Appunti di lezione di Veicolazione e direzionamento dei farmaci

Veicolazione e direzionamento dei farmaci

Drug targeting

Drug targeting consente al farmaco di giungere al sito bersaglio per diminuire gli effetti collaterali o tossici legati alla distribuzione del principio attivo negli altri tessuti (importante in farmaci antitumorali). Nella somministrazione di un farmaco, l’ideale sarebbe massimizzare la quota dello stesso al sito bersaglio, sulla base di una Terapia Razionale. Una Terapia Convenzionale, quale la somministrazione orale, subisce invece numerose fluttuazioni a livello del bersaglio, va quindi assunta più di una volta al giorno e ha una bassa compliance. I farmaci hanno di per sé una mancanza di specificità rispetto ai tessuti bersaglio, sono privi di spiccato tropismo tissutale, pertanto si sceglie di veicolarli attraverso strategie che consentano un rilascio modificato.

Variazioni del rilascio

• Velocità di rilascio: cessione rapida o protratta di principio attivo (es. Buscofen capsule molli o Fentanyl cerotto transdermico).
• Tempo di rilascio: cessione ritardata o pulsata.
• Luogo di rilascio: drug targeting.

Siamo ancora lontani dal rilasciare il principio attivo unicamente nel sito bersaglio; riusciamo oggigiorno a regolare la velocità di rilascio senza controllo sul sito di rilascio oppure controllare il sito di rilascio senza controllare la velocità di rilascio. Il primo a evidenziare l’importanza del drug targeting fu Paul Enrich con l’idea della "Magic Bullet" o proiettile magico, in riferimento agli antibiotici, quali farmaci diretti verso strutture batteriche che si accumulano nel sito bersaglio indipendentemente dalla via di somministrazione.

Nel 1981, Gregoriadis ha descritto l'importanza di vestire i farmaci con nuovi vestiti per assicurare un accumulo specifico. Il drug targeting è un’esigenza piuttosto recente e attuabile con diversi gradi di successo: l'api dovrebbe raggiungere la cellula contenente il bersaglio intracellulare, ma per ora ci si accontenta di raggiungere l’organo o il tessuto. Ciò è importante per farmaci cardiotossici, nefrotossici, ototossici.

Ordini di drug targeting

• I ordine: se prevede rilascio a un organo/tessuto.
• II ordine: se prevede rilascio a una sottopopolazione cellulare (es. macrofagi del fegato o cellule del Kuffer).
• III ordine: se prevede il rilascio a un comparto cellulare (es. lisosomi).

Può essere raggiunto:

• Usando molecole altamente specifiche (Magic Bullet: Antibiotici).
• Modificando chimicamente la molecola (Profarmaci).
• Rivestendo il farmaco con materiali per cui il rilascio non sia più dipendente dalle caratteristiche chimico-fisiche del farmaco ma da quelle del carrier (drug targeting).

Caratteristiche chimico-fisiche

Le caratteristiche chimico-fisiche che influenzano la distribuzione del farmaco sono lipofilia, solubilità, dimensioni (importanti), stabilità e citotropismo. L’uso di un carrier spesso conferisce selettività e specificità, penetrazione intracellulare (per tumori solidi) e protezione verso l’inattivazione, cioè stabilità, ridotti effetti collaterali, migliore indice terapeutico, riduzione delle volte di somministrazione (es. depositi sottocutanei formano reservoir di farmaco: serbatoi di accumulo che consentono 1 somministrazione al mese o ogni 2 mesi), migliore compliance. Tutto ciò a patto di uno spiccato aumento dei costi.

Il drug targeting è in netto ritardo nello sviluppo per vari motivi: mancanza di conoscenze di anatomia e fisiologia delle barriere, dell’esatto percorso del carrier, delle sue proprietà chimico-fisiche, di tecnologie industriali di produzione del carrier che siano riproducibili. Es. i liposomi sono instabili!

