Appunti esame Controllo epigenetico dell'espressione genica (CEEG)

Controllo epigenetico dell'espressione genica

Il termine epigenetica si riferisce ai cambiamenti ereditabili nell’espressione genica che non comportano modifiche della sequenza del DNA. Si riferisce quindi a un cambiamento del fenotipo senza un cambiamento del genotipo. Quindi, non possiamo parlare di mutazioni, infatti non è previsto un cambiamento del genotipo. Il cambiamento epigenetico è un evento normale e naturale, ma può essere influenzato dall’età, dall’ambiente, dallo stile di vita e dall’insorgenza di malattie.

Gli esecutori del programma epigenetico che sono in grado di alterare l’espressione genica sono la metilazione del DNA, le modificazioni degli istoni e gli RNA non codificanti (ncRNA). L’epigenetica va oltre la genetica, la genomica e la biologia molecolare e al momento rappresenta una delle avanguardie delle scienze biologiche. L’ascesa dell’epigenetica segna una maturazione del campo, il cui nome solo 50 anni fa, è stato concepito con una vaga definizione. Ora è una disciplina dinamica, stimolante che porta a rivedere i paradigmi tradizionali di eredità. Attraverso l’epigenetica le classiche opere di Darwin, Mendel e Lamarck sono ora viste in modo diverso.

Il controllo epigenetico

Il controllo epigenetico rappresenta il controllo funzionale di un certo gene. L’ambiente in qualche modo può forzare il programma genetico: un gene può essere attivato quando non dovrebbe, viceversa può essere inattivato quando dovrebbe essere espresso. Intorno alla metà degli anni ’90, furono scoperte le istone acetil transferasi (HAT) e poco dopo le istone deacetilasi (HDAC). Si tratta di enzimi che rispettivamente aggiungono il gruppo acetile agli istoni oppure lo rimuovono.

Infatti, esistono tre elementi che agiscono sul DNA:

• Gli enzimi writers scrivono la modifica epigenetica;
• Gli enzimi erasers fanno l’opposto e quindi cancellano questa scritta;
• Gli enzimi readers leggono la modifica epigenetica. Il primo reader ad essere stato scoperto è MeCP2, che legge il DNA metilato.

PCAF possiede il cosiddetto bromodominio. I bromodomini sono delle componenti strutturali delle proteine che leggono l’acetilazione. Sono stati poi scoperti gli RNA non codificanti e le varianti istoniche. C’è un grande interesse per l’epigenetica. Infatti, la modifica epigenetica può essere scritta ma anche cancellata. Le modifiche epigenetiche di norma sono tutte reversibili. È questa la grande differenza tra le modifiche genetiche ed epigenetiche. Le modifiche genetiche vengono ereditate e si mantengono nel corso delle generazioni. Invece, le modifiche epigenetiche possono essere acquisite e reverse.

Acetilazione e deacetilazione

Ad esempio, l’acetilazione accende i geni, mentre la deacetilazione li spegne rimuovendo i gruppi acetili. Intorno al 2005 si sono scoperti degli inibitori delle HDAC. Inibire un enzima di questo tipo significa lasciare esprimere determinati geni. In alcuni casi il trattamento di alcuni tumori con inibitori delle HDAC ha portato a regressioni complete della malattia. Intorno al 2006 cellule terminalmente differenziate sono state riprogrammate in cellule staminali. Le cellule riprogrammate sono dette iPS.

Punto di inizio della trascrizione

Nel punto di inizio della trascrizione, si concentrano i fattori generali di trascrizione che a loro volta localizzano l’RNA polimerasi nel punto giusto ovvero nel punto in cui deve iniziare la trascrizione. Di norma un gene, con i soli fattori generali di trascrizione, si trascrive a livelli basali. Affinché l’espressione possa raggiungere livelli importanti sono necessari altri elementi che si trovano vicino al punto d’inizio della trascrizione.

Nella regione immediatamente a monte del punto di inizio della trascrizione ci sono infatti gli attivatori. Nelle regioni ancora più distali ci sono gli enhancers. La trascrizione è focalizzata quando parte da un preciso punto della sequenza di DNA ossia il TSS (punto d’inizio della trascrizione). La trascrizione può essere anche dispersa. La trascrizione dispersa è tipica dei geni housekeeping che sono attivi a prescindere dalle condizioni. Si tratta infatti di geni che servono al mantenimento dell’attività cellulare. In questo tipo di trascritti il punto d’inizio della trascrizione non è specifico ma è disperso sempre entro una regione controllata.

