Appunti di Metodologie di Biologia molecolare

1.ZUCCHERI E LIPIDI

INTRODUZIONE

Le principali molecole biologiche sono: zuccheri, lipidi, acidi nucleici, proteine.

I carboidrati sono zuccheri ed hanno 2 funzioni principali all’interno delle cellule:

1) FUNZIONE DI RISERVA ENERGETICA:

I carboidrati, i lipidi e le proteine sono le 3 molecole utilizzate dalle cellule per produrre energia, la

quale è necessaria per fare tutti i processi di cui la cellula ha bisogno per sopravvivere.

Lo zucchero è il carboidrato per eccellenza da cui le cellule producono energia. Una volta esaurito

questo le cellule vanno a utilizzare lipidi e proteine.

Nelle cellule vegetali la riserva energetica è invece rappresentata dall’amido.

2) FUNZIONE STRUTTURALE: nelle piante la cellulosa è la componente della parete cellulare vegetale

che dà struttura, ma questa non è presente nella cellula animale

ZUCCHERI

I carboidrati sono costituiti dalla ripetizione di n volte la seguente struttura chimica: , ovvero sono

( )

2

formati da atomi di C a cui sono legati 2 atomi di H e 1 atomo di O.

Gli atomi di C variano a seconda del tipo di zucchero:

A) 3 C (triosi): Gliceraldeide--> è lo zucchero + piccolo ed è formato da 3 atomi di C ed esiste solo nella

forma a catena lineare

B) 4 C

C) 5 C (PENTOSI): due zuccheri formati da 5 atomi di C sono il Ribosio e Desossiribosio, che possono

ciclizzare andando a formare una struttura pentagonale. Questi sono fondamentali perché sono i

componenti degli acidi nucleici (DNA e RNA). Il Ribosio e il Desossiribosio non sono isomeri.

D) 6 C (ESOSI): gli zuccheri a 6 atomi di C sono il Glucosio, Fruttosio, Galattosio e Mannosio, i quali sono

isomeri, ovvero hanno tutti la stessa formula chimica ma proprietà diverse.

Gli zuccheri possono avere una struttura lineare o ciclica e il glucosio in particolare ha una struttura esagonale.

GLUCOSIO

Il GLUCOSIO è il monosaccaride + abbondante in natura e la rottura dei legami libera energia usata dalla

cellula per le reazioni chimiche.

A seconda di come avviene la ciclizzazione del glucosio, si formano:

quando il gruppo ossidrile si trova al di sotto del

➢ − :

piano in cui è posizionato l’anello

gruppo OH sopra al piano dell’anello

➢ − :

Gli zuccheri possono essere:

MONOSACCARIDI (glucosio)

➢ DISACCARIDI: costituiti da 2 unità monosaccaridiche

➢ POLISACCARIDI (glicogeno= unione di tante molecole di glucosio)

➢

Gli zuccheri si legano tra loro attraverso legami GLICOSIDICI, in cui un gruppo

ossidrile (OH) di una molecola interagisce con un atomo di H del gruppo OH dell’altra

molecola, viene eliminata acqua e si ha la formazione del legame glicosidico.

Questo processo è detto reazione di CONDENSAZIONE, la quale permette la formazione di polisaccaridi

(allungamento della catena).

Le singole unità possono poi separarsi (accorciamento) mediante una reazione inversa, detta IDROLISI, dove

viene utilizzata una molecola d’acqua per scindere il legame glicosidico tra due zuccheri.

Dato che gli zuccheri presentano il gruppo ossidrile (OH), quando vengono messi in acqua l’atomo H si dissocia

e l’O reagisce con l’acqua, creando legami.

Quindi i carboidrati sono IDROFILI e solubili in acqua→ sono molecole POLARI

Il tessuto muscolare scheletrico e il fegato contengono una grande quantità di GLICOGENO, che rappresenta

una riserva di glucosio.

