Appunti esame System Biology

MATRICE DI ESPRESSIONE

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Disegno sperimentale alla base dello studio dell’espressione genica indipendentemente

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dall’uso dei microarray esiste lui cioè come noi disegniamo i campioni che vogliamo studiare

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all’interno dell’array e successivamente li riorganizziamo per la loro analisi generalmente

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qualunque sia disegno sperimentale il risultato è sempre quella che noi chiamiamo matrice

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di espressione grande matrice dove righe troviamo i trascritti quindi i geni colonne

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le condizioni ovvero i campioni che siamo andati ad analizzare ciascun elemento della

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matrice indica livello di espressione di quel particolare gene (riga) in quella particolare

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condizione (colonna) misurato come log in base 2 del rapporto tra rosso e verde nel caso di

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esperimenti microarray a due colori o log base 2 dell’intensità di fluorescenza normalizzata nel

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caso di one color caratteristica essenziale matrice rettangolare numero di righe quasi

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sempre molto + grande del numero di colonne numero di geni maggiore del numero di

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condizioni per motivi economici ad oggi macroarray costa sui 150 prezzo gestibile ma

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con 1000 esperimenti prezzo sale molto altro motivo sta nella sperimentazione stessa cioè

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nella disposizione di materiali fare 100 200 2000 esperimenti vuol dire avere 100 200 2000 array

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di solito + di 800-900 migliaia di campioni difficile trovarli nello stesso patch sperimentale

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ovviamente se numero di condizioni particolarmente basso matrice diventa + piccola di ordine.

COSA POSSIAMO FARE CON QUESTE MATRICI

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Possiamo fare due cose espressione differenziale e clustering espressione differenziale

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significa trovare le differenze di espressione tra due gruppi gruppo A gruppo B dobbiamo

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avere dunque divisione dicotomica del campione fatta a priori ad esempio sani-malati

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possono essere ciò che ci pare importante che sia fatta a priori obiettivo identificare quei

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geni in cui c’è differenza significativa nei livelli di espressione tra gruppo A e B ho già quindi una

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categorizzazione dei campioni o dei pazienti cerchiamo quali geni sono differenti partendo

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dalla rappresentazione classica quando abbiamo parlato di normalizzazione la coda di pesce

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possiamo in linea generale definire l’espressione differenziale ciò che sta sopra semiasse

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positivo è espresso dal rosso ciò che sta sotto lo 0 semiassi negativo espresso dal verde

dove con espressione differenziale intendiamo quei geni in cui c’è una espressione maggiore di un

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fattore rispetto ad un altro ciò che sta sopra detto generalmente over-espressione sotto

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under-espressione due categorie di metodi statistici per l’identificazione dell’espressione

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differenziale single slide consentono di analizzare un singolo esperimento si basano su

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questo tipo di plot che vediamo sopra obiettivo è quello di definire un cut off soglia

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ovvero valore che vada a definire una over espressione e under espressione nei primi approcci

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fu scelto come soglia 4 scelta senza un senso vero e proprio solo una soglia per essere sicuri

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che gene fosse sovra o sotto espresso in termini di grafico significa che un gene era considerato

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sovra se superava 2 e sotto se era meno di -2 in altre parole il livello di intensità di fluorescenza

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rispetto al valore di controllo doveva essere 4 volte alla fine degli anni ’90 e inizio ’00

introdotti due metodi che facevano delle assunzioni sulle distribuzioni di probabilità delle

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grandezze della fluorescenza assunzioni di tipo probabilistico metodo chen assume

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intensità di fluorescenza come variabili gaussiane distribuzione che seguono andamento

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normale consente di identificare cut off su base probabilistica per l’espressione differenziale

assunzione che intensità di fluorescenza segue distribuzione gaussiane non del tutto accettabile

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perché distribuzione gaussiana può anche essere negativa mentre intensità sempre positiva

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assumendo dunque una distribuzione gamma trova metodo per stimare parametri metodo

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newton consente di calcolare la probabilità che un gene sia potenzialmente espresso in funzione

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anche della sua intensità prende in considerazione quindi anche il rumore che c’è negli

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esperimenti array quel rumore di cui si parlava con la normalizzazione si considera quindi il

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fatto che aumentando intensità numerica degli spot varianza + bassa diminuire intensità

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varianza aumenta quindi probabilità che gene sia differenzialmente diverso è + bassa questo

comportamento è semplicemente dovuto alla natura intrinseca del rumore del dato e non alla vera

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differenza di espressione biologica si mette appunto dunque questo nuovo metodo dove si ha +

