Appunti Biochimica 1 - Parte 2 - completi di immagini e schemi

Matilde Lazzari

Laurea in Biologia

Corso: Biochimica 1

A.a. 2024/25

Contenuti

• Cinetica enzimatica
• Modulazione dell’attività enzimatica
• Carboidrati
• Lipidi
• Membrane biologiche
• Trasportatori di membrana

Cinetica enzimatica

• La cinetica enzimatica studia la velocità di una reazione chimica e in particolare le dinamiche che regolano come substrato ed enzima reagiscono.
• Lo studio della cinetica enzimatica è fondamentale per comprendere la regolazione delle reazioni biochimiche.
• La funzione degli enzimi non è solo quella di velocizzare le reazioni diminuendo l’energia di attivazione ma anche quella di operare in maniera controllata.
• Le numerose reazioni delle vie metaboliche devono essere regolate per farle funzionare in modo coerente ed efficiente ed evitare caos metabolico.

Nell’immagine: nel centro c’è il pathway della glicolisi.

Se non ci fosse un meccanismo di controllo generalizzato ci sarebbero reazioni casuali e inefficaci per il metabolismo cellulare. Ogni reazione è catalizzata da un enzima diverso. È quindi fondamentale che ogni enzima sia regolato in modo specifico per la reazione che deve catalizzare. Gli enzimi quindi interagiscono anche tra di loro.

Reazioni di primo ordine

La cinetica enzimatica studia l’effetto della concentrazione di un substrato sulla velocità di reazione: reazione di primo ordine.

La velocità della reazione dipende dalla concentrazione del substrato. Se ci si trova in condizioni in cui la concentrazione del substrato è piccola, si identifica una porzione di curva praticamente lineare, quindi la velocità della reazione è influenzata in maniera lineare dalla concentrazione del substrato.

Questa relazione è espressa da un’equazione:

V = k [S]
0

Con K = costante di velocità specifica per ciascun enzima.

• La velocità iniziale V di una reazione aumenta quasi linearmente all’aumento della concentrazione del substrato.
  0
• La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. In questo caso la reazione è definita di primo ordine.

Si può esprimere la cinetica enzimatica anche in relazione alla concentrazione del prodotto che si forma. Nel tempo la concentrazione di substrato diminuisce e aumenta quella del prodotto, finché non si raggiungerà un equilibrio che deriva dalla Keq.

Nelle reazioni di primo ordine, a parità di altre condizioni (quantità di enzima, condizioni pH, T, …), è la concentrazione di substrato che ha effetto sulla velocità della reazione:

• Più alta è la concentrazione di substrato, più alta è la velocità iniziale V (si misura prima che P si accumuli).
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• All’equilibrio la concentrazione netta di prodotto formato e substrato rimane costante e questo dipende dalla Keq della reazione.

• La velocità iniziale (V) della reazione aumenta quasi linearmente all’aumento della concentrazione di substrato (S).
  0
• La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. In questo caso la reazione è definita di primo ordine.
• La proporzionalità tra V (velocità) e S (substrato) progressivamente diminuisce e la velocità diventa indipendente dalla concentrazione di S. La reazione è definita di ordine zero.

Nella reazione di ordine zero viene persa la linearità tra substrato e velocità, fino al raggiungimento di una velocità massima.

Reazioni di secondo ordine

Nella maggior parte dei casi la cinetica enzimatica tratta reazioni di secondo ordine, nelle quali sono coinvolti più substrati.

A + B → P

V = k [A][B]

Misura: M s^-1 (moli al secondo)^-1

Per esempio nella formazione del Glucosio-6-fosfato.

La velocità dipende dalla concentrazione dei reagenti e dalla costante di velocità (k), specifica per ciascun enzima.

Modello di Michaelis-Menten

Il modello di Michaelis-Menten tratta l’effetto della concentrazione del substrato. Descrive la cinetica di reazione di moltissimi enzimi. L’equazione descrive un’iperbole rettangolare.

Km = costante di Michaelis-Menten. Corrisponde alla concentrazione di substrato alla quale viene raggiunta la velocità massima di reazione (Vmax/2). È caratteristica dell’enzima ed è indipendente dalla concentrazione di enzima.

