Appunti di Nanotossicologia

Nanotossicologia

Lezione 1

Definizione di nanotossicologia: branca della medicina che studia gli effetti avversi dei nanomateriali sulla salute umana.

Definizione di nanoecotossicologia: studia gli effetti del rilascio dei nanomateriali nell'ambiente.

Alcuni esempi di nanomateriali

• Nanomateriali a base di C: fullereni, grafene, nanotubi di carbonio.
• TiO2 (diossido di titano): utilizzato soprattutto nella carta, plastica, cibo, medicine, cosmetici e creme solari perché assorbe radiazioni nell'UV.
• Ag: utilizzato in molte applicazioni mediche sfruttando le proprietà antimicrobiche, antibatteriche e antifungine, utilizzato ad esempio nei vestiti.

Lezione 2

Classificazione dei nanomateriali

• Nanomateriali naturali: nanomateriali derivati da processi naturali generati ad esempio dalla combustione (incendi boschivi, emissioni vulcaniche).
• Nanomateriali accidentali: nanomateriali prodotti come sottoprodotto derivante da un processo (combustibili, emissioni industriali, traffico veicolare).
• Nanomateriali ingegnerizzati (artificiali): materiali fabbricati appositamente con struttura tra 1-100 nm (calzini, vestiti, racchetta da tennis).

Definizioni di nanomateriali

La definizione generale di nanomateriali è: i nanomateriali sono normalmente definiti come particelle più piccole di 100 nm, o che abbiano una dimensione compresa tra 1 e 100 nm.

A seconda del ramo scientifico il particolato atmosferico è definito diversamente:

• In ambito di scienze ambientali il particolato atmosferico è classificato in: particelle ultrafini (diametro <0,1 micron), particelle d'accumulo (diametro compreso tra 0,1- 2,5 micron) e grossolane (diametro >2,5 micron).
• In ambito di scienze sanitarie e epidemiologiche il particolato atmosferico è classificato in PM che presenta un pedice che indica la dimensione, se ha componenti con diametri inferiori a 10 micron è abbreviato con PM10, il PM2,5 è chiamato generalmente polveri fini, mentre il PM1 polveri ultrafini. Le particelle di diametro inferiore a 10 µm costituiscono la frazione inalabile in grado di raggiungere l'area broncotracheale, mentre le particelle di diametro inferiore a 2,5 µm costituiscono la frazione respirabile e sono in grado di raggiungere gli alveoli polmonari veicolando nell'organismo le sostanze delle quali sono composte.

La nanotossicologia si occupa dell'effetto dei nanomateriali ingegnerizzati sulla salute umana. Nel caso di nanoparticelle ingegnerizzate il riscontro di numerose proprietà chimico-fisiche connesse alla loro dimensione ha richiamato l'attenzione del mondo scientifico per eventuali effetti sulla salute; ciò ha portato alla nascita della nanotossicologia ovvero della disciplina che si occupa dello studio delle interazioni delle nanostrutture con i sistemi biologici.

La caratteristica più importante delle nanoparticelle metalliche sono le proprietà ottiche fortemente dipendenti dalla dimensione e dalla forma, questo dipende dall'interazione con la luce.

Microscopia a scansione di sonda

Microscopia a scansione di sonda (STM e AFM) permettono di conoscere la materia nanometrica:

• STM (microscopio a scansione ad effetto tunnel): questa tecnica consiste in un tip, ovvero una punta costituita da pochi atomi, che viene spostata lungo le tre dimensioni dell'oggetto che si vuole studiare. La condizione necessaria per utilizzare questa tecnica è che la superficie dell'oggetto sia conduttiva, in quel caso si osserva l'instaurarsi di una corrente grazie alla quale è possibile avere una valutazione della conformazione della superficie. Questa tecnica si basa sul principio dell'effetto di tunnel quantomeccanico che si verifica quando si applica una piccola tensione di polarizzazione (da mV fino a 3V) tra il tip ed un campione conduttore e la punta è posizionata ad alcuni nanometri dalla superficie.

L'intensità della corrente di tunnel è data da:

V = tensione di polarizzazione

C = termine costante

d = distanza tra sonda e superficie

L'equazione della corrente di tunneling ci dice che la corrente di tunnel diminuisce esponenzialmente con la separazione tra la punta ed il campione.

L'STM può funzionare in due modi:

• Modo ad altezza costante: in cui la posizione della punta viene mantenuta costante in direzione z, mentre viene monitorata la corrente di tunnel.
• Modo a corrente costante, in cui viene mantenuta costante la corrente di tunnel mentre la posizione z della punta varia per mantenere costante d. In questo caso si monitora la posizione z della punta. Il movimento in su e giù della punta riflette quindi la topografia della superficie.

