Appunti primo semestre di Farmacologia generale

Farmacologia generale: Fornasari

Recettori

I farmaci sono molecole in grado di modificare l’attività biologica di altre molecole che sono dette bersagli molecolari. Sono inoltre da considerarsi ligandi a tutti gli effetti in quanto sono semplicemente l’analogo di ligandi endogeni di cui simulano l’azione, non creano infatti nessuna nuova funzione ma si limitano a mimare l’azione del ligando endogeno.

Bersagli molecolari

Nel 2001 viene pubblicato il primo draft del genoma umano. Ci si è chiesti se conoscendo tutti i geni del genoma umano alcuni geni potessero diventare bersaglio molecolare dei farmaci. Con lo sviluppo del progetto genoma umano si sono acquisite informazioni tali per cui sarebbero stati disponibili nuovi bersagli molecolari. I bersagli erano circa 500 (bersagli codificati dal genoma umano, non per esempio farmaci antiinfettivi), ora sono pochi di più (non c’è stato lo sviluppo aspettato → i big data danno informazioni importanti iniziali ma bisogna validare il bersaglio molecolare e sviluppare i farmaci).

I bersagli molecolari sono:

• 50%: recettori di membrana → patologia = problema di comunicazione fra cellule
• 30%: enzimi → tanti farmaci per inibire enzimi, pochi farmaci che attivano enzimi (es. riociguat → attiva guanilato ciclasi solubile, ritirato però dal mercato per effetti avversi). Inibitori sono FANS, aspirina, statine, inibitori acetilcolinesterasi, inibitori pompa protonica
• 11%: ormoni e fattori (11%) → farmaci di rimpiazzo: es. insulina che manca e ormone della crescita (GH)
• 5%: canali ionici → anestetici locali come lidocaina sono bloccanti di canali Na voltaggio dipendenti, ci sono bloccanti di canali Ca per ipertensione
• 2%: recettori nucleari → recettori per ormoni steroidei (es. corticosteroidi sono farmaci antiinfiammatori)
• 2%: DNA → farmaci chemioterapici che formano sul DNA addotti che impediscono al DNA di replicarsi
• 7%: bersaglio molecolare sconosciuto → molecola che ha attività ma non si sa esattamente come funzioni: es. dimetilfumarato usato per il trattamento della sclerosi multipla, usato inizialmente per la psoriasi, si studia poi come funziona e si vede che sono interessati meccanismi coinvolti nella sclerosi multipla
• Pompe e trasportatori: importanti in psichiatria

I farmaci agiscono perché interagiscono con i loro bersagli molecolari; ci sono pochi farmaci che non hanno bersaglio ma agiscono sull’ambiente → es. bicarbonato (alcalinizza), diuretici osmotici, disinfettanti di superficie. L’interazione tra farmaco e bersaglio molecolare è dettata da leggi chimiche e fisiche → legge di attrazione delle masse.

Omeopatia

Se faccio una diluizione del farmaco non ho interazione coi bersagli molecolari → NO omeopatia. Memoria dell’acqua: diluisco a tal punto da non avere molecole → funziona perché l’acqua ha memoria: subisce cambi di conformazione e ricorda il farmaco presente. Benveniste ha avuto finanziamenti per dimostrare la memoria dell’acqua → manda la ricerca a Nature e viene pubblicato, vengono rifatti gli esperimenti e non vengono con altri team, allora Benveniste rifà lui stesso gli esperimenti (sono presenti anche prestigiatori) → fa un errore di contaminazione. Il lavoro viene ritrattato.

Medico che progetta su riprogrammazione di cellule già differenziate → usa fibroblasti e li riprogramma a cellule staminali: mandano il lavoro a Cell che lo rifiuta, insistono e quindi vengono rifatti gli esperimenti in laboratori scelti da Cell → accettano e dopo un anno viene dimostrato che è possibile riprogrammare le cellule → vince il Nobel.

Recettori di membrana

I recettori di membrana legano sostanze idrofiliche; i recettori intracellulari (nucleo o citosol) legano sostanze lipofiliche. I recettori sono proteine allosteriche → in seguito al legame con il ligando modificano la loro conformazione.