• Se la concentrazione di substrato (S) è molto piccola rispetto a Km, si può eliminare S dalla reazione → quindi la velocità iniziale dipende solamente dalla velocità massima e dalla Km.
• Se la concentrazione di substrato è molto grande, si può non considerare la Km, quindi la velocità iniziale corrisponde alla Vmax. (Perché le due S si semplificano).
• Vmax e Km sono specifiche di ciascun enzima.
• Secondo questo modello, si forma un intermedio che è un complesso di enzima-substrato (ES) reversibile.

Premesse: ci si trova all’inizio della reazione quando ancora non si è prodotta una quantità consistente di P. La concentrazione di ES può essere ignorata. Ci si trova in uno stato stazionario, dove la velocità di formazione di ES corrisponde alla velocità della sua scissione.

• Questa equazione esprime la velocità di una reazione enzimatica e note la concentrazione del substrato S e Km e Vmax, permette di calcolare V.
  0
• La Vmax è la velocità massima di reazione, dove tutto l’enzima disponibile è legato al substrato. Dipende dalla concentrazione dell’enzima. Non dipende da concentrazione [S].
• La velocità si avvicina al valore massimo (Vmax) in modo asintotico.

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• La formazione del complesso ES rappresenta il primo equilibrio, regolata da K1, mentre la reazione inversa è regolata da K-1.
• Da ES, attraverso una reazione controllata da K2, si arriva a E + P.
• K-2 si può trascurare perché non c’è ancora prodotto.
• Ci si trova in uno stato stazionario: la velocità di formazione di ES è uguale alla velocità della sua scissione.

L’equazione tende asintoticamente alla Vmax, mentre per concentrazioni piccole di substrato la curva può essere approssimata ad una retta, con una relazione di proporzionalità (linearità): se il substrato aumenta, aumenta anche la velocità.

Mano a mano che aumenta la quantità di substrato, viene persa la linearità e si arriva a una Vmax, alla quale anche se si aumenta il substrato, la velocità non aumenta.

Nella parte bassa della curva, nella condizione di reazione di primo ordine, se S è molto più piccola di Km, si trascura nella formula.

Se invece S è molto più grande di Km, questa si può trascurare e le due S si semplificano. Reazione di ordine zero.

Se V equivale a metà della Vmax (V = 1/2 Vmax), Km = S.
0 0

Come ricavare l’equazione di Michaelis-Menten?

Teoria formulata nel 1913 da Michaelis e Menten, per spiegare l’azione degli enzimi sulla base delle curve sperimentali osservate. La teoria si basava sull’assunzione che l’enzima (E) e il suo substrato (S) si associano reversibilmente per formare un substrato ES.

Il prodotto P si forma in un passaggio successivo quando:

• K1 regola la formazione di ES
• K-1 regola la scissione di ES in E + S
• K2 regola la formazione di EP da ES
• K-2 si può trascurare (il prodotto è poco e non influisce)

Primo presupposto: in questa condizione iniziale, in cui non si è ancora sintetizzato molto prodotto, si trova la velocità iniziale:

V = k2 [ES]
0

La velocità complessiva di formazione di ES è data dalla velocità di formazione di ES - la velocità di scissione.

Possiamo ricavare la concentrazione di [ES]:

La concentrazione di enzima totale [E] è data dalla concentrazione di enzima libero [E] + la concentrazione di enzima associato al substrato [ES]. Quindi [ES] si ricava facendo concentrazione di enzima totale - enzima libero:
t

Definiamo velocità di formazione di [ES]:

Definiamo velocità di scissione di [ES]:

Secondo presupposto della teoria: ci si trova in uno stato stazionario, dove la velocità di formazione di ES coincide con la sua velocità di scissione. Vf = Vs.

Le due velocità vengono poste in una equazione di equilibrio stazionario:

Si ricava la costante di Michaelis-Menten Km:

Si risolve per la concentrazione [ES]:

Ultimo step:

Si presuppone che non si sia ancora formato molto prodotto, quindi:

V = k2[ES] → V /K2 = [ES]
0 0

Lo si sostituisce nella formula trovata:

La velocità massima Vmax viene raggiunta quando tutto l’enzima è saturato con il substrato, cioè [ES] = [Et] e si definisce Vmax = k2[Et].

