Appunti di Microbiologia

Lezione 1 ✅

martedì 21 settembre 2021 10:45

La microbiologia studia i microrganismi.

Leeuwenhoek, commerciante di tessuti, iniziò a osservarli al microscopio (1677) per

verificarne la bontà. Nel 1685 comunica alla British Royal Society di aver notato

qualcosa, dei microrganismi dalla vita autonoma, ma non venne considerato.

Esperimento di Spallanzani

Spallanzani prova la confutazione della generazione spontanea dei microrganismi.

Ha riempito due beute con un infuso di carne e l'ha bollito per due ore in modo da

eliminare i microrganismi; successivamente lasciò una beuta aperta e l'altra la chiuse

e osservò che a distanza di tempo nella beuta aperta si verificava intorbidimento

mentre in quella chiusa no.

Dal momento che l'intorbidimento è un metodo per constatare la proliferazione

microbica, Spallanzani credeva di aver dimostrato definitivamente che la

generazione spontanea non fosse possibile e che l'intorbidimento nella beuta aperta

fosse semplicemente dovuto alla contaminazione con l'esterno da dove provenivano

i microbi. Nonostante ciò gli esperimenti di Spallanzani non vennero considerati

validi perché nelle beute sigillate con infuso bollito non era presente ossigeno

gassoso il quale è essenziale per gli organismi viventi come dimostrato da Lavoisier,

dunque la sua assenza avrebbe impedito a prescindere la generazione spontanea.

Correzioni all'esperimento di Spallanzani

Schroder e von Dusch escogitano un metodo per ovviare all'assenza di ossigeno

garantendo il passaggio di aria filtrata da ovatta attraverso un tubo in modo da

evitare l'accesso di microrganismi.

Neanche con questo escogito l'esperimento fu considerato valido perché si riteneva

che il sistema di filtraggio modificava l'aria in qualche modo e non erano garantite le

condizioni favorevoli per la crescita microbica.

Pasteur (1864) dimostra che i microrganismi sono presenti nell'aria. Fine della

teoria della generazione spontanea.

Koch (1878) dimostra l'eziologia microbica del carbonchio: è causata da Bacillus

anthracis.

Esperimento di Pasteur

Si utilizza una beuta col collo modificato, detto a collo di cigno, che viene riempita

con brodo di carne (non di cigno!! LOL), viene sterilizzato e rimane a contatto con

l'ambiente esterno. Il collo piegato impedisce ai microrganismi esterni di

raggiungere l'ambiente di esperimento, infatti si accumulano nella prima ansa

creata appositamente. Se poi successivamente si inclina il contenitore (o si rompe il

collo) in modo da mettere in contatto il liquido con i microrganismi, si verifica la

crescita microbica nell'infuso di carne.

Il problema delle spore batteriche

Per uccidere le spore batteriche non è sufficiente la bollitura, quindi Pasteur è stato

fortunato nella realizzazione del suo esperimento. L'unico modo per uccidere le

spore è utilizzare una temperatura di 121 °C. Successivamente sono state introdotte

le autoclavi che utilizzano vapore acqueo a temperatura di 121 °C per 30 minuti

e a pressione 1 atm.

Semmelweis aveva intuito la trasmissibilità indiretta dei microrganismi

dall'ambiente all'uomo anche se non fu creduto. La sua intuizione si basava sui casi

di morti di madri nell'immediatezza del parto che venivano assistite da medici che

poco prima avevano condotto autopsie e successivamente non si lavavano le mani.

Malattie contagiose e eziologia

Robert Koch: scoperta dell'eziologia microbica delle malattie contagiose:

Scoprì il carbonchio che è una malattia infettiva causata dal batterio Bacillus

• anthracis (oggi è considerato agente bioterroristico di classe A).

1. Prelevò del sangue da un animale malato;

2. Lo seminò in un brodo nutriente in vitro;

3. Infettò un animale sano;

4. Isolò nuovamente il microrganismo dal secondo animale.

Microbiologia Pagina 1

4. Isolò nuovamente il microrganismo dal secondo animale.

Scoprì la tubercolosi che è una malattia infettiva causata dal batterio

• Mycobacterium tuberculosis.

1. Prelevò dell'espettorato da un individuo ammalato

2. Seminò l'espettorato su una fetta di patata con bile e glicerina

3. Le colonie isolate vennero essiccate e polverizzate e usate per infettare le

cavie per via aerogena

4. Diagnosticò la stessa malattia anche nelle cavie isolando il batterio.

Robert Koch e i terreni solidi

I postulati di Koch (1881)

I postulati di Koch servono per spiegare l'eziologia microbica, cioè per associare il

microrganismo alla malattia che genera.

