Appunti biologia molecolare

Biologia molecolare 2021/2022 Prof. Marigo

Argomenti

• Storia
• Struttura e modificazioni delle proteine
• Struttura del DNA
• Struttura della cromatina
• Replicazione del DNA
• Proteine associate alla replicazione del DNA
• PCR e sequenziamento
• Frammentazione del DNA e vettori
• Clonaggio
• Mutagenesi e meccanismi di riparazione del DNA
• Rottura dei filamenti e meccanismi di riparo
• Ricombinazione sito specifica
• Generazione di Knock-out e Knock-in
• Riarrangiamenti del DNA
• Trascrizione nei procarioti
• Trascrizione negli eucarioti
• Maturazione dell’mRNA
• Metodologie per l’analisi dell’RNA
• Splicing alternativo
• La traduzione
• Sintesi proteica
• Sintesi proteica e regolazione
• Espressione proteica in procarioti
• Espressione proteica in eucarioti
• Regolazione dell’espressione genica nei procarioti
• Regolazione dell’espressione genica nei fagi e negli eucarioti
• Analisi dell’interazione tra proteine
• Fattori di trascrizione eucariotici
• Analisi dei promotori
• Modificazioni della cromatina
• Regolazione trascrizionale in eucarioti
• Generazione animali transgenici
• Eterocromatina e non-coding RNA
• RNA regolatori
• Genomi e genoteche

Storia

Esperimenti di Griffith, Avery, Hershey & Chase

Il DNA è alla base della trasmissione dell’informazione genetica. Nel 1944 si dimostrò che il principio trasformante nei batteri è il DNA. Si presero due ceppi batterici R e S in grado di indurre la polmonite. Inattivando il ceppo S con il calore, esso non appare virulento ma ponendolo a contatto con il ceppo R esso torna virulento quando trattato con RNasi o con proteasi. Posto a contatto con DNasi il ceppo non è in grado di infettare.

Nel 1952 si dimostrò concretamente che fosse proprio il DNA a trasmettere l’informazione genetica. Infettando E. Coli con un fago in un terreno di coltura contenente Fosforo e Zolfo radioattivi, dalla progenie emergerà solo il Fosforo radioattivo (P), il quale si lega al DNA, mentre lo zolfo, che si lega alla componente proteica andrà perso.

Esperimento di Chargaff

Basandosi su analisi statistiche dimostrò l’appaiamento delle basi. Le pirimidine (Citosina e Timina) sono composti eterociclici con N al C1 e al C3 che presentano un solo anello. Esse si associano sempre con una purina (Adenina o Guanina), costituita da un doppio anello: una pirimidina e da un imidazolo. La Timina si associa con l’Adenina attraverso un doppio legame. T = A, C ≡ G. La Guanina si associa con la Citosina con un triplo legame.

Esperimento di Melson & Stahl

Essi definirono la tipologia di replicazione del DNA:

• Semi-conservativa
• Conservativa
• Dispersiva

Marcando con N pesante il DNA e ponendolo in centrifuga con un gradiente di Cesio sarà visibile:

• Prima della replicazione, una sola banda pesante.
• Dopo la prima replicazione, una banda ibrida centrale.
• Nelle successive replicazioni, una banda centrale sempre meno visibile e una banda leggera sempre più forte.

Struttura e modificazioni delle proteine

Le proteine sono polimeri costituiti da alfa-amminoacidi, con un gruppo amminico e un gruppo carbossilico legati al carbono. R è il residuo o catena laterale che caratterizza le sue caratteristiche. I legami covalenti richiedono alte quantità di energia, spesso la polimerizzazione necessita di enzimi in grado di catalizzare la reazione. Il legame peptidico si genera tra due amminoacidi attraverso una reazione di condensazione, ovvero la formazione di un legame covalente e il rilascio di H₂O tra un gruppo carbossilico e uno amminico. Si va a generare un complesso planare in trans. L’enzima che catalizza la reazione per la formazione del legame peptidico è un RNA. La catena di un polipeptide cresce in una sola direzione, quando si scrive una proteina, l’ammino-terminale convenzionalmente si pone a sinistra e a destra il carbossi-terminale. Il legame idrogeno riveste un’importante interazione tra dipoli anche a distanza più ampia. Sono legami più deboli ma fondamentali poiché vanno a definire la struttura della proteina.

