Appunti di Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Appunti di ecologia del microbiota umano, prof. Gargari

Lezione 1

Teoria dell’endosimbiosi

• La teoria dell’endosimbiosi descrive il processo attraverso il quale alcuni procarioti sono entrati nelle cellule ancestrali degli eucarioti tramite endocitosi. Questi procarioti si sono poi evoluti fino a formare organelli come i mitocondri nelle cellule animali e i cloroplasti nelle cellule vegetali.
• Questa teoria è confermata dall’esistenza di DNA autonomo (diverso) nei mitocondri e nei cloroplasti, diverso da quello presente nel nucleo della cellula.

Ipotesi di Gaia

• Secondo l’Ipotesi di Gaia, la Terra è vista come un organismo vivente in cui ogni componente (biotico e abiotico) contribuisce alla stabilità e alla capacità di sostenere la vita. Questa teoria, formulata da James Lovelock negli anni ’70, vede il pianeta come un sistema autoregolante che mantiene condizioni adatte alla vita.
• Nel contesto del corpo umano, i microrganismi giocano un ruolo simile, contribuendo al mantenimento della salute e alla stabilità fisiologica.

Classificazione dei viventi

• La classificazione tradizionale comprende i cinque regni:
  1. Monera (procarioti: batteri, archeobatteri e cianobatteri)
  2. Protisti
  3. Funghi (eucarioti unicellulari = lieviti; eucarioti pluricellulari = muffe)
  4. Piante
  5. Animali
• Nel 1990, Woese introdusse la classificazione in tre domini:
  1. Bacteria
  2. Archaea
  3. Eucarya

Virus

• I virus non sono considerati organismi viventi in senso stretto, poiché non possono replicarsi autonomamente e richiedono una cellula ospite per completare il loro ciclo vitale. Il dibattito sulla loro classificazione rimane aperto.

Nomenclatura binomiale

• Ideata da Carlo Linneo nel 1753, la nomenclatura binomiale è un sistema di classificazione che assegna a ogni organismo un nome in latino composto da:
  1. Epiteto generico (il genere, scritto con la prima lettera maiuscola e in corsivo).
  2. Epiteto specifico (la specie, scritto in minuscolo e in corsivo).

Specie: Insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e di somiglianze a livello anatomo-morfologico e, più in generale, fisiologico: tali caratteristiche differenziano gli individui di una specie da quelli di tutte le altre.

Homo sapiens, Escherichia coli.

Esempi:

• Il ceppo è l’insieme di cellule microbiche teoricamente derivanti da un’unica cellula progenitrice e quindi idealmente aventi un identico patrimonio genetico. Due organismi appartengono alla stessa specie se hanno almeno il 98,7% di identità nel gene 16S rRNA.
• Il termine genetic drift si riferisce al processo di accumulo di mutazioni in un ceppo microbico, che può portare alla formazione di un nuovo ceppo con caratteristiche genetiche diverse.

Microbiota umano

• Il microbiota è l’insieme di tutti i microrganismi (batteri, funghi, virus) che colonizzano un organismo o un ambiente specifico. L’essere umano è considerato un olobionte, poiché oltre alle proprie cellule eucariotiche, l’organismo ospita anche un vasto numero di cellule procariotiche (batteri), che vivono in simbiosi ed interagiscono, influenzandosi reciprocamente. Infatti abbiamo più cellule batteriche rispetto alle cellule umane nel nostro corpo.
• Il microbiota umano è particolarmente concentrato in alcuni distretti del corpo, come l’intestino, la pelle, la bocca e la vagina. Ad esempio, i lattobacilli sono particolarmente abbondanti nell’intestino e nella vagina, dove producono acido lattico che aiuta a mantenere un ambiente acido, inibendo la crescita di patogeni.

Postulati di Koch

• I postulati di Koch sono una serie di criteri utilizzati per dimostrare che un particolare microrganismo è la causa di una malattia specifica. Per dimostrare ciò, si isolano i microrganismi da un organismo malato, li si inocula in un organismo sano e, se si sviluppano gli stessi sintomi, si ricoltivano dallo stesso organismo per confermare la causa.

Triangolo: dieta, microbiota, ospite

• La dieta influenza direttamente il microbiota e l’ospite. Alcuni componenti alimentari non digeribili vengono metabolizzati dal microbiota intestinale, producendo acidi grassi a catena corta (SCFAs) o altri metaboliti che possono avere effetti positivi o negativi sull’ospite.
• Anche l’ospite produce molecole che influenzano il microbiota, creando una relazione complessa e bidirezionale.

