Appunti lezione integrati con studio del libro Biochimica - parte 2

Metabolismo del glicogeno

10% Il glicogeno epatico in peso. Serve come riserva di glucosio per gli altri tessuti quando non è disponibile glucosio alimentare, nel periodo tra i pasti e nel digiuno. Il glicogeno epatico si esaurisce in 12-24 ore.

Il glicogeno è l’omopolisaccaride di riserva per eccellenza negli animali. Il glicogeno può essere introdotto anche con la dieta, ma la degradazione del glicogeno alimentare è diversa da quella del glicogeno di riserva ed avviene mediante reazioni di idrolisi.

Struttura del glicogeno

La molecola del glicogeno non è unica ma il glicogeno epatico è accumulato sotto forma di molteplici molecole di glicogeno che si assemblano in unità di 20-40 per formare i cosiddetti granuli beta. I gruppi di 20-40 granuli beta, che di fatto costituiscono una vescicola maggiore, un granulo maggiore, costituiscono il granulo alfa.

È un polimero, costituita da:

• Sequenze lineari di glucosio legato mediante legame α-1,4-glicosidico.
• Ogni 10 residui si creano ramificazioni che prevedono l’inserimento di un legame alfa 1-6 glicosidico.

Quindi il fegato e il muscolo posseggono una grande quantità di vacuoli, granuli alfa, all’interno dei quali sono presenti una quantità variabile di molecole di glicogeno. La quantità è variabile perché, essendo prevalentemente una molecola metabolicamente dinamica, non esistono delle condizioni uniformi.

La molecola del glicogeno, essendo altamente ramificata, presenta un elevatissimo numero di estremità 4 OH non riducenti.

La particella di glicogeno elementare generalmente è caratterizzata da:

• 8-12 ramificazioni.
• 55.000 monomeri di glucosio.
• 2000 estremità non riducenti.
• Il peso molecolare di diversi milioni di Dalton.

È presente nel citosol. Nei vertebrati il glicogeno si trova prevalentemente nel fegato e nel muscolo scheletrico: il glicogeno muscolare 1-2% in peso. Rappresenta una fonte di energia rapidamente utilizzabile che si esaurisce in meno di 1 ora durante uno sforzo muscolare intenso.

Di conseguenza la quantità di glucosio rapportata alla propria massa molecolare all’interno di un volume uniforme di organo, fegato, è calcolata pari allo 0,01 micro molare.

Il fatto che il glucosio venga polimerizzato in strutture così complesse ha un vantaggio nell’abbattimento dei problemi osmotici: se noi misurassimo la concentrazione di una tale quantità di glucosio, però considerato come struttura monomerica all’interno dell’epatocita, avremo un valore in concentrazione enorme, pari circa a 0,4 M.

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Poiché il glucosio è fortemente idrofilo, questa elevata concentrazione di glucosio richiamerebbe una quantità d’acqua talmente elevata che porterebbe alla lisi della cellula. Quindi il significato del glicogeno è fondato sulla risoluzione di problemi osmolari che invece il glucosio comporterebbe.

La molecola del glicogeno deve essere rapidamente metabolizzata:

• Glicogenolisi: demolizione del glicogeno a glucosio 1 fosfato.
• Glicogenosintesi: sintesi del glicogeno a partire dal glucosio.

La degradazione si svolge in 3 tappe:

• Rottura dei legami α-1,4 glicosidici con rilascio di glucosio 1-fosfato.
• Conversione del glucosio 1-fosfato in glucosio 6-fosfato.
• Rottura dei legami α-1,6 glicosidici.

Anche la sintesi del glicogeno si svolge in 3 tappe:

• Formazione di una forma attivata di glucosio, UDP-glucosio.
• Addizione delle unità di UDP-glucosio alle estremità non riducenti presenti sulla molecola di glicogeno mediante formazione di legami α-1,4 glicosidici.
• Formazione dei legami α-1,6 glicosidici per creare le ramificazioni.

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Degradazione del glicogeno - glicogenolisi

La degradazione del glicogeno, glicogenolisi, richiede tre enzimi:

• Glicogeno fosforilasi GF.
• Enzima deramificante, o di deramificazione, ED.
• Fosfoglucomutasi FGM.

