Appunti esame regolazione dell'espressione genica negli eucarioti (REGE)

Regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Complessità dei genomi

• 1953: Scoperta della struttura del DNA (Watson e Crick)
• 1973: Clonaggio e sequenziamento del DNA (Gilbert e Sanger)
• 1987: PCR (Mullis)
• 1990-2001: Sequenziamento del genoma
• 2008-2009: Sequenziamento dell’RNA

Il genoma (se non specificato intendiamo il genoma nucleare e non quello mitocondriale o plastidiale) è il DNA contenuto all’interno della cellula. La genomica ci consente di studiare il genoma dopo averlo sequenziato. La prima domanda della genomica è stata molto semplice: quanti geni abbiamo nel genoma? I geni codificanti per proteine sono circa 20.000 ma la maggior parte dei geni non sono codificanti. La genomica prevede quindi 2 fasi: una prima fase di clonaggio e sequenziamento di interi genomi e successivamente una seconda fase di annotazione ossia l’identificazione e la descrizione di geni putativi e di altre sequenze importanti. Per molti anni, fino a quando non si sono iniziati a sequenziare gli RNA, i dati di genomica si basavano esclusivamente sullo studio di geni codificanti per proteine.

Negli anni ’90 è nato il Progetto Genoma Umano come collaborazione di moltissime nazioni. Il progetto si propone di determinare le sequenze di circa 3 miliardi di basi del genoma umano e si concluderà solo nel 2021. La combinazione dell’approccio del consorzio pubblico e di quello privato di Venter (Celera) ha portato alla pubblicazione del primo sequenziamento parziale (ossia di circa il 90% del genoma) nel 2001. Nel 2003 si riuscì ad ottenere il 99,99% del genoma ma mancava ancora il sequenziamento dei telomeri (i telomeri sono sequenze ripetute e per questo sono molto difficili da sequenziare). Solo alla fine di quest’anno (2021) si otterrà il sequenziamento completo al 100% del genoma umano. Il problema non è stato tanto il sequenziamento ma l’assemblaggio del genoma.

Nell’assemblaggio di sequenze si generano dei contigui (contig) per poi definire un consenso (consensus). Al fine di produrre un consenso è necessario che ogni posizione (base) sia validata. Per avere una validazione delle singole posizioni si producono numerose sequenze della stessa porzione genomica generando una copertura adeguata. Molto importante è infatti la copertura (coverage) che indica quante basi in più sono sequenziate in relazione alla lunghezza totale di un genoma. Infatti, 18 miliardi di basi devono essere sequenziate per capire come mescolare e rimettere in ordine tutte le basi. Per questo il progetto è iniziato con lo studio degli organismi più semplici come C. Elegans, Drosophila, il topo e solamente in una fase successiva l’attenzione si è spostata sull’uomo.

Quello che ci ha sorpreso è stato osservare che la grandezza del genoma in termini di bp in realtà non è associata alla complessità dell’organismo (paradosso del valore C). Quindi, la grandezza del genoma non ha nulla a che fare con l’informazione che poi viene espressa. Dunque, molto di quello che sequenzio in realtà non è informativo ai fini dell’espressione genica. Dopo la fase di assemblaggio segue la fase di annotazione. I dati derivanti dal sequenziamento e dall’annotazione dei genomi costituiscono una descrizione completa, strutturale e funzionale, del genoma dei diversi organismi. Questi dati sono di grande aiuto alla ricerca scientifica e per facilitare l’accesso sono stati riuniti in collezioni messe a disposizione della comunità scientifica come risorse accessibili via web. Queste collezioni sono chiamate browser genomici. I browser genomici principali sono UCSC e Ensembl.

Darwin aveva già intuito l’esistenza dei geni ma non capiva perché si mescolassero producendo nuovi fenotipi. Anche Mendel ipotizzò la presenza di fattori particellari che potevano essere trasmessi e che erano in grado di portare l’informazione. La prima definizione moderna di gene si è avuta negli anni ’40: “one gene one enzyme”. Un gene è quindi specifico per un singolo enzima. Nella sua definizione iniziale il gene è l’unità fisica di base dell’ereditarietà; è una sequenza lineare di nucleotidi lungo un segmento di DNA che fornisce le istruzioni per la sintesi dell’RNA, che, tradotto in proteina, porta all’espressione del carattere ereditario. La prima annotazione è stata fatta su geni codificanti per proteine. Infatti, per molti anni si è creduto che la complessità di un dato organismo fosse definita unicamente dal numero di proteine codificate nel suo genoma.