1. L'agente causale deve essere presente in tutti gli individui malati e assente in

quelli sani.

2. L'agente causale deve essere isolato dal soggetto malato e in coltura deve dare

origine a delle colonie omogenee (pure, con soltanto quell'agente presente).

3. L'inoculazione di una coltura pura dell'agente causale in individui sani deve

dare luogo alla comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.

4. L'agente causale deve essere re-isolato dall'organismo infettato

sperimentalmente.

Se sono soddisfatti tutti i postulati, si può associare la malattia all'agente patogeno

imputato.

I postulati di Koch molecolari

1. Tutti i ceppi patogeni hanno il gene che codifica per una molecola che è un

fattore di virulenza, che è importante per la patogenesi della malattia;

2. Inattivando il gene in un ceppo mutante, il microrganismo deve perdere la

virulenza;

3. L'introduzione del gene in questione in un ceppo non patogeno lo trasforma in

patogeno.

Note

La peste è causata dal batterio Yersinia pestis, tipico del ratto e portato all'uomo

• tramite la pulce.

Il genere si scrive con la maiuscola, la specie tutta in minuscolo.

• Microbiologia Pagina 2

Lezione 2 ✅

martedì 28 settembre 2021 10:35

Perché si usa la parola vaccino?

La scelta del termine è stata fatta da Pasteur che volle onorare Jenner il quale eseguì la prima

vaccinazione della storia contro il vaiolo (agente eziologico: Variola major), una malattia che colpiva

l'uomo in forma grave, spesso letale, e i bovini in forma moderata i quali presentavano una

sintomatologia diversa. Le mungitrici che accudivano bovini infettati dal Variola major riportavano

spesso delle lesioni alle mani e una sintomatologia più lieve rispetto ai casi di vaiolo umano con

decorso della malattia molto spesso favorevole. Sulla base di quanto osservato Jenner ipotizzò che

far prendere il vaiolo bovino a un essere umano potesse conferire un'immunità verso il vaiolo

umano. Per verificare che la sua ipotesi fosse corretta somministrò il vaccino al figlio di un

giardiniere e successivamente lo espose al vaiolo umano: il bambino sviluppò una forma lieve di

vaiolo e non morì, come previsto dall'ipotesi di Jenner.

Esperimento di Pasteur con il colera dei polli

Pasteur sulla base dell'esperimento di Jenner condusse degli studi sul colera dei polli:

Propagò in vitro l'agente eziologico Pasteurella septica;

- Casualmente inoculò vecchie colture del virus in animali che non si ammalarono ma che

- svilupparono una risposta immunitaria protettiva;

Successivamente somministrò agli stessi animali l'agente eziologico da colture fresche e non si

- ammalarono, cosa che invece accadde in altri animali che non erano stati trattati in precedenza

con le vecchie colture.

Pasteur comprese al termine degli studi l'importanza di aver utilizzato delle colture vecchie con

l'agente eziologico attenuato nella virulenza il quale non causava la malattia ma era comunque

capace di sviluppare una risposta immunitaria nell'organismo infetto.

Il vaccino contro il carbonchio

Con la stessa logica Pasteur produsse anche il primo vaccino contro il carbonchio: sottopose ad un

processo di attenuazione l'agente eziologico Bacillus anthracis, ovvero espose le colture a una

temperatura di 44 °C, eliminando il fattore di virulenza di questo batterio, cioè la capsula che lo

protegge.

La microbiologia ebbe un forte impatto positivo sull'umanità aumentando la speranza di vita

notevolmente.

Oggi la microbiologia si diversifica in

Microbiologia medica

- Fisiologia microbica

- Ecologia microbica

- Biotecnologie microbiche

-

Classificazione Microbiologia Pagina 3

Eubatteri (batteri propriamente detti), Archea (procarioti molto diversi dagli eubatteri), Eucarioti.

I procarioti vengono divisi in archeobatteri ed eubatteri.

Solo una piccola parte è patogena, un numero esorbitante è sempre presente anche negli esseri

umani con anche effetti benefici.

Hanno una grandissima varietà metabolica e vengono isolati da qualsiasi nicchia ecologica

( …)

La cellula

Caratteristica Bacteria Archea Eukarya

Dimensione 0,2- μ μ 10-2 μ

Membrana nucleare - - +

Ribosomi 70 S 70 S 80 S

Crescita a T > 80 °C + + -

Crescita a T > 100 °C - + -

Morfologia batterica

I batteri vengono classificati in base alla morfologia

Cocchi: forma sferica, generalmente immobili (no flagelli), possono essere classificati per

- come si distribuiscono nello spazio (streptococchi e stafilococchi)

Bastoncelli o bacilli: forma allungata.