Reazione 1 - glicogeno fosforilasi

La glicogeno fosforilasi idrolizza le molecole di glucosio a partire dall’estremità non riducente del glicogeno. Questo enzima rimuove monosaccaride dopo monosaccaride idrolizzando legami alfa 1-4 glicosidici con l’intervento del fosfato inorganico, Pi. Il cofattore della glicogeno fosforilasi è il piridossalfosfato, un derivato della piridossina, vitamina B6, che con il suo gruppo fosforico promuove l’attacco del legame glicosidico da parte del gruppo fosfato. Producendo una molecola di glicogeno accorciata di un residuo di glucosio e glucosio 1-fosfato.

Si tratta di una reazione di fosforoidrolisi, energeticamente vantaggiosa perché parte dell’energia del legame glicosidico viene conservata nella molecola di glucosio 1-fosfato e non si deve consumare altro ATP per attivare il glucosio. Questo la distingue da una normale idrolisi.

Come agisce l’enzima?

Si tratta di un dimero: proteina costituita da due subunità identiche di circa 97 kD ciascuno quindi la loro dimerizzazione produce una struttura complessa di circa 194 kD.

Le due subunità sono appunto identiche e presentano un sito attivo nel quale viene posizionato l’estremo non riducente di una catena di glicogeno.

Questo sito attivo si trova in una zona molto interna all’enzima e comunica con l’esterno attraverso un canale di circa 30 Amstrong. Ciò significa che l’intera molecola del glicogeno accoglie al proprio interno una sequenza piuttosto lunga della catena del glicogeno, una sequenza composta da almeno quattro monomeri di glucosio, il cui ultimo monomero, il quarto, entra perfettamente in contatto con gli amminoacidi del sito attivo. L’ultimo monomero, il quarto, è proprio quello che cade all’interno del sito catalitico e sarà quello soggetto all’idrolisi del proprio legame glicosidico.

Il sito attivo dell’enzima è particolare perché su questo è legato un cofattore che è il piridossal fosfato. Questo nella realtà è il coenzima coinvolto nel metabolismo degli amminoacidi. La sua presenza nella fosforilasi è particolarmente originale perché normalmente è utilizzato nei meccanismi di transaminazione, quindi dobbiamo capire il motivo chimico per cui questo enzima contiene questo cofattore del tutto originale per il tipo di reazione che stiamo andando a descrivere, cioè una reazione di idrolisi.

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Il motivo è che il piridossalfosfato, legato sul sito attivo dell’enzima, lega con legame a idrogeno una molecola di ortofosfato, quindi un fosfato inorganico. Il legame con il fosfato inorganico, come vedremo, è molto importante in questa tipologia di legame, perché il glucosio che deriva dall’idrolisi del legame alfa glicosidico del glicogeno nella realtà non si libera come glucosio libero, ma come glucosio-1-fosfato. Infatti, si dice che la fosforilasi non opera l’idrolisi del legame glicosidico ma opera la sua fosforoidrolisi, cioè catalizza la reazione di scissione grazie all’intervento di un ortofosfato inorganico. Questo ortofosfato inorganico, che sarà protagonista della reazione di idrolisi, è inizialmente organicato all’interno del sito attivo grazie ad un legame ad idrogeno con il piridossalfosfato.

Quindi l’azione del piridossalfosfato è:

1. Inizialmente proprio di legare al sito attivo il fosfato.
2. Successivamente quello di cedere a questo fosfato un protone. Il protone ceduto all’ortofosfato viene successivamente ceduto al carbonio anomerico dell’ultima unità di glucosio, che vi ricordo su quel carbonio anomerico grava il legame glicodisidico. Il piridossalfosfato, quest’ultimo che tiene legato il fosfato inorganico, costituisce il tunnel attraverso cui questo protone ceduto dal piridossalfosfato arriva al carbonio anomerico dell’ultima unità di glucosio, costituendo su questo carbonio una carica netta positiva che lo trasforma in carbocatione. Poiché naturalmente questo carbonio ha un ponte ossigeno, perché sappiamo che un carbonio anomerico emiacetalico, allora la struttura complessiva di questa molecola di glucosio è quella di uno ione ossonio.
3. La carica netta di questa struttura consentirà nella reazione successiva l’attacco nucleofilo da parte dell’ossigeno acido del fosfato che potrà quindi in questo modo liberare l’unità della struttura del glicogeno privo di unità del glucosio e quindi liberare anche il glucosio-1-fosfato risultato da questo attacco nucleofilo.

L’estremo della catena glucidica del glicogeno, al quale è stato sottratto una molecola di glucosio, la catena n-1, non abbandona l’enzima, resta inserito all’interno di esso e l’enzima avanza di un’unità monomerica per poter operare la stessa reazione di idrolisi nel monomero successivo.