Durante un’attività fisica intensa, le cellule muscolari hanno bisogno di molta energia per permettere la

contrazione dei muscoli e per questo motivo utilizzano il glicogeno come riserva, ovvero da esso vengono

liberate molecole di glucosio, che vengono poi utilizzate per produrre energia.

Se l’esercizio fisico è molto intenso e prolungato, può arrivare meno ossigeno ai muscoli rispetto a quello

necessario e quindi si crea una situazione di ANAEROBIOSI, ovvero una condizione in cui le cellule producono

energia con una disponibilità limitata di O2. In queste condizioni il glucosio viene trasformato in ACIDO

LATTICO (LATTATO).

L’accumulo di lattato e le altre modificazioni che avvengono nel muscolo durante uno sforzo intenso

contribuiscono alla sensazione di fatica e bruciore muscolare.

LIPIDI

I lipidi sono composti soprattutto da atomi C e H e da pochi atomi O, quindi rimangono integri in soluzione

acquosa→ molecole IDROFOBE o APOLARI.

I tipi principali di lipidi sono:

1) ACIDI GRASSI:

Gli acidi grassi sono costituiti da una lunga sequenza di atomi di C a cui sono attaccati atomi di H.

in tutta la catena non ci sono atomi di O, gli unici 2 atomi di O si trovano all’estremità dell’acido grasso in un

gruppo chimico detto GRUPPO CARBOSSILICO, il quale è l’unico gruppo che conferisce un po’ di polarità e

idrofilicità alla molecola ma non sufficiente a renderla solubile.

Gli acidi grassi possono essere:

SATURI: gli atomi di C sono legati tra loro tramite legami semplici e hanno una struttura lineare

➢ INSATURI: contengono 1 o + doppi legami e la struttura non è lineare ma si incurva nel punto in cui c’è il

➢ doppio legame.

2) TRIGLICERIDI:

I trigliceridi sono un tipo di lipide formato da una molecola detta

GLICEROLO, il quale si lega a 3 acidi grassi grazie alla presenza di 3

gruppi OH che reagiscono con gli OH degli acidi grassi (legame

estere).

I trigliceridi sono lipidi che si trovano negli adipociti (cellule del tessuto adiposo) e sono i LIPIDI DI RISERVA,

ovvero costituiscono la principale riserva energetica lipidica dell’organismo.

Dal punto di vista medico, i trigliceridi vengono regolarmente dosati nel sangue, per monitorarne i livelli ed

evitare la formazione di placche che possono occludere vene o arterie.

3) FOSFOLIPIDI:

i fosfolipidi sono molecole lipidiche di tipo strutturale che costituiscono tutte le membrane biologiche delle

cellule. Vengono definiti molecole ANFIPATICHE perché presentano una struttura doppia formata da:

• Una testa polare idrofila, contenente un gruppo chimico detto gruppo fosfato, che possiede cariche

negative e induce una polarità tale da permettere alla molecola di formare legami con l’acqua

• Una coda apolare idrofobica, costituita da acidi grassi

La struttura dei fosfolipidi richiama quella dei trigliceridi, poiché entrambi come “scheletro” hanno una

molecola di glicerolo.

Nel caso dei fosfolipidi, ai 3 atomi di C del glicerolo sono legati 2 acidi grassi

(saturi o insaturi) e 1 gruppo fosfato.

Questa struttura di base (glicerolo + 2 acidi grassi + 1 fosfato) non è un

fosfolipide completo ma si chiama ACIDO FOSFATIDICO. La trasformazione

definitiva in fosfolipide avviene quando una molecola aggiuntiva (“Molecola X”) si lega al gruppo fosfato

dell’acido fosfatidico. In base al tipo di molecola che si

lega si otterrà un determinato tipo di fosfolipide.

4) STEROIDI:

sono composti lipidici costituenti la membrana plasmatica della cellula.