• Primaria: È la sequenza degli amminoacidi.
• Secondaria: Quando esce dal ribosoma, la proteina può acquisire una struttura ad alfa elica o a beta foglietto.
• Terziaria: In un ambiente solitamente ricco di acqua come il citoplasma subisce dei ripiegamenti.
• Quaternaria: Più proteine si uniscono per formare un complesso proteico con attività funzionale.

La struttura secondaria

Struttura ad Alpha elica: È un’elica destrorsa con un diametro di circa 1.5 nm, variabile in base ai residui esposti e con un passo pari a 3.6 residui. La struttura è stabilizzata da legami idrogeno, tra l’ossigeno del gruppo carbonilico =O (precedente carbossilico) e H legato ad N e non tra le catene laterali dei residui esposti. È rappresentata come un cilindro.

Struttura a Beta foglietto: È una struttura prevalentemente planare e rigida che espone dei residui alternati. Anche qui sono presenti legami idrogeno che stabilizzano la struttura. Viene rappresentata come una freccia.

La struttura terziaria

Intervengono i residui amminoacidici. In un ambiente idrofilico come il citoplasma acquisiscono conformazioni strutturali schermando all’esterno i residui idrofobici ed esponendo i residui idrofilici.

• Legame idrogeno tra i residui esposti.
• Interazioni elettrostatiche tra le cariche dei residui.
• Interazioni idrofobiche.

Sono tutte interazioni deboli che determinano una specifica forma della proteina. Legame covalente S-S nella Cisteina, interazione ad alta energia, che va a formare un ponte disolfuro molto stabile attraverso una reazione di ossidazione anche tra cisteine distanti, determina ripiegamenti specifici molto stabili. I ponti disolfuro stabilizzano specifiche conformazioni nelle proteine secrete o di membrana. L’enzima PDI = Proteina disolfuro isomerasi presente nel RER con due cisteine con ponte disolfuro, accetta nel suo sito catalitico due H, si riduce ed ossida la proteina. Isomerizzazione del legame peptidico che coinvolge la prolina favorisce i ripiegamenti della struttura. L’enzima peptidil prolin isomerasi favorisce la transizione da trans a cis andando a modificare la conformazione della proteina, solo in presenza di prolina. Non si può formare il legame idrogeno in quel punto e determina la formazione di un ripiegamento.

La struttura quaternaria

Si forma solo quando le proteine interagiscono tra loro.

Il DNA e fattori di trascrizione interagiscono attraverso dei domini. Quando sono ricche in leucina, idrofobica con gruppi CH₃, crea cerniere chiuse di leucine formando una struttura coiled-coil dinamica ad alpha elica.

Sequenza segnale: Sono sequenze amminoacidiche specifiche che servono alle proteine per essere indirizzate ai diversi compartimenti della cellula. Viene etichettata, trasportata e letta da importine nei vari compartimenti cellulari.

Dominio proteico: È una porzione grande della proteina, all’interno di strutture specifiche con attività funzionale, nella quale è possibile che si instauri una interazione con un altro elemento come, ad esempio, DNA o con attività enzimatica. In una proteina possono essere presenti più domini e ad ogni dominio può corrispondere una funzione differente. Si forma una struttura necessaria per la funzione della proteina.

Attività enzimatica: Il substrato entra nel sito attivo catalitico dell’enzima, il quale favorisce la modifica del substrato. Esso presenta residui amminoacidici che favoriscono la formazione di legami, o in alcuni casi ATP. Il substrato cambia, andando a generare dei prodotti che successivamente sono rilasciati dal sito attivo dell’enzima. Si effettuano delle variazioni conformazionali durante la reazione.

Modificazione delle proteine negli eucarioti

Sono modifiche post-traslazionali. La proteina è prodotta nei ribosomi ed è modificata influenzando:

• Conformazione
• Interazioni intra/inter-molecolari
• Interazioni proteine-membrana
• Localizzazione subcellulare/secrezione
• Stabilità e degradazione
• Aggregazione

Fosforilazione delle proteine: Modificate con l’aggiunta di un gruppo fosfato, mediata attraverso delle chinasi, che si servono di ATP. Le fosfatasi rimuovono i fosfati, i quali contengono un gruppo acido, modificando le interazioni elettrostatiche della struttura ternaria. Tirosina, Serina e Treonina sono prevalentemente fosforilati, presentano un ossidrile -OH esposto nel residuo.