La più grande sorpresa dei progetti di sequenziamento del genoma è stata la scoperta che il numero di geni che codificano le proteine non è correlato con la complessità dell’organismo (il verme ha 18.000 geni codificanti…come l’uomo!). Quindi, i geni codificanti non spiegano la complessità dell’organismo. La parte correlata alla complessità è infatti tutto il resto del genoma ossia la parte non codificante. Si è visto che all’aumentare della complessità dell’organismo aumenta la porzione di DNA non codificante. Ci siamo evoluti sotto attacco di virus, retrovirus, trasposoni. Tutti questi elementi hanno attaccato il nostro genoma e sono rimasti all’interno del nostro genoma.

In proporzione, i genomi più grandi contengono meno geni e più elementi trasponibili rispetto ai genomi più piccoli. Solo il 2% del genoma codifica per proteine. Il 40% del genoma è fatto da elementi trasponibili e in particolare da retrotrasposoni (es. LINE-1, Alu). Il restante 50% del genoma umano è formato da introni, elementi regolatori (es. lncRNA, enhancers) e sequenze intergeniche. Quindi, la complessità di un organismo dipende da molto di più del numero di nucleotidi che compongono il genoma e dal numero delle sequenze codificanti proteine.

Livelli di regolazione dell’espressione genica

La regolazione dell’espressione genica si esercita su più livelli. Innanzitutto, si ha il controllo della trascrizione. Si ha poi il controllo della maturazione del trascritto che porterà alla produzione del messaggero maturo. Anche gli altri RNA (non solo mRNA) subiscono un processo di maturazione. Seguono poi il controllo del trasporto (l’mRNA deve andare nel citoplasma), il controllo traduzionale o il controllo della degradazione del messaggero (infatti, non è detto che il messaggero venga per forza tradotto in proteina, potrebbe anche essere degradato). Infine, esiste anche un controllo che può portare alla degradazione della proteina prodotta. Spesso questi meccanismi sono interconnessi tra di loro.

Trascrittoma e progetti trascrittomici

Dopo il sequenziamento del genoma, il secondo ramo principale della genomica è l’analisi del trascrittoma (totalità degli RNA trascritti a partire da un genoma). Il sequenziamento del genoma non mi dà informazioni su cosa esprime una specifica cellula. Infatti, il DNA è lo stesso in tutte le cellule. Ciò che cambia tra le diverse cellule è il trascrittoma. Il trascrittoma è l’insieme completo dei trascritti e dei loro relativi livelli di espressione in particolari cellule o tessuti e sotto definite condizioni. Il trascrittoma dipende da ciò che lega il genoma e dallo stato epigenetico. Ecco perché al sequenziamento del genoma devo affiancare sempre altri tipi di analisi. Il trascrittoma può essere modificato, può subire splicing, può essere editato e anche degradato. Le tecniche per l’analisi del trascrittoma sono, per esempio, DNA microarray e RNA-sequencing. Il proteoma, e quindi il complesso di proteine espresse da una cellula, è ancora molto più complesso del trascrittoma. Dopo il Progetto Genoma Umano sono nati altri progetti “trascrittomici” come il progetto FANTOM, il progetto ENCODE e il progetto GENCODE. Questi progetti hanno integrato i browser genomici con dati di trascrittomica.

Nella sua definizione moderna il gene è una sequenza del genoma che corrisponde a un’unità ereditaria associata a regioni regolative, trascritte e funzionali. Per essere un gene non devo quindi necessariamente produrre una proteina. Mi basta essere un elemento regolativo e quindi funzionale. Quasi la totalità genoma viene trascritta. Per questo si dice che negli eucarioti la trascrizione è pervasiva. Dal rumore trascrizionale posso infatti evolvere funzioni regolative. Tutto il genoma viene quindi sfruttato per la regolazione e non per l’evoluzione di nuovi geni codificanti per proteine.

Un altro concetto importante è la qualità dell’RNA. La nostra cellula produce a partire dai geni codificanti un eccesso di RNA. Se l’RNA non è perfetto per la sua funzione allora viene distrutto. La qualità è diversa a seconda del tipo di RNA.