Sono formati da 4 anelli uniti tra loro: 3 anelli formati da 6 atomi di C e il 4° da 5 atomi

di C. Si distinguono per la struttura e la lunghezza delle catene che si estendono da

questi anelli.

Tra gli steroidi + importanti c’è il COLESTEROLO.

Il colesterolo svolge ruoli importanti nel nostro organismo:

• È un costituente fondamentale delle membrale biologiche

• È il precursore di varie molecole biologiche, tra cui:

-->ormoni steroidei

--> vitamina D

-->acidi biliari (costituenti della bile, sono importanti per la digestione e assorbimento dei lipidi)

5) CAROTENOIDI: (pigmenti arancioni e gialli contenuti nelle verdure)

2. PROTEINE E ACIDI NUCLEICI

PROTEINE

Sono polimeri biologici di grandi dimensioni costituiti dall’unione di monomeri detti AMINOACIDI.

AMINOACIDO: è costituito da un carbonio centrale legato a 4 gruppi:

a) Un atomo di H

b) Un gruppo carbossilico ()

c) Un gruppo amminico ( )

2

d) Catena laterale

Quello che cambia è il 4° gruppo che si lega (catena laterale) che ha una struttura chimica differente a seconda

del tipo di aminoacido (in natura ne esistono 20).

CLASSIFICAZIONE AMINOACIDI

In base alle proprietà chimico-fisiche della loro catena laterale, gli aminoacidi vengono classificati in 3 gruppi:

1) Aminoacidi APOLARI: hanno la catena laterale apolare, insolubile in acqua

2) Aminoacidi POLARI: hanno la catena laterale polare, solubile in acqua

3) Aminoacidi IONIZZABILI: contengono gruppi ionizzabili solubili in acqua e tali gruppi possono essere

acidi (perdono un H e si caricano negativamente) o basici (prendono un H e

si caricano positivamente).

I vari aminoacidi si legano tra loro mediante il LEGAME PEPTIDICO, che si forma tra il

gruppo carbossilico di un aminoacido e il gruppo amminico dell’altro aminoacido,

con l’eliminazione di una molecola d’acqua (reazione di condensazione).

Il legame peptidico è un legame covalente, quindi molto forte; infatti non si spezza

da solo ma servono degli enzimi specifici per romperlo.

Inoltre la cellula impiega energia sia per farlo avvenire sia per romperlo.

LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE DELLE PROTEINE

1) STRUTTURA PRIMARIA: è l’ordine con cui gli aminoacidi sono legati in sequenza. Quando una proteina

si trova solo allo stato di struttura primaria non è ancora funzionante, ma per poter funzionare deve

necessariamente raggiungere gradi di organizzazione superiori

2) STRUTTURA SECONDARIA: è la disposizione su un piano della catena polipeptidica.

Nelle proteine ci sono 2 tipi principali di struttura secondaria:

a) Ad la catena di aminoacidi subisce una spiralizzazione, formando

− :

un’elica

b) A foglietto la catena di aminoacidi si struttura su un piano a pieghe (foglietto

:

ripiegato)

Queste strutture sono mantenute dalla presenza di legami a idrogeno.

Anche a questo livello la proteina non è ancora funzionante.

3) STRUTTURA TERZIARIA: organizzazione 3D della proteina nello spazio.

La maggior parte delle proteine è costituita da un’alternanza di zone ad e a

−

foglietto che vengono posizionati nello spazio a formare la struttura terziaria. A

,

questo livello la proteina diventa funzionale.

4) STRUTTURA QUATERNARIA: è propria delle proteine formate da 2 o +

catene polipeptidiche. Per funzionare devono raggiungere una struttura

quaternaria.

Alcuni esempi sono: collagene, insulina, emoglobina

CHAPERONI MOLECOLARI

Una proteina riesce a raggiungere un livello strutturale superiore al primo grazie alla presenza di CHAPERONI

MOLECOLARI, ovvero proteine specifiche all’interno della cellula.

