondamentale delle piante:

• Sono i raccoglitori finali della luce solare (per produrre ATP, NADPH e zuccheri).
• Sono immobili, crescono per tutta la loro vita alla ricerca di risorse essenziali (luce, acqua, elementi minerali).
• Rafforzate strutturalmente per crescere contro gravità verso la luce.
• Devono evitare la disidratazione.
• Possiedono un meccanismo di trasporto dell’acqua verso il germoglio e dei fotosintati verso la radice.

Prime forme di vita del pianeta sono stati organismi fotosintetici —> hanno determinato sviluppo O² (21% O² atmosferico).

Tra le cellule vegetali c’è comunicazione nonostante una parete cellulare molto spessa e resistente —> presentano plasmodesmi (aperture controllate che sono in grado di chiudersi grazie alle proprie componenti proteiche interne).

Lamella mediana —> cellule vegetali crescono per espansione, e sono cementate l’una all’altra per mezzo della lamella mediana.

Accrescimento vegetali —> è concentrato in regioni di attiva divisione cellulare definite meristemi (tessuti tipici delle piante che contengono cellule allo stato embrionale —> piante hanno una crescita indefinita, sono in grado di crescere all’infinito a differenza degli uomini).

Meristemi sono localizzati all’estremità del fusto e della radice (meristemi apicali) e a livello delle gemme ascellari —> responsabili dell’accrescimento primario (allungamento apici).

Altri meristemi —> quelli laterali, come il cambio cribro-vascolare che si trova nel fusto e nella radice (meristema responsabile dell’accrescimento secondario —> crescita del fusto in spessore).

Cellule radice —> non fanno fotosintesi (quindi no cloroplasti) e devono ricevere nutrimenti dalle cellule delle foglie.

3 tessuti fondamentali che formano organi della pianta:

1. Tessuto dermico —> è l’insieme di cellule appiattite e poligonali sulla superficie di tutte le piante che la separano dall’esterno.

Cuticola —> è lo strato idrofobico fatto di cere, cutina e suberina che si trova esclusivamente sulla parte esterna delle cellule dell’epidermide:

• Cutina &