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facilmente espressione differenziale a intensità maggiore che ad intensità minore questi due

metodi citati sono discussi per importanza a livello storico e perché in alcuni casi usati ancora oggi

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spesso quando si ha carenza di materiale biologico esistono patologie molta rare per cui

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trovare campioni è difficile multi-slide generalmente prevedono 15-20-30 esperimenti

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questi disegni sperimentali hanno come principio di fondo la replicazione ovvero eseguire lo

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stesso esperimento + volte replicare quindi lo stesso array la replicazione all’interno

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dell’esperimento può essere di due tipi replicazione tecnica estrarre lo stesso materiale

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biologico suddividerlo in parti uguali e fare un certo numero di esperimenti ad esempio

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ho un campione lo divido in 4 e faccio 4 esperimenti sull’array sto quindi studiando la variabilità

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sperimentale dell’array consente di studiare lo strumento si fa poco solo quando si vuole

studiare un sistema o un metodo per cercare di capire quali possono essere le variabilità e

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prenderle in considerazione replicazione biologica significa avere 4 campioni diversi

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caratterizzati nello stesso modo esempio 4 campioni di persone affette della stessa patologia

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o 4 campioni trattati con lo stesso farmaco estrarre RNA e fare esperimento metodo sfruttato

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dagli array multipli detto t-statistic sia in caso di replicazione tecnica sia in caso di quella

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biologica possiamo avere due tipi di disegni sperimentali one sample e two sample nel

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primo caso per la matrice di espressione abbiamo un solo gruppo mentre il secondo quando ne

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abbiamo due →

Nel caso due quindi il t test è la differenza tra le medie di due gruppi e la variabilità dei gruppi

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può assumere valori positivi e negativi positiva quando la media del gruppo affetti + grande

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della media del gruppo non affetti negativa quando è la media del gruppo non affetti ad essere

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+ grande il segno dunque ci dice quanto i livelli di espressioni siano + grandi uno rispetto all’altro

→ l’entità del valore assoluto è una misura di quanto le medie siano diverse rispetto alla variabilità

→ il t-test che sia one o two sample possiamo applicarlo per ogni riga della matrice di espressione

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se questa è fatta ad esempio da 200 condizioni e 2200 trascritti facendo t test per ogni

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trascritto ho 2200 t test box plot fa riferimento al caso two sample ed è un modo per

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riassumere la distribuzione dei dati significa che all’interno del rettangolo c’è tra il 25esimo ed il

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75esimo percentile dei dati quindi a metà tra i dati all’interno delle due righe orizzontali c’è il

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98% dei dati e quella linea in grassetto è la mediana dei dati significa che i dati sono distribuiti

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all’interno di questa struttura qui affetti non affetti

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t-student il t test ottenuto possiamo valutarlo grazie ad una distribuzione perché la statistica

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t segue la distribuzione t-student una distribuzione a campana che assume diverse ampiezze in

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funzione del parametro df che identifica i gradi di libertà all’aumentare di questi la

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distribuzione tende ad una gaussiana i gradi di libertà sono numero di replicazioni che si hanno

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nell’esperimento meno 1 quindi dato che statistica t segue distribuzione t-student e soprattutto

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statistica t calcolata su n campioni segue una distribuzione ad n-1 gradi di libertà possibile

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calcolare quanto è statisticamente rilevante numero del t-test riassumendo per ogni roga

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della matrice calcoliamo la nostra statistica t che andiamo a confrontare con la distribuzione t-

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student con un numero di gradi di libertà n-1 n numero di replicati fatti nel nostro disegno

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sperimentale se statistica t confrontata con la distribuzione t student abbastanza grande

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superiore del 1 o 5% delle statistiche t della distribuzione statistica t viene detta statisticamente

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significativa in questo caso il gene testato è differenzialmente espresso in maniera significativa

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in particolare over espresso se valore della statistica è positivo under espresso se valore della

statistica è negativo.

SIGNIFICATIVITA’ STATISTICA →

Questa viene chiamata comunemente p calcolata confrontando la statistica t con la

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distribuzione t student andandosi a calcolare la probabilità che la statistica t calcolata dai dati

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sia + grande della statistica t della distribuzione t student se questa probabilità è + piccola

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(0,01/0,05) vuol dire che valore della statistica t calcolata è molto grande nel caso 0,01 vuol

dire che valore della statistica t calcolato molto + grande del 99% dei valori t della distribuzione t

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student con quel numero di gradi di libertà quindi un valore molto alto e si definisce

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statisticamente significativo con un live