Elementi del promotore

Descriviamo ora gli elementi che costituiscono il promotore dei geni delle cellule eucariotiche. Diversi elementi fanno parte del promotore ma non tutti gli elementi sono sempre presenti. L’elemento Inr contiene il sito d’inizio della trascrizione TSS. La TATA box, in posizione tra -31 e -26, è sempre preceduta dall’elemento BRE e alle volte è accompagnata da una o più DCE box localizzate a valle del TSS. La TATA box lega la proteina TBP (parte del TFIID). I geni che hanno la TATA box sono inducibili mentre quelli privi della TATA box sono housekeeping. L’elemento BRE permette il legame del fattore generale TFIIB. L’elemento DPE è caratteristico di promotori privi della TATA box.

Possono essere presenti anche l’elemento MTE, l’elemento AGT ed elementi non canonici come le isole CpG. Le isole CpG sono sequenze ricche di dinucleotidi CG.

Confronto tra geni di mammifero e lievito

Confrontiamo un gene di mammifero con un gene di lievito. Nei mammiferi osserviamo un arricchimento di elementi sia a monte che a valle del gene. Nel gene di mammifero si acquisiscono sequenze introniche e sequenze regolative possono essere prossime al TSS o si possono trovare anche a 50 kb.

Il DNA non è nudo ma è associato a proteine istoniche che lo compattano. Quindi, il DNA non è disponibile. Gli istoni devono essere modificati o spostati per rendere accessibile il DNA. La trimetilazione dei residui di lisina in posizione 4 dell’istone H3 (H3K4me3) indica una trascrizione attiva. Invece, la trimetilazione dei residui di lisina in posizione 27 dell’istone H3 (H3K27me3) è associata con uno stato di inattivazione trascrizionale.

Modifiche istoniche

La metilazione degli istoni può essere diversa a seconda del residuo modificato. Per l’acetilazione le cose sono un po’ diverse. Infatti, l’acetilazione permette sempre la trascrizione. Una cromatina acetilata è più trascrivibile di una non acetilata. Gli enhancers sono sequenze che stimolano la trascrizione dei geni anche a grandi distanze dal promotore e a prescindere dall’orientamento.

Come fa una sequenza che sta a 50 kb dal promotore a stimolare la trascrizione? Gli elementi che si trovano sull’enhancer si possono associare con gli elementi che si trovano sul promotore e in questo modo si forma un loop che esclude il DNA che si trova in mezzo. L’enhancer si viene così a ritrovare in prossimità del promotore. Quindi, l’enhancer funziona a distanza grazie alla curvatura del DNA.

Fattori di trascrizione

Affinché la polimerasi possa riconoscere il TSS sono richiesti degli elementi ossia i fattori di trascrizione. Come sono stati studiati i fattori di trascrizione? È stato fatto un esperimento di run-off, ovvero un esperimento in vitro, in cui il substrato, ossia il DNA, viene tagliato con un enzima di restrizione. Quindi, tutti i DNA terminano nello stesso punto. A monte di questo taglio, c’è un promotore di E. Coli, che verrà riconosciuto dall’oloenzima (è presente la subunità sigma). La polimerasi viene quindi portata sul promotore, inizierà a trascrivere e giunta alla fine del DNA che fa da substrato, cade. In questo modo si produce un RNA di lunghezza definitiva. In elettroforesi si vede un’unica banda.

Qualora togliessimo la subunità sigma alla polimerasi e facessimo trascrivere la polimerasi sullo stesso substrato, il risultato che otterremmo sarebbe una striscia, non più una banda sola, ma tantissime bande, perché la polimerasi senza la subunità sigma, inizia la trascrizione ovunque. Quindi, benché il punto finale sia sempre lo stesso, produrrò frammenti di tutti i tipi. Deduco quindi che l’inizio non era accurato. In questo modo sono stati studiati i fattori di trascrizione. Se prendiamo la polimerasi e i fattori di trascrizione provenienti da un estratto e li mettiamo su un substrato tagliato con enzimi di restrizione osserveremo la produzione di un solo tipo di RNA. Se facciamo la stessa cosa senza i fattori di trascrizione o dandone solo alcuni, i trascritti saranno variabili.

Sono stati messi in evidenza i fattori di trascrizione più importanti. Inoltre, è stato determinato anche l’ordine con cui i fattori di trascrizione si legano (TFIID→TFIIA e TFIIB→TFIIF insieme alla polimerasi→TFIIE e TFIIH). I fattori generali della trascrizione sono importanti non perché la polimerasi trascriva, ma perché trascriva accuratamente e parta dal TSS. Non sono subunità della polimerasi, ma sono elementi a parte e si assemblano solo nel momento in cui la polimerasi deve iniziare a trascrivere. Alcuni agiscono come monomeri, altri come complessi di proteine.