-

Dunque il metodo con cui si sviluppano nello spazio è un criterio tassonomico, cioè sono suddivisi in

base a come si sviluppano nello spazio.

I batteri si riproducono per scissione binaria, le cellule figlie sono cloni perfetti.

Cocchi

I cocchi che si dividono secondo un solo asse di divisione porta a due disposizioni:

➢ Diplococchi: uniti a due a due

- Microbiologia Pagina 4

Cocchi

I cocchi che si dividono secondo un solo asse di divisione porta a due disposizioni:

➢ Diplococchi: uniti a due a due

- Streptococchi: più cocchi uniti in sequenza (catena)

-

I cocchi che hanno la divisione cellulare secondo due assi perpendicolari:

➢ Tetradi: disposizione planare a 4 cellule

- A foglio: disposizione planare a fogli monostratificati

-

Cocchi che hanno la divisione cellulare secondo tre assi:

➢ Cubi, se gli assi sono perpendicolari → si formano dei cubi di 8 cellule, queste strutture sono

- dette sarcine.

Grappoli, se gli assi non sono perpendicolari (stafilococchi) → si formano dei raggruppamenti

- irregolari di cellule.

Bastoncelli

La maggior parte dei bastoncelli sono immobili ma ce ne sono alcuni provvisti di flagelli che

permettono il movimento. Tra i bastoncelli ci sono anche quei microrganismi capaci di produrre

spora, tipica dei due generi bacillus (aerobio) e clostridium (anaerobio obbligato).

Vengono distinti in base a spessore, lunghezza, capacità di produrre spora (che può essere

deformante o non deformante, centrale o terminale) e motilità consentita dal flagello.

Tassonomia convenzionale

La tassonomia batterica convenzionale si basa su aspetti fenotipici (com'è fatta la cellula e la

colonia, caratteristiche, vie metaboliche, quali zuccheri fermenta).

La propagazione dei batteri è clonale (scissione binaria: due cellule figlie identiche alla cellula

madre)

Una specie batterica è definita come un insieme di ceppi (specie > ceppi) che condividono un

determinato fenotipo (caratteristiche principali in comune) che si mantiene stabile ed è diverso da

quello che caratterizza altri insiemi di ceppi.

La validità di questa definizione si basa sul concetto di genoma equilibrato, che favorisce il

mantenimento di specie stabili e ben adattate.

Microbiologia Pagina 5

mantenimento di specie stabili e ben adattate.

Per classificare i batteri ci si basa su caratteri fenotipici altamente conservati.

I caratteri che vengono osservati per l'identificazione della specie sono:

Morfologia cellulare

Presenza di spore

Affinità tintoriali (reazione alle colorazioni come quella di Gram per esempio)

Motilità

Forma della colonia ( …)

Suscettibilità ad antibatterici (caratteristica che si può modificare anche all'interno dei ceppi della

stessa specie)

Habitat

Sequenze geno-specifiche

Identificazione di tipo (intraspecifica, cioè ceppi), tramite:

Sierotipizzazione

Biotipizzazione

Tipo di colonia

Genotipizzazione

Colorazione di Gram

È una colorazione differenziale, cioè utilizza due coloranti differenti: uno primario e uno di

contrasto.

1. Si procede con la fissazione del batterio: si fa asciugare e fissare col calore.

2. Si colora col colore primario, cristalvioletto, (per 1 minuto) e si aggiunge una soluzione

mordenzante a base di iodio (per 1 minuto) dove lo iodio crea dei complessi che rendono la

molecola più grande

3. Si effettua la decolorazione con alcol per 15-20 secondi e si sciacqua con acqua

4. Si aggiunge il colorante di contrasto, la safranina, che conferisce un colore rosa ai batteri

gram-negativi.

Il decolorante agisce solo sui batteri gram-negativi. Nello specifico l'alcol fa aprire bene i pori sulla

parete e favorisce l'uscita del colorante applicato.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Colorazione differenziale

Esistono dei batteri che non rispondono alla colorazione di Gram e sono comunque di rilevante

importanza dal punto di vista clinico, questi batteri appartengono alla specie Mycobacterium che ha

una parete che non è né gram positiva né gram negativa, rivestita da cere e lipidi quindi fortemente

idrofobica e difficile da colorare. Si comincia fissando il campione sul vetrino e si tratta con fucsina

fenicata al calore che colora i micobatteri. Si prosegue con una decolorazione con alcol acido che

decolora eventuali altri batteri tranne i micobatteri e infine si applica la colorazione di contrato col

blu di metilene che colora tutto ciò che non è un micobatterio, poi si risciacqua con acqua.