La punta è connessa ad un trasduttore piezoelettrico che ne regola la distanza dal campione e la flessione laterale. La piezoelettricità è la proprietà di alcuni materiali cristallini di polarizzarsi quando sono soggetti a una deformazione meccanica e di deformarsi in maniera reversibile quando sono sottoposti ad una tensione elettrica (utilizzato per l'STM). La punta è connessa ad un trasduttore piezoelettrico a tubo cavo e può quindi essere mossa nelle tre dimensioni applicando le opportune tensioni.

• AFM (microscopia a forza atomica): questa tecnica si utilizza quando la superficie del campione è isolante, non si studia più la corrente ma le forze attrattive e repulsive che si instaurano tra gli elettroni della superficie del campione e del tip. La misura avviene puntando sul tip una luce laser che viene riflessa e incide un fotodetector, le variazioni che vengono misurate sono le variazioni che coincidono con il movimento del tip, vengono poi studiate con strumenti ottici e conseguentemente viene ricreata un'immagine della superficie.

Si usano comunemente tre modalità di misure AFM:

• A contatto: il tip è a contatto costante con la superficie del campione -> possibili danni alla punta o al campione.
• A picchettamento (tapping): il cantilever è posizionato in modo tale che la punta tocchi la superficie solo quando si trova nella parte più bassa di ogni ciclo di oscillazione.
• Senza contatto: le forze di attrazione di van der Waals tra la punta ed il campione sono messe in evidenza man mano che la punta si muove lungo la superficie. Queste forze sono sostanzialmente più deboli di quelle che vengono rivelate nella modalità a contatto, di conseguenza la punta viene fatta oscillare e si utilizzano tecniche di rivelazione a corrente alternata per cogliere i bassi segnali.

La superficie del tip può essere modificata chimicamente con gruppi funzionali in modo da renderla selettiva per alcune zone. Queste tecniche hanno consentito non solo lo studio della materia ma anche la sua manipolazione.

Lezione 3

Il carbonio è un elemento chiave per la vita, è nel DNA, nelle proteine, in grassi e nei carboidrati, circa il 20% del corpo umano è costituito da carbonio. Fino agli anni 80 si conoscevano solo 2 forme allotropiche del carbonio: il diamante e la grafite, hanno proprietà completamente diverse e questo deriva dalla diversa ibridazione che conferisce le loro caratteristiche chimico-fisiche.

Le proprietà fisiche, chimiche ed elettroniche dei nanomateriali a base di carbonio sono fortemente dipendenti dalla conformazione strutturale del carbonio e, quindi, dal suo stato di ibridazione, a seconda dei legami con gli atomi vicini il carbonio può ibridarsi in una configurazione sp, sp2 o sp3.

Nanomateriali a base di carbonio

Vediamo ora alcuni nanomateriali a base di carbonio:

• I fullereni sono aggregati di atomi di C, ogni atomo di carbonio nel C60 è circondato da altri 3 ibridizzato sp2. La curvatura tipica della struttura C60 porta a delle ibridazioni che sono simili a quelle sp3, si parla di una parziale ibridazione sp3 rispetto alla dominante sp2. La struttura elettronica dei fullereni determina le loro proprietà chimiche, ottiche e strutturali uniche.
• I nanotubi di carbonio sono formati da un foglio di grafene arrotolato su se stesso, hanno il diametro nella nanoscala e a seconda di come il sistema si arrotola si hanno ibridazioni e caratteristiche diverse, possono essere molto lunghi. Gli atomi di carbonio hanno un'ibridazione sp2 deformata e ciò conferisce ai nanotubi maggiore resistenza meccanica, conducibilità termica ed elettrica, oltre alla capacità di essere chimicamente attivi. I nanotubi possono essere a parete singola o anche a parete multipla:
  • Single Wall CNT (SWCNT) sono costituiti da un singolo foglio di grafite cilindrico, sono una singola grande molecola.
  • Multi Wall CNT (MWCNT) sono costituiti da una serie di fogli arrotolati su se stessi comprendono diverse decine di cilindri concentrici di strati grafiti, i diametri hanno dimensione compresa tra 2 e 100 nm, sono un sistema granitico alla mesoscala.
• Il grafene è un foglio bidimensionale dello spessore di un atomo di carbonio composto da atomi di carbonio legati con ibridazione sp2 che sono densamente impilati in un reticolo cristallino a nido d'ape. La sua struttura a nido d'ape è l'elemento costitutivo di base di altri importanti allotropi del carbonio, un foglio di grafene può essere avvolto per formare fullereni e nanotubi di carbonio e grafite tridimensionale (se impilato). Il grafene è un conduttore e interagisce con la luce.