Proteine istoniche e cromatina

TFIID è costituito da tante subunità. Tra queste subunità riconosciamo la proteina TBP (TATA binding protein) e altri fattori che vengono definiti TAF (TBP associated factors). La proteina TBP riconosce l’elemento di sequenza TATA. Le TAF hanno diverse qualità. Alcune TAF sono dei modificatori della cromatina. Per esempio, tra le TAF abbiamo le HAT. Sul promotore c’è quindi un certo affollamento. In totale abbiamo circa 50 proteine, di cui 30 indicano alla polimerasi dove mettersi.

Affinché la polimerasi possa iniziare la trascrizione in maniera efficace sono quindi richiesti specifici elementi. La richiesta minima è che ci siano i fattori generali della trascrizione. L’intervento di altri fattori, che sono più specifici, permette una trascrizione più efficiente. Mentre i fattori di trascrizione generali si legano proprio sul promotore lì dove va la polimerasi, i fattori ausiliari si legano alle regioni regolative. Una volta che si sono associati sul DNA, questi elementi regolatori contattano la polimerasi e la trascrizione avviene efficientemente. Talvolta, ci sono degli elementi che aiutano ulteriormente questo tipo di processo. Si tratta dei cosiddetti co-attivatori.

Ancora più rilevante nello stimolo della trascrizione di un gene, è l’intervento dei cosiddetti enhancers. Questi elementi vanno a costituire un ulteriore ingombro. Quindi, per l’azione di questi elementi è determinante la tridimensionalità del sistema. Gli enhancers agiscono a distanza (anche 50 kb). Per questo motivo, il ripiegamento del DNA è piuttosto consistente. Le proteine attivatrici presentano dei domini di attivazione con i quali si legano sugli enhancers e dei domini di legame con i quali si legano alla sequenza di DNA. In questo modo è possibile il ripiegamento del DNA.

C’è quindi una concentrazione di elementi sul promotore. L’enhancer non si avvale solo di queste componenti proteiche ma c’è anche una trascrizione locale grazie al reclutamento della polimerasi che produce eRNA non codificanti. Il sistema diventa poi sempre più complicato. Infatti, c’è anche il complesso del mediatore, il quale è formato da molte subunità. Gli eRNA possono essere di varie dimensioni e caratteristiche: esistono quelli bidirezionali, che vengono trascritti a partire dalla regione del promotore nelle due direzioni, oppure unici, che vengono trascritti in un’unica direzione.

Gli eRNA bidirezionali non vengono particolarmente modificati e agiscono in cis. Gli eRNA unici sono più lunghi e vengono maturati (tramite splicing che rimuove gli introni) e poliadenilati (come avviene per gli mRNA che codificano per proteine). Essendo più lunghi, questi eRNA favoriscono l’associazione tra una porzione di DNA e un’altra, promuovendo l’interazione in trans.

Tutti questi fattori si devono associare con il DNA nella sua condizione naturale in vivo. In vivo il DNA non è disponibile. Infatti, il nostro materiale genetico ha una lunghezza di circa 2 metri e questi 2 metri devono impacchettarsi nei pochi micron del nucleo. Il DNA si deve quindi compattare ed è quindi associato agli istoni a formare la cromatina. Si distinguono diversi livelli di compattamento della cromatina. Un primo livello di compattamento è rappresentato dalla fibra da 10 nm o collana di perle ed è appunto garantito dall’associazione del DNA con l’ottamero istonico. Si forma così il nucleosoma: DNA che compie 2 giri intorno all’ottamero istonico. Ogni nucleosoma rappresenta la perla della collana.

Questo primo livello di compattamento, più che nell’accomodamento nel nucleo, è coinvolto nella regolazione dell’espressione genica e in particolare in un silenziamento generale dell’espressione genica. Da questo primo livello si può poi formare un ulteriore compattamento. Infatti, la fibra da 10 nm viene ulteriormente spiralizzata a formare la fibra da 30 nm (modello solenoide o modello a zig-zag). Successivamente si ha un’organizzazione ad anse. Il livello di compattazione massimo è quello del cromosoma metafasico. Il DNA è compattato e allo stesso tempo ordinato, se non lo fosse, tutti i processi di regolazione sarebbero impossibili.