L’albumina non può essere un bersaglio molecolare perché non ha un sistema di trasduzione del segnale → l’albumina è un carrier del farmaco ma non è un recettore. Ci sono migliaia di recettori di membrana:

• Recettore canale: canali ionici che si aprono in risposta al legame col ligando. Un farmaco funziona perché mima o antagonizza l'effetto di un ligando endogeno. Il ligando endogeno si lega al canale e consente il passaggio di ioni secondo gradiente elettrochimico. L’attivazione avviene in millisecondi, si trovano dove c’è bisogno di comunicazione intercellulare rapidissima → es. placca neuromuscolare (Ach) e SNC (glutammato). Nel SNC c’è un neurotrasmettitore inibitorio che è GABA → agisce tramite recettori del Cl → Cl iperpolarizza e spegne comunicazione. Sono strutture multimeriche distribuite a formare il poro
• Recettori associati a G proteine: la risposta si attua in secondi → funzioni biologiche gestite in secondi → regolazione del battito cardiaco in secondi. Hanno una struttura caratteristica, hanno 7 domini transmembrana. Ci sono G proteine eterotrimeriche e monomeriche → legano G nucleotidi; possono essere G stimolatorie o inibitorie
• Recettori con attività enzimatica intrinseca: sono recettori con attività tirosin chinasica (recettori per fattori di crescita e citochine) e guanosil chinasica (fattore natriuretico atriale). Impiegano minuti → sono recettori coinvolti nei processi di infiammazione, replicazione cellulare, movimento cellulare

I recettori di membrana trasducono il segnale generando modificazioni biochimiche e biofisiche della cellula. I recettori intracellulari impiegano ore prima di dare la risposta → sono recettori di trascrizione → modulano l'espressione genica: riprogrammano la cellula.

Recettori canale

Il recettore canale per definizione è il recettore nicotinico colinergico: 5 diverse subunità assemblate per fare un canale ionico permeabile a N, Cl e K. Alcuni neurotrasmettitori come l’Ach legano due tipi diversi di recettori: recettori canali (nicotinici) e associati a proteine G (muscarinici). Ci sono canali ionici voltaggio dipendenti che hanno struttura diversa, i canali ionici si dividono in base alla modalità di attivazione.

Ci sono:

• Recettori permeabili a cationi:
  • Recettore colinergico nicotinico muscolare e neuronale (i canali colinergici muscarinici sono associati a G pp)
  • Recettore glutammatergico ionotropo (se metabotropo è associato a G pp)
  • Recettore serotoninergico (sono 7, solo uno è ionotropo, gli altri sono metabotropici)
  • Recettore purinergico → ATP funziona anche come neurotrasmettitore
  • Recettori aperti da nucleotidi ciclici
• Recettori permeabili ad anioni (solo due): → stricnina blocca questi recettori
  • Recettore GABAnergico: si dividono in ionotropici (canali per il cloro; GABA A) e metabotropici (GABA B). Se il cloro entra all’interno della cellula, il potenziale trans membranale diventa più negativo perché la cellula si iperpolarizza. GABA è un recettore canale in cui passa il cloro → bersaglio di benzodiazepine e barbiturici. Le benzodiazepine sono modificatori allosterici del canale → fanno rimanere aperto il canale, usate per disturbi d’ansia, ipnogeni, epilessia
  • Recettore glicinergico: la stricnina agisce su questi canali

I recettori sono fatti da 4-5 subunità → ogni subunità attraversa la membrana plasmatica 4 volte la porzione intermembrana (M2) formano il canale, il resto del recettore serve per la modulazione e per legare il ligando.

Il recettore normalmente è in uno stato di riposo ed è chiuso, in seguito all'interazione con il ligando il recettore si apre. Ci sono diversi meccanismi di spegnimento → nel caso dell’Ach abbiamo acetilcolina esterasi, l’apertura del recettore dura millisecondi e poi entra in uno stato inattivato. Se la persistenza del ligando è prolungata nel tempo o c’è tanto ligando, il recettore entra in uno stato desensitizzato → spegne la transizione del segnale (sistema protettivo). Se passa un po’ di tempo il recettore da uno stato inattivo a uno stato attivo.

Recettori associati a proteine G

Ha 7 domini transmembrana. Su 20 mila geni codificanti abbiamo 1.200 geni per recettori associati a proteine G → utilizzati in molteplici vie. Ci sono migliaia di ligandi per questi recettori.

I 7 domini transmembrana sono omologhi tra loro, la porzione extracellulare serve per il legame con diversi ligandi → i recettori possono legare ligandi diversi. La porzione intracellulare è la regione di contatto con la G protein, è regolatoria (fosforilabile + legame con arrestina). I recettori formano βdimeri e lavorano come tali → omodimeri e eterodimeri.

I recettori hanno diversi stati conformazionali → l’allosteria delle pp è alla base della vita: pp rispondono a stimoli esterni. L’allosteria è stata scoperta da Jaques e Monod.