Funzioni del microbiota intestinale

Il microbiota intestinale può essere inteso come organo metabolicamente attivo del corpo umano.

Il microbiota intestinale svolge diverse funzioni essenziali:

• Produzione di vitamine
• Digestione di nutrienti
• Regolazione della motilità intestinale
• Influenza sul sistema immunitario
• Regolazione dell’infiammazione
• Barriera contro patogeni
• Metabolismo di farmaci e controllo della sazietà

Distinzione tra microbiota e microbioma

• Microbiota: è il termine che dovrebbe essere usato per sostituire la parola “microflora” e deve essere usato per definire l’insieme di tutte le cellule microbiche che colonizzano uno specifico ecosistema (qualsiasi possibile ecosistema!). Si riferisce agli specifici microbi.
• Microbioma: è un intero habitat in cui risiedono i microrganismi, compreso il loro intero “teatro di attività” (cioè i microrganismi, i loro genomi, le molecole che producono, le loro interazioni e l’ambiente circostante). Il microbiota è quindi parte integrante del microbioma.

Interazioni ecologiche

Le interazioni tra microrganismi e tra microrganismi e ospite possono essere di diverso tipo:

1. Neutralismo: nessun organismo trae vantaggio o svantaggio.
2. Commensalismo: interazione non obbligatoria in cui un organismo trae vantaggio senza danneggiare o avvantaggiare l’altro.
3. Sinergismo (protocooperazione): entrambi gli organismi traggono vantaggio, ma non è un’interazione obbligatoria, possono sopravvivere indipendentemente.
4. Mutualismo: entrambi gli organismi traggono beneficio ed è un’interazione obbligatoria (es. licheni).
5. Antagonismo: uno dei due organismi è danneggiato (es. antibiosi, inibizione crescita; competizione, due popolazioni stanno cercando la stessa risorsa di nutrienti e habitat; predazione, un organismo predatore usa come fonte di cibo un altro organismo; parassitismo, di natura trofica, una trae vantaggio a spese dell’altra, creandole danno biologico).

La simbiosi prima era intesa come mutualismo, ora è usata per definire i rapporti descritti.

Culturomica e metagenomica

• Culturomica: consiste nella coltivazione, mediante diluizioni decimali, dei microrganismi su terreni di coltura (gel) per isolarli e studiarli a livello metabolico, in seguito a crescita di colonie batteriche. Tuttavia, questa tecnica permette di coltivare solo circa l’1% dei microrganismi presenti in un campione (sottostima della diversità microbica).
• Metagenomica: consiste nell’analizzare il DNA estratto direttamente da un campione, permettendo di identificare anche microrganismi non coltivabili. È una tecnica più completa per studiare la diversità microbica. Mi restituisce il nome del microrganismo dopo aver effettuato un confronto con il database. Lo svantaggio è che non c’è il microrganismo in mano e non posso studiarlo, perché non l’ho coltivato a differenza della culturomica. Alla fine si fa l’incrocio delle due tecniche per un risultato completo.

Gene 16S rRNA

• Il gene 16S rRNA si trova nei procarioti e contiene sia regioni altamente conservate che regioni variabili, utili per l’identificazione di generi e specie batteriche. Questo gene è fondamentale per il profiling del microbiota.

Domande per la riflessione

1) Descrivi la classificazione dei viventi e spiega cosa si intende con «tassonomia»

La classificazione dei viventi si basa su un sistema gerarchico che organizza gli organismi in gruppi basati su caratteristiche comuni. Tradizionalmente, la classificazione include cinque regni:

1. Monera (procarioti: batteri e archeobatteri)
2. Protisti
3. Funghi
4. Piante
5. Animali

Nel 1990, Woese introdusse una classificazione in tre domini:

• Bacteria
• Archaea
• Eukarya

La tassonomia è la scienza che si occupa della classificazione e della nomenclatura degli organismi. Utilizza una struttura gerarchica che comprende livelli come dominio, regno, phylum, classe, ordine, famiglia, genere e specie. La nomenclatura binomiale, introdotta da Carlo Linneo, assegna a ogni organismo un nome scientifico composto da due parti: il genere e la specie (es. Homo sapiens).