Acetilazione delle proteine: Modifica all’amminoterminale (N-term) della lisina con un acetile per stabilizzare la proteina. Le aceti transferasi utilizzano il Coenzima-A per trasferire l’acetile, andando ad eliminare la carica basica all’amminoacido. Si determina una modifica delle interazioni elettrostatiche.

Metilazione delle proteine: Essa può avvenire sull’acido nucleico o sugli istoni. Enzima metil-transferasi trasferisce CH₃ su lisine e arginine.

Glicosilazione delle proteine: Modifica che avviene nel RER può essere O-linked in Serina e Treonina o N-linked con Asparagina.

Modificazione con lipidi: Ancora le proteine alla membrana dopo la modificazione. Spesso un lipide viene aggiunto alla Cisteina.

Degradazione delle proteine: Avviene per mezzo del proteasoma, è un’attività continua nelle nostre cellule, circa il 30% delle proteine può presentare errori. Queste vengono etichettate e poi smaltite. La proteina viene etichettata dall’ubiquitina, una proteina con una particolare conformazione, presenta 3 foglietti beta ed un’alpha elica, essa si lega con il carbossi-terminale alla lisina della nostra proteina o ad un’altra ubiquitina, formando delle catene di poliubiquitina. Enzimi trasportano le ubiquitine che si vanno a legare con la proteina, si vengono a formare delle catene con altre ubiquitine (poliubiquitinazione), rendendosi riconoscibile dal proteasoma. In presenza di una sola ubiquitina non si dirige al proteasoma.

La struttura del DNA

Il DNA è un polimero, costituito da nucleotidi. Presenta una doppia elica destrogira, simmetrica, caratterizzata da un appaiamento di base convenzionale. Il diametro è di 2 nm e ad un giro di elica corrispondono 10.5 nt. Si distinguono un solco maggiore di 2.2 nm e uno minore di 1.2 nm dove le basi azotate sono meno esposte. L’alpha-elica può interagire solo con il solco maggiore, a causa delle sue dimensioni. Fattori di trascrizione come la tata-bonding protein riescono ad interagire anche con il solco minore. La catena polipeptidica è costituita da zuccheri alternati a fosfati carichi negativamente. È un acido idrosolubile. Il 5’ presenta un fosfato ed in basso, al 3' Al presenta un ossidrile libero alla fine della catena. Il legame fosfoesterico è posto all’esterno tra il fosfato e il C5’. L’azoto indell’anello, legame glicosidico nelle purine, è tra C1’. Nella pirimidina è coinvolto N in posizione 1. Sono entrambe reazioni di condensazione, che determinano la perdita di 2H₂O. Ribosio presenta in 2’ ossidrile, desossiribosio H in 2’, DNA perché non presenta l’OH. Il dATP nucleotide trifosfato è necessario per l’azione polimerasica, per generare un nuovo filamento di DNA la polimerasi necessita del trifosfato. Le basi azotate sono composti eterociclici planari. Purine (A-G) N9 forma legame glicosidico. L’Adenina presenta al C6 un gruppo amminico, mentre la Guanina al C6 un gruppo chetonico e al C2 un gruppo amminico. Pirimidine (C-T-U) N1 forma il legame glicosidico e al C2 è sempre presente un gruppo chetonico. Citosina in C4 troviamo un gruppo amminico mentre in Timina e Uracile un gruppo chetonico. Per distinguere T ed U guardiamo al C5, nella Timina c’è un gruppo metilico non coinvolto nell’appaiamento delle basi. Per costituire la catena i nucleotidi sono uniti con legame fosfodiesterico, la lettura convenzionale va dal 5’ al 3’, ed è legato alla direzionalità della polimerizzazione.

I due filamenti di DNA sono uniti da legame idrogeno tra le basi azotate (5 kcal per mole), questo si rompe con maggiore facilità rispetto ai nucleotidi, che necessitano di enzimi specifici.

Appaiamento tra le basi

I legami idrogeno che si formano in A=T sono tra:

• Chetonico della Timina in posizione 4 e H in 6 dell’Adenina; il donatore di H è il gruppo amminico e l’accettore è il gruppo chetonico della timina.
• H dell’anello della pirimidina in 3 legato ad N e N in 1 dell’Adenina.