Si parte da uno stato di riposo, il legame con il ligando fa attivare il recettore → cambia lo stato conformazionale del recettore e lo fissa nella forma attiva. Il recettore diventa competente per interagire con le proteine G eterotrimeriche (G: lega G nucleotidi; eterotrimerica: tre subunità). Allo stato di riposo la subunità è legata a GDP, l’interazione con il recettore fa cambiare la conformazione della subunità che lascia GDP e prende GTP → cambia αconformazione e perde affinità per β e γ → incontra gli effettori che si attivano e svolgono il loro ruolo.

Gli effettori possono essere:

• Enzimi come adenilato ciclasi, fosfolipasi C, fosfolipasi A2
• Canali ionici

Tutti gli effettori hanno una durata limitata → lo spegnimento è dovuto al fatto che la subunità ha attività GTPasica intrinseca → si ritrova con GDP e riacquisisce affinità per β e γ e tutto si spegne.

Ci sono diversi tipi di G protein, descritte sulla base della subunità presente:

• αs: proteina G stimolatoria sull’adenilato ciclasi
• αi: proteina G inibitoria sull’adenilato ciclasi ma ci sono alcune sue isoforme che attivano la fosfolipasi A2, enzima importante nella cascata dell’acido arachidonico
• αq: proteina G che attiva la fosfolipasi C connessa alla cascata dei fosfoinositidi di membrana
• αo (oppioidi): proteina G accoppiata alla chiusura dei canali per calcio e all’apertura di quelli per il potassio

Se i meccanismi di spegnimento si inceppano è un problema, la tossina colerica legandosi alla subunità la ADP ribosila → si perde attività GTPasica della subunità, questo spiega la sintomatologia intestinale dovuta alla perdita di liquidi, a un pz con colera bisogna somministrare grandi quantità di liquidi (normalmente non si può perché il cuore non reggerebbe).

L'adenilato ciclasi è un effettore che dopo essere attivato ciclizza ATP a cAMP → aumento concentrazione di cAMP.

Es. Il recettore β2 adrenergico è abbondantemente presente sia nella muscolatura liscia basale che nella muscolatura liscia bronchiale dove media l’azione dei farmaci broncodilatatori. Nella muscolatura bronchiale c’è una triplice innervazione/controllo, il controllo da parte dell’ortosimpatico è dovuto all’adrenalina circolante. Quando corriamo e abbiamo bisogno di maggiore ossigenizzazione nei tessuti, abbiamo bisogno di broncodilatare le vie respiratorie → l’adrenalina, liberata dal surrene, broncodilata. Farmacologicamente, grazie ad un farmaco agonista chiamato salbutamolo mimiamo l’azione del ligando endogeno e utilizziamo questo meccanismo al fine di forzare così l’apertura delle vie respiratorie che sono contratte in un paziente asmatico. Se utilizzassimo un farmaco come il propranololo, che è un beta bloccante, andremo ad inibire l’adrenalina circolante.

La produzione di cAMP causa attivazione di PKA → è una chinasi normalmente silente, quando aumenta cAMP si attiva: è un tetramero con due subunità regolatorie e due catalitiche, cAMP si lega alle regolatorie, cambiano conformazione e perdono affinità per le catalitiche → le catalitiche sono libere di andare a fosforilare i vari substrati.

PKA può fosforilare molteplici substrati, la subunità catalitica può entrare nel nucleo → le pp vanno in determinati compartimenti perché presentano uno specifico segnale e per il nucleo serve NLS. La subunità catalitica di PKA ha NLS → entra nel nucleo e fosforila CREB che si lega a CRE (il gene risponde ad aumenti di concentrazione di cAMP) → aumento della trascrizione di determinati geni. Molto attivo a livello cardiaco → eccessiva attivazione di CRE porta a rimodellamento → si usano ora beta bloccanti.

L’adenilato ciclasi ha un meccanismo di controllo negativo → αi va ad inibire l’adenilato ciclasi.

In una cellula del nodo seno atriale (attività di pacemaker) l’attività cardiaca è sotto controllo di noradrenalina e Ach → abbiamo recettori β2 adrenergici che attivano adenilato ciclasi e recettori muscarinici che inibiscono adenilato ciclasi.

L’altra regolazione importante di cAMP è a livello delle fosfodiesterasi, ci sono 12 isoforme diverse di fosfodiesterasi con posizione diversa all’interno della cellula. Se voglio aumentare l'attività della PKA posso agire sul recettore β2 adrenergico oppure posso andare ad inibire le fosfodiesterasi → importante bersaglio terapeutico di vari farmaci.