Storia della cromatina

Descriviamo la storia della cromatina. Nel 1871 Miescher isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Nel 1880 fu proposto il termine “cromatina”. Nel 1884 sono stati scoperti gli istoni e successivamente il DNA venne studiato come principio trasformante prima da Griffith e poi da Avery, MacLeod e McCarty. La struttura del DNA venne risolta nel 1953 da Watson e Crick, Wilkins e Franklin. Nel 1964 si scoprì che gli istoni associati al DNA potevano andare incontro a delle modifiche. Non si conosceva però la funzione di queste modifiche.

Successivamente, il nucleo fu analizzato al microscopio elettronico e si poté osservare una struttura ripetitiva di particelle sulla fibra. Kornberg propose dunque il modello del nucleosoma. Seguirono una serie di studi con le nucleasi, utilizzate per determinare la struttura del nucleosoma. Negli anni ’80 fu determinata la struttura cristallografica da Richmond e successivamente grazie a Turner vennero identificate in modo più dettagliato le modifiche istoniche. All’inizio del 2000, Alis e Jenuwein proposero il codice istonico.

La cromatina è associata a quasi tutto il genoma, altrimenti il materiale genetico non potrebbe entrare nel nucleo. Questo concetto venne espresso in maniera molto chiara da Kornberg, che elencò delle caratteristiche che il nucleosoma doveva avere. Ad esempio, il DNA doveva girare intorno all’ottamero.

Gli studi di Markus Noll mostrarono che, quando si digerisce parzialmente il DNA nucleare attraverso nucleasi micrococcica, la frammentazione non è casuale. Questa digestione parziale è stata infatti analizzata su gel di agarosio e si sono osservate delle bande di multipli di 200 bp. La nucleasi riusciva quindi a digerire non tutto il DNA in maniera randomica ma soltanto in specifici punti accessibili alla nucleasi. Questi punti accessibili sono multipli di una lunghezza di 200 bp. Questa modalità di digestione ha fatto quindi pensare che ci fosse una struttura ripetitiva costituita da varie subunità. Si è cercato poi di fare una digestione completa aumentando il tempo di digestione e quello che si è visto è che comunque al di sotto di 147 bp la nucleasi non riusciva a digerire. La digestione completa generava quindi frammenti di dimensioni uguali di circa 147 bp. Infatti, l’attività della nucleasi si esercita a livello del DNA linker, ossia il DNA di collegamento tra due nucleosomi.

Si scoprì così che l’unità di base della cromatina è il nucleosoma. Il nucleosoma è formato da DNA avvolto intorno all’ottamero istonico. Gli istoni sono H2A, H2B, H3 e H4. H1 non fa parte del core istonico e si posiziona nel punto di entrata e di uscita del DNA. Si tratta di proteine molto piccole (poco più di 100 amminoacidi) cariche positivamente, il che le rende adatte a legarsi al DNA che è negativo. La carica positiva è dovuta all’abbondanza di residui di lisina ed arginina. Inoltre, gli istoni sono proteine fortemente conservate nel corso dell’evoluzione: H4 è la più conservata mentre H1 è la meno conservata.

Come giustifichiamo la grande conservazione delle proteine istoniche? La controparte degli istoni è il DNA, il quale è conservato (a cambiare è solo la sequenza ma la struttura è sempre la stessa). Dunque, è chiaro che, se questa struttura deve essere compattata, gli istoni devono conservarsi. Le code N-terminali degli istoni sporgono all’esterno dell’ottamero e sono frequentemente modificate. È qui che avvengono le principali modifiche epigenetiche. H3 e H4 costituiscono la parte più interna dell’ottamero, mentre H2A e H2B si trovano lateralmente.

Tipi di digestione

Esistono tre tipi di digestione:

• Quella super-spinta produce la particella core, in cui il DNA è tutto digerito a meno delle 147 bp che si avvolgono due volte intorno all’ottamero;
• Quella che dà origine al cromatosoma, in cui si mantengono l’istone H1 e una porzione di DNA che eccede;
• Quella che dà origine al nucleosoma vero e proprio, in cui si osserva anche il DNA linker.

L’istone H1 è fondamentale per il ripiegamento della fibra da 10 nm nella fibra da 30 nm. La fibra da 30 nm può poi compattarsi ulteriormente a formare delle anse. Questo avviene grazie a legami con proteine specifiche della matrice nucleare (interfase) o scaffold nucleare (metafase). Le sequenze che si legano alla matrice sono dette MAR (matrix associated region), quelle che si legano allo scaffold sono dette SAR (scaffold associated region). Le anse che si vengono a creare possono avere varie dimensioni e sono topologicamente indipendenti.