2) Descrivi il concetto biologico di holobionte

Il termine holobionte si riferisce a un organismo ospite e ai microrganismi che vivono in simbiosi con esso. Un holobionte è quindi costituito dall’insieme delle cellule eucariotiche dell’ospite e dalle cellule microbiche (batteri, virus, funghi) che convivono in simbiosi con l’organismo. L’essere umano, ad esempio, è un holobionte poiché oltre alle cellule umane, ospita un ampio numero di microrganismi che influenzano molte funzioni biologiche. L’interazione tra l’ospite e il microbiota è dinamica e influenza processi come la digestione, l’immunità e il metabolismo.

3) Spiega la differenza tra la definizione di «microbiota» e «microbioma»

• Microbiota: è l’insieme di tutte le cellule microbiche che colonizzano un ambiente specifico. Nel corpo umano, il microbiota comprende i batteri, funghi, virus e altri microrganismi che vivono in specifiche nicchie (es. intestino, bocca, pelle).
• Microbioma: è un concetto più ampio che comprende non solo i microrganismi stessi (il microbiota), ma anche l’habitat in cui vivono, le molecole che producono, i loro genomi e le interazioni con l’ambiente circostante. Il microbioma, quindi, rappresenta l’intero “teatro di attività” dei microrganismi in un determinato ecosistema.

4) Descrivi le differenze tra culturomica e metagenomica

• Culturomica: è l’approccio che si basa sulla coltivazione dei microrganismi in laboratorio. I campioni vengono seminati su terreni di coltura specifici per isolare le colonie batteriche. Questo metodo permette di studiare il comportamento e le caratteristiche dei microrganismi coltivabili, ma ha il limite che solo circa l’1% dei microrganismi presenti in un campione è coltivabile.
• Metagenomica: non richiede la coltivazione dei microrganismi. Invece, si estrae il DNA direttamente dai campioni ambientali e lo si sequenzia, ottenendo informazioni sull’intera comunità microbica, compresi i microrganismi non coltivabili. La metagenomica fornisce una visione più completa della diversità microbica, ma non consente di studiare i microrganismi in modo isolato come la culturomica.

5) Spiega cosa è il 16S rRNA gene e a quale scopo viene utilizzato nello studio del microbiota

Il gene 16S rRNA è una porzione del DNA che si trova nei procarioti (batteri e archei) ed è altamente conservata nelle varie specie batteriche, ma con regioni variabili che permettono di distinguere le diverse specie. Questo gene è usato per l’identificazione tassonomica dei batteri perché contiene sia regioni conservate, utili per progettare primer universali, sia regioni ipervariabili che fungono da “impronta digitale” per identificare generi e specie specifiche. Nello studio del microbiota, il gene 16S rRNA viene sequenziato per determinare la composizione microbica di un campione, identificando le diverse specie batteriche presenti senza la necessità di coltivarle.

Lezione 2. Sequenziamento

Il sequenziamento in biologia si riferisce alla determinazione dell’ordine preciso delle subunità di una macromolecola, come il DNA. In pratica, si analizza il genoma per identificare l’ordine delle basi azotate che compongono la sequenza nucleotidica. Questo processo è essenziale in numerose aree della biologia, dalla microbiologia alla medicina genomica, per identificare organismi, comprendere il funzionamento genetico e studiare le mutazioni.

Esistono diversi tipi di sequenziamento, che si distinguono per tecnologia, accuratezza, lunghezza delle sequenze ottenute e costo. Le tecnologie principali possono essere suddivise in tre generazioni.

Principali tipi di sequenziamento

1. Sequenziamento di prima generazione, approccio classico (Sanger)

• Fornisce 700-900 paia di basi per ogni ciclo di sequenziamento.
• È il metodo più antico e ha rivoluzionato la biologia molecolare, ma oggi viene usato solo per applicazioni specifiche, come il sequenziamento di singoli geni o piccole regioni del genoma.

2. Sequenziamento di seconda generazione (es. Illumina, Pyrosequencing, Ion Torrent)

• Produce 150-400 paia di basi per ciclo, con una tecnologia più avanzata che consente di sequenziare simultaneamente più frammenti di DNA (parallelizzazione).
• È più economico rispetto alla terza generazione ed è attualmente il metodo più utilizzato.