La Gq interagisce con la fosfolipasi C (β) che interferisce in PIP2 che è un fosfolipide di membrana → è scisso in due messaggeri: diacilglicerolo e IP3. DAG rimane in membrana e attiva proteine chinasi C (PKC) che fosforila, mentre IP3 è solubile e si muove nel citoplasma. C’è un’altra via che può attivare la PKC → ha due pathway di attivazione. IP3 ha un recettore sul reticolo → canale ionico che si apre. Il reticolo contiene Ca che è portato nel reticolo da Ca ATPasi (vanno secondo gradiente) e non precipita perché è legato a calreticulina calsequestrina (bassa affinità). Quando Ca aumenta in una cellula contrattile questa si contrae, se aumenta la cellula secretoria la cellula fa secrezione tranne nelle cellule dell’apparato iuxtaglomerulare. Ca è un secondo messaggero e attiva una classe di chinasi → chinasi calcio calmodulina dipendenti, la calmodulina lega Ca e poi lega la chinasi attivandola. Le chinasi fosforilano pp che hanno sequenze consensus con ser/thr/ tre → la pp deve avere questa sequenza per avere la fosforilazione.

Una pp fosforilata può essere defosforilata da fosfatasi, spesso la chinasi ha tra i suoi substrati la fosfatasi stessa → si spegne da sola.

Ras è un protooncogene e una G protein → Ras non lega da solo GTP e non lo tiene legato → ha bisogno di SOS che è una GEF (guanine exchange factor), GAP (GTPase associated protein) invece leva GTP. GEF e GAP sono importanti regolatori, non funzionano correttamente in alcune patologie.

Le subunità β e γ non sono solo di supporto, sono importanti nel signaling → possono attivare canali K → iperpolarizzano cellula; attivano GRK che reclutano chinasi che servono a spegnere il recettore fosforilandolo.

I recettori di GABA si dividono in metabotropici e ionotropici. GABA A → ionotropici permeabile a Cl, attività inibitorie su SN. GABA B → metabotropici accoppiato a G proteine; la prima subunità da sola non funzionava, si trova un'altra subunità che chiamano GABA B2 che non funziona da sola; mettendoli insieme nella stessa cellula funziono → serve eterodimero.

Recettori tirosin chinasici

Sono recettori con attività enzimatica intrinseca, sono implicati:

• In diverse funzioni cellulari: divisione, differenziamento e motilità
• Nell'infiammazione
• Sono detti anche recettori per fattori di crescita

Sono strutturalmente dei bastoncelli infilati nelle membrana plasmatica con:

• Sito extracellulare per ligando
• Dominio transmembrana
• Porzione citoplasmatica con funzione tirosin chinasica

Sono presenti come monomeri e la dimerizzazione è necessaria al loro funzionamento, il ligando determina la dimerizzazione del recettore con conseguente transfosforilazione che attiva completamente il recettore. Il recettore è poi in grado di fosforilare substrati nella cellula.

Le tirosine fosforilate sul recettore possono servire per il riconoscimento da parte di altre pp che devono avere domini SH2 o SH3 → sequenze ricche di prolina che riconoscono tirosine fosforilate. Segue poi una cascata di modificazioni conformazionali che fanno partire la trasduzione del segnale.

Il recettore per GF dimerizza, transfoforila, richiama Grb2 che è una pp adattatrice e serve per fare da ponte e attivare SOS che attiva Ras e attiva la cascata delle map chinasi → la terza va nel nucleo e regola l’espressione genica.

Le vie maggiormente caratterizzate sono quelle di crescita, proliferazione e differenziamento e quella dell’infiammazione e morte cellulare. Sono meccanismi lenti → servono minuti per l’attivazione.

I residui tirosinici sul recettore possono essere riconosciuti da qualsiasi pp che abbia domini SH2 e SH3, la fosfolipasi Cγ riconosce la tyr fosforilata sul recettore e si attiva. La fosfolipasi Cγ è espressa nei linfociti.

I recettori con attività tirosin chinasica sono importanti in quanto coinvolti in proliferazione (deregolazione con conseguente tumore); sopravvivenza (no apoptosi → tumore); movimento (metastasi). Sono state costruite molecole che possono inibire questi recettori: Ab monoclonali e piccoli inibitori (inibiscono l’attività tirosin chinasica). Imatinib è il farmaco che ha cambiato la storia della leucemia mieloide cronica.

Recettori intracellulari

I recettori intracellulari altro non sono che dei fattori di trascrizione in grado di regolare positivamente o negativamente l'espressione dei geni target.