Si trova l’equazione di Michaelis-Menten:

Faccio attenzione ai presupposti per trovare l’equazione: stato iniziale con poco prodotto e stato stazionario.

Nella tabella si vedono i valori di Km e il substrato di alcuni enzimi (ricordo anidrasi carbonica).

Nella maggior parte dei casi gli enzimi lavorano con quantità di substrato vicina alla loro Km.

Come si possono determinare i valori di Km e Vmax sperimentalmente?

• Km e Vmax possono essere determinati misurando la velocità di una reazione a diverse concentrazioni di substrato.
• Per calcolare Km e Vmax l’equazione di Michaelis-Menten può essere trasformata nell’equazione di una retta ricavando i reciproci di entrambi i membri:

y = m x + b

Da questa equazione si ottiene il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burke.

Usando l’equazione di Lineweaver-Burke si ottiene una linea retta che:

• Intercetta l’asse y in 1/Vmax.
• Intercetta l’asse x in -1/Km.
• La pendenza è Km/Vmax.

Con l’equazione di questa retta si possono calcolare sperimentalmente i reciproci di Vmax e Km.

Il grafico è utile anche per capire che tipo di inibizione possa influenzare la capacità di un enzima (es. l’inibitore che ha permesso a Pauling di formulare l’ipotesi dello stato di transizione: era una molecola che era simile allo stato di transizione del substrato e quindi era in competizione con questo).

Con gli inibitori non viene diminuita la Vmax dell’enzima, ma la Km, quindi la curva sarà più pendente (Km cito).

All’esame: stabilire sulla base della retta dei doppi reciproci, che tipo di inibizione si sta osservando.

Il concetto di Km a livello fisiologico

• Per molti enzimi, il Km corrisponde alla concentrazione di substrato in vivo, cioè alla concentrazione normalmente disponibile nel corpo.
• Per valori di substrati che si avvicinano alla Km gli enzimi possono esprimere una buona attività catalitica (1/2 Vmax) e sono allo stesso tempo sensibili alle variazioni di concentrazione del loro substrato.
• Per valori di substrato molto minori di Km, gli enzimi sono molto sensibili alla concentrazione di substrato, ma avranno un’attività catalitica minore (reazione di primo ordine).
• Per valori di substrato molto più grandi di Km, gli enzimi avranno un’attività catalitica elevata, ma saranno insensibili alle variazioni di concentrazione di substrato (reazione di ordine zero).

Implicazioni fisiologiche di Km: esempio della aldeide deidrogenasi e ipersensibilità all’alcool. L’aldeide deidrogenasi è un enzima che permette di smaltire l’acetaldeide.

Acetaldeide (si assume con vino e birra): arrossamento volto, tachicardia, sonnolenza.

Esistono due forme di acetaldeide deidrogenasi, una citologica (Km alta) e una mitocondriale (Km bassa). In quella citologica, devono essere raggiunte concentrazioni di substrato (acetaldeide) più elevate affinché l’enzima lavori alla metà della sua velocità massima, quindi è meno efficiente.

Negli individui sensibili all’alcool, mutazioni nell’aldeide deidrogenasi mitocondriale fanno sì che il corpo possa usare solo la forma citologica, la quale ha una Km molto più elevata → questo causa un aumento incontrollato dell’acetaldeide che non viene smaltita in maniera efficace e passa nel sangue dove causa gli effetti sopra descritti, un’ipersensibilità all’alcool.

Modulazione dell’attività enzimatica

• pH
• Temperatura
• Molecole che interagiscono in modo specifico con l’enzima (inibitori).

Attività degli enzimi in funzione del pH

Ad esempio, due enzimi che funzionano a pH ottimali molto diversi come:

• Pepsina: pH di attività ottimale = 1.6. Idrolizza alcuni legami peptidici delle proteine durante la fase digestiva nello stomaco (pH stomaco varia da 1 a 2).
• Glucosio-6-fosfatasi: pH di attività ottimale = 7.8. Negli epatociti è responsabile del rilascio del glucosio nel sangue (pH del citosol negli epatociti intorno a 7.2).

• Gli aa in soluzione a pH neutro esistono sotto forma di ioni dipolari (zwitterioni: la carica netta è 0).
• Il gruppo amminico è protonato (NH₃⁺) e il gruppo carbossilico è deprotonato (COO^-).
• Lo stato di ionizzazione varia con il pH.