Metodologie per lo studio degli acidi nucleici e proteine

Differenze tra DNA e RNA

Il DNA e l’RNA differiscono in vari aspetti: il DNA presenta il deossiribosio (il C2’ non ha l’ossidrile) mentre l’RNA presenta il ribosio (il C2’ ha l’ossidrile); l’RNA presenta l’uracile al posto della timina; il DNA è costituito da 2 filamenti mentre l’RNA è una molecola a singolo filamento (anche se può formare diverse strutture secondarie).

La denaturazione è un processo reversibile che consiste nel separare i 2 filamenti attraverso agenti chimici o attraverso l’aumento di temperatura. La rinaturazione avviene quando 2 molecole a singolo filamento si riuniscono a formare una struttura stabile a doppia elica. L’ibridazione avviene quando un filamento di DNA e uno di RNA si riassociano ma anche quando si riassociano 2 filamenti provenienti da eliche di DNA di origine diversa.

Elettroforesi

L’elettroforesi è una tecnica che permette di separare le molecole in base al peso molecolare. Il gel che viene utilizzato può essere di agarosio (quando analizziamo grosse molecole di circa 0.5-20 kb) o di poliacrilamide (quando analizziamo molecole più piccole di circa 10-500 bp). L’agarosio è un polisaccaride costituito da unità disaccaridiche di D-galattosio e di L-galattosio. Il poliacrilamide è formato da 2 monomeri, l’acrilamide e il bisacrilamide, che polimerizzano. L’agarosio è un gel molto facile da fare mentre il gel di poliacrilamide è più difficile perché va corso tra 2 vetri (quando vengono rimossi i vetri spesso si spezza). Le molecole si separano sotto l’azione di un campo elettrico formato da 2 elettrodi (l’anodo ossia il polo positivo e il catodo ossia il polo negativo). Gli acidi nucleici hanno carica negativa e migrano dunque verso l’anodo.

Dopo aver pesato l’agarosio e misurato il tampone, i 2 vengono mescolati. Il tampone contiene agenti denaturanti come la formaldeide. La denaturazione è fondamentale per l’RNA in quanto si tratta di una molecola che non ha una struttura ben definita. Questo fa sì che l’acido nucleico si muova uniformemente lungo il gel. Dal momento che l’agarosio non è solubile a temperatura ambiente, esso deve essere portato ad ebollizione utilizzando il forno a microonde. Il sistema di costruzione di un gel di agarosio è costituito da 3 parti: la piastra, il supporto (slitta) e il pettine. Quest’ultimo serve a realizzare i pozzetti. A temperatura ambiente, il gel polimerizzerà in 10-15 minuti. Il gel, una volta preparato, viene sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il tampone di elettroforesi, in modo che l’intero gel sia soggetto ad uguale corrente elettrica.

Il campione di acido nucleico è in soluzione acquosa. Questa, essendo di densità pari a quella del tampone di elettroforesi, non riuscirebbe ad impedire che il campione “scappi” dal pozzetto. Si aggiunge quindi per appesantire i campioni il tampone di caricamento (colorante + glicerolo), che permette la loro permanenza nei pozzetti, e fornisce un marker visivo della progressione della corsa elettroforetica. Infatti, sono presenti delle molecole caricate dette coloranti, di differenti colori e dimensioni. Uno, il blu di bromofenolo, è più piccolo di quasi tutti i frammenti di acido nucleico e, quindi, migrerà con i frammenti piccoli. L’altro, lo xilene cianolo, è una molecola grande, che migra insieme ai frammenti di più elevato peso molecolare. Si può perciò presumere che la maggior parte dei campioni migrerà nella zona interposta tra i 2 coloranti, cosicché quando il blu di bromofenolo sarà giunto in prossimità del fondo del gel, si potrà interrompere la corsa.

L’elettroforesi può essere orizzontale o verticale. Nell’elettroforesi orizzontale si usa una vaschetta contenente un tampone in cui viene immerso il gel di agarosio. Il gel presenta dei pozzetti in cui verranno caricati i campioni di acido nucleico. Nell’elettroforesi verticale il gel di poliacrilamide si trova tra 2 vetri. Lo spessore del gel di poliacrilamide può variare. Maggiore è lo spessore del gel e maggiore sarà la quantità di campione che entrerà all’interno del pozzetto.