Queste si legano alla proteina appena prodotta (che è solo una sequenza primaria) e fanno in modo che si

organizzi, aiutandola a raggiungere il corretto ripiegamento per la struttura secondaria prima e terziaria poi.

Questi chaperoni riconoscono le sequenze idrofobe esposte erroneamente verso l’ambiente acquoso (nelle

proteine correttamente ripiegate le sequenze idrofobe si trovano ben protette all’interno).

PROTEASOMA

Le proteine, quando si formano, devono per forza raggiungere un corretto ripiegamento per diventare

funzionali, altrimenti tendono a precipitare all’interno della cellula formando dei pericolosi aggregati proteici,

che possono generare gravi patologie neurodegenerative (come l’Alzheimer). Per questo motivo le proteine non

correttamente ripiegate devono essere eliminate.

Per smaltire le proteine difettose, all’interno della cellula esiste una complessa struttura detta PROTEASOMA.

Quando una proteina non è correttamente ripiegata, degli specifici enzimi le attaccano come “etichetta” un

piccolo polipeptide (UBIQUITINA).

Poi la proteina a cui sono legate tante molecole di ubiquitina viene spedita direttamente al proteasoma.

Il proteasoma rompe i legami peptidici che tengono uniti gli aminoacidi della proteina difettosa.

La proteina entra intera nel proteasoma e dalla parte opposta escono i singoli aminoacidi, pronti per essere

riutilizzati.

DENATURAZIONE DELLE PROTEINE

Gli AGENTI DENATURANTI (es. calore estremo o pH acidi) vanno a rompere i legami che mantengono in forma

la proteina, denaturandola. Questo è un problema grave perché una volta denaturata, la proteina perde la sua

funzionalità.

La denaturazione proteica è spesso un processo irreversibile.

ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici sono l’ACIDO DESOSSIRIBONUCLEICO (DNA) e l’ACIDO RIBONUCLEICO (RNA), i quali sono

POLINUCLEOTIDI, formati dall’unione di monomeri detti NUCLEOTIDI.

Il DNA è contenuto all’interno del nucleo della cellula e contiene tutte le informazioni necessarie per lo

sviluppo di un organismo. Tutto ciò che un individuo è viene codificato all’interno del DNA e questa

informazione può essere passata (attraverso il meccanismo della trascrizione) all’RNA. Quindi l’RNA è la

molecola su cui viene “copiata” l’informazione presente sul DNA.

NUCLEOTIDE

Il nucleotide è l’UNITA’ strutturale dell’acido nucleico e ogni nucleotide è costituito da 3 parti fisse:

1) GRUPPO FOSFATO: contiene un atomo di fosforo (P) circondato da 4 atomi di O.

2) ZUCCHERO PENTOSO: zucchero formato da 5 atomi di C contenente un gruppo aldeidico. Nell’RNA lo

zucchero è il ribosio, mentre nel DNA è il desossiribosio

3) BASE AZOTATA: si legano al carbonio dello zucchero e si dividono in 2 gruppi:

a) PURINE: formate dall’unione di due anelli→ Adenina (A) e Guanina (G)

b) PIRIMIDINE: formate da un unico anello→ Citosina (C), Timina (T) e Uracile (U)

Sia nel DNA sia nell’RNA vi sono Adenina, Guanina e Citosina. La differenza sta nella 4° base, perché nel DNA si

trova la Timina, mentre nell’RNA si ha l’Uracile.

NUCLEOSIDI, NUCLEOTIDI E ATP

L’unione tra lo zucchero e la base azotata (sul carbonio 1) forma un NUCLEOSIDE.

Quando il C in posizione 5 dello zucchero si lega anche al gruppo fosfato, si ottiene il NUCLEOTIDE.

A seconda di quanti gruppi fosfati si legati, avremo nucleotidi mono-, di- o tri-fosfato.

Un esempio è l’ATP (Adenosina Trifosfato), formata da Adenina, Zucchero e 3 gruppi fosfato.