Un enzima funziona al top solo se si trova nello stato di ionizzazione corretto.

Fosfofruttochinasi

La fosfofruttochinasi è un enzima sensibile al pH e impedisce l’ulteriore acidificazione dei tessuti. Il piruvato viene convertito a lattato (dalla lattato-deidrogenasi) e ha un impatto sull’acidificazione dei tessuti quando questi sono in intensa attività fisica. Il lattato inibisce la fosfofruttochinasi.

La temperatura

• All’aumentare della T la velocità di catalisi aumenta.
• Esiste un limite massimo oltre il quale l’enzima perde la sua attività (denaturazione).
• La temperatura ha un impatto notevole sulla biochimica degli organismi ectodermici (lucertole, serpenti… che non sono in grado di mantenere la T corporea).

In generale, la T ha un’influenza sull’attività enzimatica per cui al suo aumentare aumenta l’attività enzimatica. C’è una T max alla quale l’enzima si denatura.

Gli organismi ectodermici non sono in grado di mantenere la temperatura corporea.

Tirosinasi

L’enzima è fondamentale per determinare la reazione che genera il colore scuro del pelo del gatto siamese. Questo enzima non funziona a T troppo alte, quindi non al centro del corpo, ma alle estremità (orecchie, zampe, coda, muso).

Molecole inibitorie

In generale, si distinguono inibitori reversibili da inibitori irreversibili. La differenza è che nell’inibizione reversibile se si toglie l’inibitore, l’attività enzimatica viene restaurata. Nella irreversibile no.

Inibizione reversibile: caratterizzata da una rapida dissociazione del complesso enzima-inibitore.

1. Competitiva (B): l’inibitore si lega al sito attivo dell’enzima, competendo con il substrato. L’inibizione può essere rimossa aumentando la concentrazione del substrato (es. farmaci quali antibiotico Sulfanilamide, Ibuprofene, statine).
2. Incompetitiva (C): l’inibitore si lega solo al complesso ES in un sito diverso da quello catalitico dell’enzima, impedendo la catalisi. L’inibizione NON può essere rimossa aumentando la concentrazione del substrato (es. erbicida glifosfato).
3. Non competitiva (mista) (D): l’inibitore si lega ad un sito dell’enzima diverso dal sito attivo. L’inibizione NON può essere rimossa aumentando la concentrazione del substrato.

Questi diversi tipi di inibizione sono distinguibili cineticamente e si possono distinguere osservando la retta dei doppi reciproci, che verrà influenzata in maniera diversa a seconda del tipo di inibitore.

Esempio di inibizione competitiva

Il Sulfanilamide è un antibiotico utilizzato per uccidere i batteri, è molto simile strutturalmente alla molecola PABA, richiesta dai batteri per sintetizzare l’acido folico, quindi questo inibitore che inibisce l’enzima della sintesi dell’acido folico, influenza solamente i batteri, in quanto gli umani non hanno bisogno di sintetizzare acido folico. È un’inibizione competitiva perché l’inibitore compete per il sito di legame del substrato sul sito attivo dell’enzima e lo inibisce.

Altri esempi sono l’Ibuprofene e le statine.

Vari tipi di inibizione cineticamente distinguibili

Inibizione competitiva

Nella inibizione di tipo competitivo, in presenza dell’inibitore competitivo, c’è una modificazione della retta dei doppi reciproci. L’inibitore influenza:

• Pendenza della retta (Km/Vmax).
• Punto di intersezione asse x (-1/Km).
• NON influenza il punto in cui la retta interseca l’asse delle y (1/Vmax).
• Km, aumenta.

Modificata la Km, il cui valore → la pendenza aumenta.

Possibile domanda esame: in che modo viene modificata la Km in seguito a una inibizione di tipo competitivo? 1/Km diminuisce in termini assoluti, quindi Km aumenta.

Inibizione incompetitiva

Nella inibizione incompetitiva la cinetica è diversa in presenza di inibitore.

• Pendenza della retta è la stessa, quindi Km/Vmax rimane invariato.
• La retta si trasla verso l’alto: 1/Vmax aumenta quindi Vmax diminuisce.
• Km diminuisce.

-1/Km aumenta, quindi.

Inibizione non competitiva