Quindi, la glicogeno fosforilasi, grazie a questa fessura profonda attraverso cui viene inserita la molecola terminale del glicogeno, si assicura una stabilità su questa molecola e di conseguenza avanzando su queste estremità momento per momento, da una parte consente il rilascio rapido di glucosio fosforilato, dall’altra garantisce che questa reazione rapidamente procede in avanti.

Questo è molto importante perché la risposta metabolica che il glicogeno deve dare in assenza di ossigeno nel muscolo o in assenza di glucosio circolante nel fegato deve essere pronta e rapida.

Inoltre, questa reazione rilascia nel mezzo un glucosio dal punto di vista energetico molto importante, perché è esso stesso fosforilato. Di conseguenza, in assenza di ATP, noi abbiamo la possibilità di utilizzare questa molecola altamente e biologicamente importante.

Infine non solo questa molecola è altamente importante perché già predisposta energeticamente alla sua trasformazione ma è anche rilasciata in una forma che non consente alla molecola di lasciare la cellula, dunque questa reazione ha sia un’importanza energetica che strategica perché impedisce alla molecola che rilascia di prendere strade diverse da quelle che invece devono essere controllate a livello cellulare.

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A distanza di circa 4 molecole di glucosio dal punto di ramificazione, la glicogeno fosforilasi si deve arrestare per 3 motivi:

1. Ingombro sterico.
2. Per il fatto che sul sito catalitico della GF, la lunghezza di questo piccolo frammento non è sufficiente, troppo piccolo, per portare l’ultima molecola del glucosio all’interno del sito.
3. La glicogeno fosforilasi non è in grado di scindere il legame α-1,6 glicosidico.

La sua attività deve quindi lasciare posto ad un’altra attività enzimatica che risolva questi problemi.

Reazione 2 - enzima deramificante

Quattro residui prima della ramificazione entra in azione l’enzima deramificante che possiede un’attività transferasica e un’attività α-1,6 glucosidasica: l’attività transferasica sposta tre residui di glucosio dalla catena della ramificazione ad un’altra catena, lasciando un solo residuo di glucosio legato con legame α-1,6 glicosidico; l’attività α-1,6 glucosidasica catalizza l’idrolisi del legame α-1,6 glicosidico rilasciando una molecola di glucosio.

Come agisce l’enzima?

Si tratta di un enzima bifunzionale:

• Inizialmente una subunità di questo enzima che ha un’attività alfa 1-4 trans-glicosidasi. Significa che inizialmente questo enzima trasferisce le unità di glucosio tenute insieme, con legame con legami alfa 1-4, ad un’estremità riducente di una catena di glicogeno sufficientemente lunga. Sia essa la principale sia essa un’altra ramificazione comunque trasferisce su di essa questo gruppo costituito da tre monomeri di glucosio, lasciando quindi sulla struttura che stiamo demolendo soltanto l’ultima molecola di glucosio legato alla principale con legame alfa 1-6. Questa iniziale attività è una trans-glicosilazione di tipo alfa 1-4.
• L’altra subunità di cui è composto l’enzima ha un’attività idrolitica sul legame alfa 1-6 e infatti si chiama proprio alfa 1-6 glicosilasi. Questa attività rompe il legame alfa 1-6 del punto di ramificazione compiendo davvero questa volta un’idrolisi con acqua. Quindi questa attività enzimatica non rilascia glucosio-1-fosfato ma rilascia glucosio libero.

Da questa panoramica di idrolisi di glicogeno possiamo dire che la fosforilasi della reazione precedente compie la fosforolisi del legame alfa 1-4 rilasciando glucosio 1 fosfato mentre l’enzima deramificante compie l’idrolisi del legame alfa 1-6 rilasciando glucosio libero.

Questa è un’importante eccezione rispetto a quella considerazione che avevamo fatto in anticipo e cioè che tutto il glucosio proveniente dal glicogeno di fatto resti di fatto intrappolato all’interno della cellula.

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Una piccola quota, che è appunto una quota derivante dall’azione dell’enzima deramificante, in forma libera nel fegato sarà già pronta per uscire e quindi per equilibrarsi con il plasma; anche nel muscolo questa quota di glucosio può uscire dalla cellula stessa, però ricordiamo che la glicogenolisi avviene quando in circolo non è presente insulina.

Poiché il muscolo ha un glut4 dipendente da insulina allora il glucosio, sotto forma di glucosio libero, di fatto resta comunque all’interno della cellula e va immediatamente sottoposta a processo di fosforilazione per effetto dell’esochinasi.