Produzione di materiali nanostrutturati

Per la produzione di materiali nanostrutturati si possono utilizzare due tecniche:

• Top-Down: approccio fisico basato sul miniaturizzare i materiali bulk fino alla nanoscala, un esempio sono le tecniche litografiche.
• Bottom-Up: approccio chimico in cui si cerca di agire sulle caratteristiche chimiche di atomi e molecole, usando sintesi chimiche.

Alcuni dei materiali ingegnerizzati più impiegati per varie applicazioni incluse applicazioni biomedicali, diagnostiche e in nanomedicina sono: fullereni, CNT, grafene, carbon black, SiO2, TiO2, ZnO, quantum dots, Au, Ag, SPION, polimeri, polisaccaridi e liposomi.

• SiO2 mesoporosa (silice) è una classe di setacci molecolari porosi ordinati caratterizzati da disposizioni periodiche di mesopori di dimensioni uniformi (diametro da 2 a 50 nm) all'interno di una matrice di silice amorfa, è utilizzata nell'industria petrolifera, in cosmetiche e in medicina perché è in grado di intrappolare i farmaci o altro all'interno dei pori che permettono il loro rilascio in risposta a degli stimoli.
• I quantum dots sono nanoparticelle di materiali semiconduttori, come ad esempio il silicio, possono differire nella radiazione assorbita ed emessa a seconda delle loro dimensioni. Le loro proprietà ottiche dipendono fortemente dalla dimensione e dalla forma delle particelle, questi effetti sono il risultato di cambiamenti nella cosiddetta risonanza plasmonica di superficie.
• Gli ossidi di ferro sono composti naturali comuni e possono anche essere facilmente sintetizzati in laboratorio, sono il risultato di reazioni acquose in varie condizioni redox e di pH. Un'importante proprietà che hanno è quella di essere superparamagnetiche.

In ambiente biomedico, cosmetico e alimentare sono impiegati molteplici nanomateriali a base di materia organica come lipidi, polimeri e polisaccaridi, ne vediamo alcuni:

• I dendrimeri sono strutture polimeriche iper-ramificate, sono molecole grandi e complesse con strutture molto ben definite. La struttura è sempre costruita attorno ad una molecola centrale multifunzionale e questa struttura estremamente regolare contribuisce alla sua forma, sono utilizzati come vettori di un principio attivo.
• I liposomi sono piccole vescicole sferiche a base di fosfolipidi, grazie alle loro dimensioni, al carattere idrofilo e idrofobo e alla biocompatibilità sono impiegati per il trasporto di principi attivi al loro interno. Le loro proprietà dipendono dalla composizione lipidica, dalla carica superficiale, dalle dimensioni e dal metodo di preparazione.

DNA e nanotecnologie

Tutti i materiali organici e inorganici visti fino ad ora derivano da processi sintetici ben definiti, a partire dagli anni 2000 questa tipologia di materiali si è associata ad un'altra che parte dell'impiego di molecole naturali (biomolecole) come acidi nucleici e proteine, vengono utilizzate le biotecnologie per ottenere nanomateriali.

Vediamo intanto cosa sono le molecole naturali utilizzate:

• DNA è la molecola informazionale delle cellule, essa contiene e trasmette le informazioni necessarie al corretto funzionamento della cellula e dell'intero organismo. Il DNA è una doppia elica ed ha due filamenti antiparalleli, uno in direzione 5'-3', altro dalla direzione 3' a 5'. I nucleotidi in ciascun filamento sono connessi l'un l'altro attraverso legami esterni. Il pentoso nel DNA è il desossiribosio a cui manca un ossigeno nella posizione C-2 rispetto al ribosio. Le due catene sono legate tra loro tramite legami a H tra le basi azotate (adenina con timina e guanina con citosina).
• RNA differisce dal DNA per una base azotata (al posto della timina c'è l'uracile) e per lo zucchero ovvero il ribosio, inoltre ha una struttura a singolo filamento che si arrotola su se stessa formando strutture più complesse a doppia elica (ripiegamento a forcina, gemma ed ansa). Esistono diversi tipi di RNA, tutti a singolo filamento, che hanno funzioni differenti:
  • RNA messaggero (mRNA) che porta il messaggio genetico.
  • RNA transfer (tRNA) adattatore fra i codoni dell'mRNA e amminoacidi.
  • RNA ribosomiale (rRNA) componente strutturale dei ribosomi.
  • Ribozimi: molecole di RNA capaci di generare strutture 3D che hanno funzione catalitica.