I legami idrogeno che si formano in C≡G sono tra:

• Donatore H è il gruppo amminico in C4 della Citosina e l’accettore è O del gruppo Chetonico in C6
• H dell’anello della pirimidina in 3 legato ad N e come accettore N1 della Guanina.
• Gruppo amminico in 2 della Guanina fornisce H con O del gruppo chetonico della Citosina.

Leggendo un filamento posso dedurre la sequenza del filamento complementare. Tutti i legami idrogeno rendono la molecola di DNA molto stabile. L’RNA è molto meno stabile, in laboratorio viene trattato perché si degrada molto facilmente. In alcuni fagi è stata trovata una nuova base azotata, “Z”, simile all’adenina che forma 3 legami H con la Timina. I filamenti del DNA sono antiparalleli, una lettura corretta riveste un elemento importante, le basi sono planari e si impilano in modo ordinato, permettendo interazioni tra basi adiacenti.

Le basi azotate possono assumere conformazioni tautomeriche, la timina può essere in forma chetonica, e in forma enolica non si lega più con l’adenina, non è più presente l’accettore, e si lega con la Guanina. In questi casi, dopo la replicazione del DNA, la struttura può assumere forme scorrette e alterare la sua struttura.

Base flipping

Dallo scheletro zucchero-fosfato può verificarsi una rotazione ed esposizione della base azotate. Può essere utile, perché permette l’accesso alle basi per eventi di:

• Metilazione
• Rimozione di basi
• Verifica della complementarietà

Le tre tipologie di strutture del DNA

In natura il DNA presenta tre tipologie di strutture:

• Forma B: È la forma più comune del DNA, costituita da un solco maggiore di 2.2 nm, e uno minore. Per ogni giro sono presenti 10.5 nucleotidi. L’interazione specifica con le proteine avviene per mezzo di nuove interazioni seguendo un codice legato dalla presenza di accettori come N, O o donatori come H. L’ordine dei donatori e degli accettori è differente in relazione alle basi presenti, determinando una “lettura” differente. Nel solco minore è presente una minore specificità. Il codice nei solchi maggiori determina l’interazione o meno della proteina.
• Forma A: Presenta 11 nucleotidi per giro in condizioni di bassa umidità o in caso di appaiamenti DNA-RNA. È una struttura più allargata.
• Forma Z: Tipica di regioni ricche in GC, è una struttura più allungata che facilita il riconoscimento da parte di fattori di trascrizione e proteine.

Durante la replicazione del DNA si viene a formare il triplex, una struttura costituita da tre filamenti di DNA. La denaturazione del DNA è un processo reversibile che si manifesta in ambiente alcalino o con alte temperature. È alla base di molti lavori, come ad esempio la PCR. Per rinaturare il DNA occorre riportarlo ad un pH neutro, o tornando a temperature inferiori. Si andrà a riassociare seguendo la complementarietà. Ibridiamo, unendo frammenti di DNA differenti. Quando i frammenti sono complementari si appaia completamente formando un homoduplex. Unendo frammenti leggermente diversi, essi si assoceranno comunque andando a costituire un eteroduplex. Appaiando molecole di DNA con RNA formano un ibrido DNA-RNA.

Attraverso lo spettro fotometro seguiamo la denaturazione del DNA: A 260 nm (luce UV) andiamo ad eccitare gli anelli aromatici degli acidi nucleici, osservando le curve di assorbimento, in corrispondenza di circa 82° esse aumenta notevolmente, poiché le basi azotate cominciano ad esporsi (effetto ipercromico). In base alla percentuale di CG nei promotori, si modifica la temperatura necessaria per denaturarsi. Sono presenti tre legami idrogeno che determinano una maggiore energia per la rottura dei legami.

Caratteristiche dei cromosomi

• Batterico: Circolari per la maggior parte, a doppio filamento.
• Adenovirus: Presentano il DNA a doppio filamento.
• Virus adeno-associati: Single strand.
• Cellula eucariotica: DNA nucleare e DNA mitocondriale.

Il mtDNA è un piccolo genoma, con una molecola di DNA circolare, aploide che contiene 37 geni essenziali per le funzioni del mitocondrio. Presenta 13 geni che codificano enzimi per la produzione di ATP, 22 t-RNA e 3 rRNA.