Naturalmente dal punto di vista cinetico la velocità delle reazioni 1 e 2 è diversa perché l’enzima deramificante a causa di questa azione bivalente prima di trasferimento della catena dei tre monomeri di glucosio e dopo della reazione di idrolisi del legame alfa 1-6 ha una velocità di gran lunga più bassa rispetto all’azione della fosforilasi che si muove come un piccolo squaletto in maniera continua idrolizzando rapidamente l’estremo di una ramificazione.

Reazione 3 - enzima fosfoglucomutasi

Il prodotto intermedio della reazione di glicogenolisi è il glucosio 1 fosfato. L’attività biologica degli enzimi è però sul glucosio-6-fosfato. È quindi necessario operare un trasferimento interno dell’ortofosfato dal carbonio anomerico 1 al gruppo alcolico terziario del carbonio 6 del glucosio.

Questo trasferimento di ortofosfato avviene ad opera di un enzima che si chiama fosfoglucomutasi che di fatto opera l’isomerizzazione del glucosio-1-fosfato, creato dall’azione della fosforilasi, in glucosio-6-fosfato, che sappiamo essere la forma metabolicamente attivata del glucosio all’interno della cellula.

Come agisce l’enzima?

Agisce similmente all’enzima che abbiamo già descritto nella glicolisi, la fosfogliceromutasi. Lo stesso meccanismo avverrà per la fosfoglucomutasi:

1. L’enzima è fosforilato a una serina che lega il glucosio-1-fosfato.
2. Cede il proprio fosfato sull’atomo di carbonio 6 ottenendo il prodotto intermedio glucosio-1,6-bifosfato.
3. Il fosfato questa volta proveniente dalla posizione 1 del glucosio viene trasferito nuovamente sulla serina dell’enzima.

In questo modo finalmente dall’idrolisi del glicogeno abbiamo glucosio-6-fosfato. Di conseguenza nella realtà abbiamo la produzione netta di 33 molecole di ATP, alla fine del ciclo di Krebs, e non 32 perché la molecola iniziale di ATP necessaria all’attivazione del glucosio come glucosio-6-fosfato l’abbiamo risparmiato perché di fatto avviene a carico del fosfato inorganico.

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Destino del glucosio 6 fosfato

Il destino di questo glucosio 6 fosfato cambia a seconda del tessuto:

Nel muscolo il glucosio 6-fosfato può entrare nella glicolisi perché qui il suo destino è attivato in condizioni di anaerobiosi quando è necessaria una rapida ossidazione del glucosio, tramite glicolisi.

In condizioni di riposo, in cui il muscolo può utilizzare il glicogeno come riserva di glucosio endogena, allora il glucosio nel muscolo potrà andare incontro non solo alla glicolisi ma anche alla successiva ossidazione completa di anidride carbonica e acqua nel ciclo di Krebs oppure risintetizzato come glicogeno.

Il fegato invece deve rilasciare il glucosio nel sangue per rifornire gli altri tessuti.

Per fare ciò è necessario un enzima idrolitico, la glucosio 6-fosfatasi, ovvero un enzima della gluconeogenesi, presente solo nel fegato e nel rene, che consente al glucosio di uscire dal fegato.

Questo enzima è una proteina integrale di membrana il cui sito attivo è rivolto verso il lume del ER. Dunque il glucosio-6-fosfato si è formato, come abbiamo visto, nel citosol e viene trasportato nel lume tramite un trasportatore specifico chiamato T1. Una volta nel ER viene idrolizzato dall’enzima glucosio 6 fosfatasi. Da questa idrolisi si ottengono due prodotti: fosfato inorganico e glucosio. Entrambi i prodotti vengono riimmessi nel citosol tramite altri due trasportatori specifici che sono rispettivamente T3 e T2. A questo punto il glucosio può abbandonare la cellula epatica per andare nel sangue e questo è possibile tramite un altro trasportatore che è localizzato sulla membrana plasmatica, il GLUT2.

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L’idrolisi del glicogeno è sufficientemente esoergonica, con ΔG negativo. Questo giustifica che la sintesi del glicogeno venga effettuata da enzimi differenti dalla degradazione in quanto la reazione di demolizione del glicogeno essendo esoergonica non può.

Nel fegato la glicogeno fosforilasi è inattivata dal glucosio. Dunque dopo un pasto ricco di carboidrati il glucosio è già presente nel sangue e non c’è necessità di degradare il glicogeno.