Principali strategie di drug targeting

1. Applicazione diretta del principio attivo nella zona malata: es. somministrazione per iniezione intrarticolare di farmaci per artrite reumatoide, somministrazione intracoronarica di enzimi trombolitici con stent (dispositivi a forma di spirale che dilatano un'arteria affetta da stenosi) o stent medicati che rilasciano principi attivi vasodilatatori per pazienti con stenosi, somministrazione orale con colon delivery per patologie infiammatorie del colon.
2. Targeting fisico: carrier sensibili a variazioni di pH o temperatura capaci di rilasciare il farmaco a certi pH e temperature (es. farmaci antitumorali e antiinfiammatori: aree infiammate e tumorali hanno temperature più alte e pH più basso).
3. Targeting magnetico: il farmaco è inglobato in un carrier con caratteristiche ferromagnetiche, la cui localizzazione è controllata da un campo magnetico esterno applicabile sottocute (es. Doxorubicina adsorbita su carrier magnetica infuso sull’arteria epatica per trattare tumore epatico).
4. Targeting passivo: sfrutta l’extravasazione (tipica di tumori e tessuti infiammati): a volte è un vantaggio, altre uno svantaggio; l’extravasazione riguarda la fuoriuscita del farmaco dal circolo ematico per giungere al sito bersaglio. Le molecole si muovono nell’organismo altamente compartimentalizzato in base a PM (si usa g/mol per molecole, si usa Dalton per microparticelle, liposomi, 1 Da = 1 g/mol), carica, permeabilità vascolare, flusso sanguigno. Generalmente l’endotelio vasale è continuo, presenta cioè giunzioni serrate fra le cellule per cui il carrier di 100 nm non fuoriesce e non raggiunge il sito target. Nelle ghiandole esocrine e nel pancreas, l’endotelio è discontinuo e la membrana subendoteliale è continua: il farmaco può accumularsi fra endotelio e membrana. Nel fegato, milza e midollo osseo, l’endotelio è fenestrato e la membrana endoteliale discontinua: quasi tutti i farmaci si accumulano in questi siti. Nei tessuti infiammati o tumorali o ipossici (es. dopo infarto) l’extravasazione è maggiore: ciò consente l’extravasazione e lì accumulo negli spazi interstiziali di particelle colloidali di diametro 10-500 nm.

Extravasazione e targeting passivo

Extravasazione: processo di fuoriuscita del farmaco dal circolo ematico al sito bersaglio, dipende dal cut off specifico di ogni dato tessuto. Il cut off dei vasi del tessuto d’interesse deve essere noto prima di progettare il nostro carrier in maniera tale da avere un drug targeting. A livello dei tessuti infiammati e tumorali si verifica un’aumentata estravasazione, fenomeno definito “Enhanced Permeability and Retention” (EPR), dovuto a una serie di fattori: rilascio di sostanza vasodilatatrici e permeabilizzanti quali Bradichinina, scarso drenaggio linfatico che permette a ciò che stravasa di essere ritenuto a livello tumorale, iperangiogenesi e iperpressione dovuta all’assenza quasi totale del drenaggio linfatico.

La fenestrazione è:

• A livello renale è 20-30 nm,
• Epatico 150 nm,
• Polmonare 1-400 nm,
• Midollo osseo 85-150 nm.
• Se vogliamo raggiungere i tessuti tumorali bisogna creare carrier al di sotto di 100 nm.

Particelle di diametro inferiore a 10-20 nm vengono eliminate a livello renale, particelle da 30-150 nm si localizzano nel midollo osseo, nel cuore, nel rene e nello stomaco, particelle di dimensioni maggiori di 150 nm si accumulano a livello del Sistema Reticolo Endoteliale o Sistema Fagocitario Mononucleare (terminologia più adatta) che le rimuove dal torrente ematico. Il RES o MFS fa parte del sistema immunitario ed è localizzato principalmente in fegato e sistema immunitario (milza, midollo osseo, linfonodi e microglia), in 3 cellule: cellule reticolari, cellule del Kuffer (macrofagi epatici).