Tutte le volte che la cellula deve compiere un’azione, utilizza ATP→ rompe l’ultimo legame covalente

staccando un gruppo fosfato (trasformandolo in ADP = Adenosina Difosfato). La rottura di questo legame

tramite idrolisi libera l’energia necessaria alla cellula.

DIREZIONALITA’ DEL DNA

I nucleotidi si uniscono tra loro a formare un filamento attraverso il LEGAME FOSFODIESTERICO.

Tale legame si forma tra il gruppo ossidrile (OH) legato al carbonio 3 (C3’) dello zucchero di un nucleotide e il

gruppo fosfato legato al carbonio 5 (C5’) dell’altro nucleotide, con

l’eliminazione di una molecola d’acqua.

Questa reazione è catalizzata da un enzima detto DNA polimerasi che lavora

unicamente in direzione 5’ fosfato --> 3’ ossidrile (5’P→3’OH).

Questo significa che in ogni filamento ci sarà sempre:

Un’estremità 5’ fosfato libera (all’inizio della catena)

➢ Un’estremità 3’ OH libera (alla fine della catena), che è l’unico punto

➢ in cui la DNA-polimerasi può aggiungere nuovi nucleotidi

STRUTTURA DEL DNA

La molecola del DNA è costituita da un doppio filamento a forma di elica destrorsa.

Questi due filamenti sono:

> ANTIPARALLELI: le estremità dei 2 filamenti hanno direzioni opposte, ovvero l’estremità 5’P libera di un

filamento si allinea con l’estremità 3’OH libera dell’altro. questo anti-parallelismo deve essere

mantenuto anche durante la duplicazione (sia in vivo, sia in vitro come nella PCR)

> COMPLEMENTARI: i due filamenti sono tenuti uniti da legami a H che si formano in modo molto

specifico tra le basi azotate opposte. Se le basi si mixassero in modo errato, i legami si formerebbero

ugualmente ma causerebbero una distorsione fisica della doppia elica, generando una mutazione.

STRUTTURA RNA

L’RNA è formato da un singolo filamento, ma può assumere strutture secondarie complesse, perché a causa

della complementarietà delle basi, alcune regioni dello stesso filamento possono ripiegarsi su se stesse e

appaiarsi, creando localmente delle zone a doppio filamento.

DENATURAZIONE E RINATURAZIONE DEL DNA

Il DNA può essere completamente denaturato (separato nei due filamenti singoli) e successivamente

rinaturato.

DENATURAZIONE: consiste nella rottura dei legami a H tra le basi azotate. Siccome serve + energia per

rompere i 3 legami di C-G rispetto ai 2 legami di A-T, le zone ricche di Citosina e Guanina sono + resistenti.

In vivo: la separazione avviene grazie a enzimi specifici (come la DNA-elicasi)

In vitro: si ottiene portando la soluzione ad alta Temperatura (90-100°C)

RINATURAZIONE: se la soluzione riscaldata in vitro viene fatta raffreddare gradualmente a T ambiente, i 2

filamenti di DNA ricominciano a unirsi grazie alla complementarietà, riformando la perfetta molecola di

partenza a doppio filamento antiparallelo.

Questa capacità di resistere agli sbalzi termici rigenerando la struttura originale è sfruttata in laboratorio nella

PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) per amplificare il DNA.

Le proteine al contrario non possiedono questa caratteristica, quindi una volta denaturate perdono i loro livelli

di organizzazione necessari per essere funzionali e spesso non riescono a tornare alla forma originale.

3. CELLULA

CELLULA EUCARIOTE VS PROCARIOTE

Tutti gli organismi viventi sono formati da cellule che si dividono in 2 grandi categorie:

EUCARIOTE (animali, piante)

➢ 1. Dimensioni: molto + grande

2. Nucleo e membrana nucleare: presenta un nucleo, circondato da membrana, che contiene il DNA

3. Membrana plasmatica e parete cellu