La capacità dell'RNA (e anche del DNA) di riavvolgersi su se stesso può essere sfruttata da un punto di vista sintetico, in laboratorio si possono sintetizzare molecole di RNA di una certa lunghezza con una certa sequenza o a sequenza casuale, fra quest'ultime è possibile selezionare alcune sequenze che presentano particolari proprietà come ad esempio sono in grado di assumere particolari strutture 3D capaci di legare substrati ed avere attività catalitica, simile a quella degli enzimi proteici.

Per questo motivo, recentemente, gli acidi nucleici (NA) e in particolare il DNA (poiché, rispetto al RNA, le molecole di DNA sono meno suscettibili all'idrolisi e quindi sono più stabili) hanno trovato un nuovo ruolo nel campo della scienza dei materiali, delle nanotecnologie e delle biotecnologie.

• Tecnologie che sfruttano le caratteristiche funzionali degli acidi nucleici.
• Tecnologie che sfruttano le caratteristiche strutturali degli acidi nucleici.

Caratteristiche funzionali degli acidi nucleici

In laboratorio si possono sintetizzare filamenti di DNA e RNA di diverse lunghezze che portano a strutture secondarie e terziarie conferendo particolari funzioni.

• Aptameri: sono oligonucleotidi di DNA o RNA a filamento singolo che adottano strutture tridimensionali stabili dipendenti dalla sequenza. Tramite dei processi di biologia molecolare evolutiva si possono selezionare dei frammenti di DNA che riavvolgendosi formano delle strutture che hanno maggiore affinità per alcune molecole come proteine o altro, quei filamenti che interagiscono vengono raccolti e amplificati e successivamente rimessi a contatto con la molecola con cui hanno affinità, nuovamente vengono selezionati quelli che interagiscono maggiormente, questa tecnica è chiamata SELEX. Gli aptameri possono essere considerati degli anticorpi sintetici, è molto più conveniente sintetizzare gli aptameri invece che produrre anticorpi perché la loro sintesi non richiede l'utilizzo di animali, si ha un'alta resa di sintesi, si ottengono aptameri molto stabili.
• DNA zyme e RNAzyme: sono delle sequenze di DNA che hanno attività catalitiche simili ai ribozimi.

Caratteristiche strutturali degli acidi nucleici

I parametri più importanti per sfruttare la struttura degli acidi nucleici sono i legami a idrogeno, la stereochimica della molecola di DNA e la termodinamica, con queste tecniche le molecole di DNA vengono viste come mattoni con cui costruire delle strutture, una di queste tecniche è la DNA origami con cui sono stati sintetizzati nanotubi a DNA.

• DNA origami: è una tecnica di autoassemblaggio del DNA mediante la quale strutture complicate del DNA vengono facilmente e accuratamente assemblate.

Lezione 4

I nanomateriali possono essere descritti in base alle loro caratteristiche che si possono suddividere in caratteristiche chimico-fisiche e caratteristiche strutturali.

Caratteristiche chimico-fisiche

I materiali nanostrutturati hanno proprietà uniche che sono molto diverse sia da quelle dello stesso materiale bulk sia da quelle degli atomi isolati, si definiscono effetti di dimensione (size effects) ed effetti di superficie (surface effects). La meccanica classica non è adeguata per descrivere oggetti molto piccoli nella nanoscala ed oggetto molto veloci vicino alla velocità della luce, per questo motivo vengono descritti dalla meccanica quantistica.

• Effetti di dimensione:

Un solido Bulk si può suddividere in conduttore, semiconduttore ed isolante, quello che differenzia i tre è il band gap ovvero l'energia necessaria da fornire per poter far passare un elettrone dalla banda di valenza alla banda di conduzione, nei conduttori il gap non c'è, nei semiconduttori è molto piccolo quindi fornendo energia possono diventare conduttori mentre negli isolanti è molto grande.

Quando si passa a materiali semiconduttori nella nanoscala valgono le leggi della fisica quantistica e quindi ci sono dei livelli energetici discreti e non è più presente un continuo di energia come nella nanoscala. Questi livelli energetici sono proporzionali alla dimensione del materiale, variando le dimensioni del materiale si ha un'ampia possibilità di interazione con la radiazione elettromagnetica. L'energia di band gap aumenta al diminuire delle dimensioni del materiale semiconduttore. Il fatto che nella nanoscala i livelli energetici siano discreti influenza anche i conduttori che a livello nanometrico diventano semiconduttori perché il band gap aumenta.

Il band gap.