Microbiologia Pagina 6

La complessità della parete spiega anche perché è così lenta la generazione (24 ore), per via della

difficoltà per internalizzare i nutrienti.

Per colorare i batteri con questo tipo di parete si utilizza una colorazione differenziale che deve

essere eseguita con un fenolo, la Fucsina fenicata al calore. Una volta applicato il colore si utilizza

una miscela di alcol e acido per decolorare in modo da far perdere il colore a tutto eccetto il

Mycobacterium tuberculosis, poi

si sciacqua e si applica il blu di metilene e si risciacqua con acqua.

Colorazione col blu di metilene

In alcuni casi si utilizzano colorazioni semplici come quella col blu di metilene (solo un colore, senza

il contrasto). Non è molto indicativa perché non permette di ottenere molte informazioni. Utile

quando si utilizza per vedere l'agente eziologico della difterite, Corynebacterium diphtheriae perché

all'interno ha dei grani chiamati metacromatici che diventano rossi.

Preparazioni microscopiche non colorate

I batteri si possono osservare anche senza colorazione col solo utilizzo dell'acqua (preparazioni a

fresco). Questa tecnica mette in risalto le strutture molto rifrangenti come le spore batteriche.

Classificazione dimensionale dei batteri

I batteri sono microrganismi unicellulari, procarioti, di dimensioni di pochi micron, da 2 a 30.

Microbiologia Pagina 7

Lezione 3 ✅

venerdì 1 ottobre 2021 10:38

La parete batterica

I Bacteria posseggono una parete che permette di distinguerli in Gram positivi e

Gram negativi.

La parete dei Gram negativi è composta da una vera e propria membrana di

➢ lipidi e proteine detta membrana esterna e uno strato sottile di

peptidoglicano o mureina che si trova nello spazio tra la membrana esterna e

la membrana plasmatica detto periplasma. Questa struttura complessa

rappresenta una barriera che impedisce il passaggio per diffusione di molti

composti.

La parete dei Gram positivi è composta soltanto da uno strato spesso di

➢ peptidoglicano o mureina, quindi in questo caso non vi è un vero e proprio

spazio periplasmatico anche se spesso lo spazio tra la membrana plasmatica e

il peptidoglicano prende tale nome.

Le diverse pareti possedute dai due gruppi di batteri determinano la risposta

positiva o negativa alla colorazione di Gram.

La parete batterica quindi si trova all'esterno della membrana plasmatica e la

ricopre conferendo rigidezza e forma alla cellula oltre che protezione per il

batterio da insulti fisici e chimici e dalla lisi osmotica, cioè dalla rottura della

membrana plasmatica.

Peptidoglicano

Il peptidoglicano ha una struttura rigida e reticolare formata da catene glicaniche

Microbiologia Pagina 8

Peptidoglicano

Il peptidoglicano ha una struttura rigida e reticolare formata da catene glicaniche

costituite da due zuccheri che si ripetono alternati: l'N-acetilglucosammina o NAG e

l'acido N-acetilmuramico o NAM. Questi due zuccheri sono legati tra loro tramite

β-1,4 glicosidici.

Attaccato all'acido N-acetilmuramico è presente una catena di 4 amminoacidi la cui

composizione è solitamente: L-alanina; acido D-glutammico; L-lisina (o acido

diaminopimelico DAP); D-alanina.

In oltre il NAM si differenzia dal NAG per la presenza di un residuo di acido D-lattico

(gruppo lattato) legato con legame etere al C3 del glucosio, al quale è legato il

tetrapeptide visto sopra.

I D-amminoacidi e il DAP sono sintetizzati esclusivamente per la costruzione della

mureina (i D-amm sono presenti nella capsula). In particolare i D-amminoacidi

conferiscono alcune importanti proprietà come la resistenza alle proteasi.

Le catene glianiche di NAM e NAG possono avere lunghezze differenti (da decine a

centinaia di unità) che non influiscono sullo spessore dello strato di peptidoglicano

che si viene a formare.

I filamenti adiacenti sono interconnessi tra loro tramite legami formati tra i

tetrapeptidi, detti legami transpeptidici. Di solito questo tipo di legame si forma tra

il gruppo carbossilico della D-alanina in P4 del primo tetrapeptide e il gruppo

amminico del DAP