3. Sequenziamento di terza generazione (es. PacBio, Nanopore)

• Permette di ottenere letture molto più lunghe (10-30 kbp), coprendo grandi porzioni di genoma in un unico ciclo.
• Questa tecnologia, sebbene costosa, è molto utile per sequenziare genomi complessi e risolvere problemi come le sequenze ripetute e le lacune nel sequenziamento.

Costo: le tecnologie di sequenziamento di prima e seconda generazione sono relativamente economiche (decine di euro per un campione), mentre quelle di terza generazione possono costare diverse centinaia o addirittura migliaia di euro.

Sequenziamento di prima generazione: Metodo Sanger

Il metodo Sanger è il sequenziamento “classico” e si basa su una reazione di terminazione della catena.

Prevede di creare una popolazione di frammenti di diversa lunghezza del DNA da sequenziare. Questi frammenti sono poi separati in base al peso, con un procedimento chiamato elettroforesi, e la sequenza è ricostruita sapendo che ciascun segmento si interrompe dove si trova un nucleotide noto.

Viene utilizzata una miscela, in una provetta, contenente:

• Primer
• Polimerasi
• Nucleotidi
• Nucleotidi terminatori (ddNTPs) marcati con fluorocromi diversi per ciascuno dei 4

I nucleotidi terminatori differiscono dai normali nucleotidi in quanto mancano dell’ossidrile 3’, il che impedisce la formazione del legame fosfodiesterico, interrompendo così la sintesi del DNA. Poiché ogni terminatore è marcato con un fluorocromo di un colore diverso, si può determinare l’ultima base aggiunta.

Dopo aver effettuato la PCR di sequenziamento, si procede con elettroforesi capillare, per mettere in ordine:

• Dopo la reazione, i frammenti vengono separati in base alla lunghezza tramite elettroforesi capillare.
• Un laser rileva la fluorescenza prodotta dai diversi terminatori e, tramite la posizione e il colore, viene determinata la sequenza di basi del DNA.

Questo metodo fornisce sequenze precise ma relativamente corte.

Sequenziamento di seconda generazione: Illumina

Il sequenziamento di seconda generazione ha introdotto l’idea della parallelizzazione: migliaia di frammenti di DNA vengono sequenziati contemporaneamente, aumentando drasticamente la velocità e la quantità di dati prodotti.

Viene utilizzato un supporto solido al quale le sequenze di ssDNA (denaturato) si legano grazie a sequenze specifiche chiamate adapters; la detection usa fluorofori.

Procedura:

1. Il DNA viene frammentato e le sequenze di DNA singolo filamento (ssDNA) vengono legate a un supporto solido grazie a sequenze adattatrici chiamate adapters.
2. Gli adapters sul supporto solido si legano a quelli sul DNA, formando ponti. Questo ciclo continua creando delle “isole” di cloni che vengono poi sequenziati.
3. Vengono utilizzati fluorofori per identificare le basi aggiunte, come nel metodo Sanger, ma con un sistema automatizzato che legge rapidamente centinaia di migliaia di frammenti.

Errore e qualità:

• Durante il sequenziamento possono verificarsi errori nell’accoppiamento delle basi. Ogni base sequenziata viene valutata per la qualità, generando un grafico che permette di individuare le posizioni con dati dubbi (nucleotidi di cui non si è certi). In questi casi, l’analisi successiva potrebbe restituire informazioni imprecise.

La seconda generazione è più economica rispetto alla terza, ma può generare difficoltà nel distinguere batteri con sequenze molto simili.

Sequenziamento di terza generazione: Nanopore

Il Nanopore sequencing rappresenta la tecnologia di terza generazione e permette di leggere sequenze molto lunghe, monitorando il passaggio del DNA attraverso un poro molecolare. Man mano che i nucleotidi attraversano il poro, vengono registrate variazioni di amperaggio. Il cambiamento del voltaggio aiuta a determinare quale base (A, T, C o G) sta attraversando il poro in quel momento.

Vantaggi:

• Sequenze molto lunghe senza interruzioni.
• Capacità di leggere genomi completi con meno gap rispetto alle tecnologie precedenti.

Chiusura dei gap:

• Nel caso in cui il sequenziamento non sia completo, si possono utilizzare genomi di riferimento simili per colmare le lacune.
• A volte, vengono introdotte scar sequences (sequenze standard) che facilitano la chiusura delle lacune nel genoma.

Ques