Dopo aver rimosso il gel dall’apparecchio di elettroforesi, si può visualizzare il DNA mediante colorazione con bromuro d’etidio, una molecola che emette fluorescenza una volta esposta agli UV. Infatti, a occhio nudo DNA e RNA sarebbero invisibili. Più la molecola di acido nucleico è grande più assorbirà agente intercalante e dunque la sua fluorescenza sarà maggiore. Il gel viene posto su un transilluminatore a luce UV e viene osservato. Grazie a dei marker di peso molecolare che vengono fatti correre sul gel insieme ai campioni è possibile poi risalire alle dimensioni dei campioni. Se corro l’RNA di qualsiasi cellula ottengo sempre la stessa immagine ossia RNA ribosomiale 28S e 18S. Il 90% dell’RNA che costituisce l’RNA totale è infatti RNA ribosomiale. Il gel può essere infine fotografato.

Ibridazione con sonde specifiche e blotting

L’ibridazione con sonde specifiche permette l’analisi di molecole separate mediante elettroforesi su gel. Può trattarsi di frammenti di DNA ottenuti con enzimi di restrizioni (southern blot) o di uno specifico mRNA all’interno di una preparazione di mRNA totale (northern blot). Il northern blot è un’analisi molto complessa da fare ma allo stesso tempo è un’analisi estremamente informativa. Presenta un limite temporale: per analizzare l’RNA si impiegano diversi giorni. Inoltre, richiede spesso l’utilizzo di radioattivo e quindi c’è necessità di un serio addestramento dell’operatore.

L’RNA viene estratto dalla cellula. Oggi l’RNA viene estratto con dei kit specifici. Una volta estratto, l’RNA deve essere quantificato. L’RNA viene quantificato grazie allo spettrofotometro. Una cuvetta di quarzo con un cammino di 1 cm contenente il campione di RNA viene attraversata da un raggio a una certa lunghezza d’onda (la lunghezza d’onda dipende dalla molecola che sto analizzando: 260 nm per gli acidi nucleici). Un campione di RNA assorbe 1 (cioè ha assorbanza 1) quando la sua concentrazione è pari a 40 µg/ml. Per la quantificazione si utilizza anche il nanodrop che non prevede l’utilizzo di cuvette: alcuni µl di campione vengono direttamente posizionati sul supporto apposito e viene letta l’assorbanza a specifiche lunghezze d’onda.

Dopo avere quantificato l’RNA, questo viene denaturato. Gli acidi nucleici a singolo filamento, come l’RNA, tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto, la loro corsa elettroforetica è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. Quindi, l’RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare. La corsa elettroforetica può essere effettuata su gel di agarosio o di acrilamide. La separazione su gel di agarosio avviene quindi in condizioni denaturanti. La denaturazione si ottiene scaldando il campione o aggiungendo formaldeide al gel. Il tampone di caricamento viene caricato insieme al campione e contiene sostanze colorate che permettono di seguire la corsa elettroforetica e glicerolo che serve ad appesantire il campione.

Una volta corsa l’elettroforesi, l’RNA viene trasferito dal gel alla membrana (nylon carico positivamente o nitrocellulosa). Il gel di agarosio viene quindi posto su un supporto e per imbibizione, ossia per adsorbimento, l’RNA si sposta sulla membrana. Questo processo viene portato avanti tutta la notte. Quando invece si utilizza il gel di acrilamide questo viene posto in un apparato detto elettroblot e l’RNA non si sposterà più per imbibizione ma si sposterà sulla membrana per movimento elettrico. A questo punto l’RNA deve essere fissato sulla membrana e questo viene fatto con 2 modi diversi a seconda della membrana (nylon carico positivamente o nitrocellulosa). Per il nylon si utilizzano gli ultravioletti mentre per la nitrocellulosa si usa la cottura a temperatura. Fissare vuol dire legare covalentemente il mio RNA sulla membrana.

Dopo il blot, ossia dopo il trasferimento dell’RNA dal gel alla membrana, sul gel non rimane più nulla. L’RNA si trova infatti tutto sulla membrana. Anche l’etidio bromuro passa nella membrana. Quindi, se leggessi la membrana sugli UV vedrei la stessa immagine speculare del gel. Dopo la fissazione, la membrana viene immersa in una soluzione contenente la sonda specifica, ossia il probe a DNA. Quando estraggo dalla cellula l’RNA non so se è buono o cattivo. Per sapere la qualità dell’acido nucleico lo si fa correre su gel di agarosio. Quando si osservano 2 bande nette integre, che rappresentano il 28S e il 18S, allora la qualità dell’RNA è ottima. Oggi ci sono delle macchine che compiono questa elettroforesi in modo capillare o su dei supporti di silice. Quindi,