I fagociti del circolo sistemico sono degli spazzini che inglobano materiale estraneo per fagocitosi, tramite pseudopodi inglobano questo materiale (batterico e non) e formano il fagosoma di dimensioni variabili, anche di notevoli dimensioni, che unito ai lisosomi darà il fagolisosoma i cui enzimi lisosomiali scinderanno il materiale estraneo. Carrier di 2 micrometri andranno a localizzarsi nei capillari polmonari.

Per un efficiente processo di estravasazione è fondamentale che il carrier abbia un prolungato tempo di circolazione nel torrente ematico in maniera che arrivi più volte al sito bersaglio. Per extravasare a livello del sito bersaglio, bisogna considerare:

• Dimensioni del carrier, e le sue proprietà chimico-fisiche:
• Carica
• Idrofobicità superficiale.

La fagocitosi interessa principalmente particelle di dimensioni maggiori di 100 nm, particelle cariche e con elevata idrofobicità superficiale. Le cellule fagocitiche sono coadiuvate da proteine plasmatiche quali opsonine, immunoglobuline nonché i fattori del complemento che attivano la via alternativa di opsonizzazione. Albumina e apoplipoproteine possono indirizzare i carrier sia verso fagocitosi sia verso distribuzione. Le opsonine vanno ad aumentare l’idrofobicità del carrier aiutando le cellule fagociti ad agire.

Per sottrarre il carrier all’opsonizzazione, si costruiscono “Carrier a lunga circolazione” o Carrier Stealth, cioè carrier stabili che rallentano il processo di opsonizzazione e quindi di fagocitosi, presentando catene di polimeri idrofili, legate con legami covalenti o interazioni elettrostatiche, che interagiranno con molecole di acqua in modo da viaggiare con un guscio idrofilo idratato che agirà come barriera sterica per l’opsonina. Se i carrier sono carici, si utilizzano tensioattivi non ionici per schermare il carrier. La strategia più utilizzata per creare carrier stealth è la pegilazione: aggiunta di Polietilenglicole (PEG) e Polipropilenglicole (PPG) ossidati: ossido di etilene o ossido di propilene (le parti idrofile interagiranno con acqua, le parti idrofobiche interagiranno con il carrier). Il PEG è un polimero lineare che può estendersi in soluzione, non è tossico, non è immunogenico, altamente idrosolubile, flessibile e economico. Le catene di Peg funzionano come una specie di molla che respinge le opsonine che si avvicinano alla superficie del carrier. Si può usare PEG con PM di almeno 2000 Dalton per avere la giusta flessibilità e repulsione sterica.

Esistono vari livelli di densità delle catene di PEG, strettamente correlata alla conformazione che assumeranno:

• Conformazione mushroom: catene di PEG abbastanza distanziate fra di loro,
• Conformazione brush (a spazzola): elevata densità di catene di PEG con diminuita capacità di movimento,
• L’ideale è una conformazione a metà fra le due che assicuri una densità intermedia e un guscio di diametro del 5% del diametro totale o di 2 volte del raggio idrodinamico del gomitolo.

La pegilazione per adsorbimento prevede legami ad interazione elettrostatica, è una strategia utile ma poco stabile (comporta un possibile desorbimento e opsonizzazione), il PEG è legato alla superficie del carrier con legami deboli. La pegilazione covalente è più stabile ma non necessariamente più utile, comporta una sintesi controllata. La pegilazione per incorporazione prevede sempre legami covalenti ma non comporta sintesi, si parte da materiale già pegilatato e consente di ottenere una certa densità di pegilazione.

Nanocarrier non stealth, che vengono rimossi velocemente dal circolo ematico, sono utilizzati se il target è lo stesso sistema reticolo endoteliale: sono adatti per antibiotici che devono essere consegnati alle cellule fagocitiche colpite da infezioni intracellulari batteriche, quali tubercolosi polmonare, leishmaniosi; nel trattamento delle deficienze di enzimi lisosomiali e nell’immunopotenziamento dei vaccini, nell’attivazione dei macrofagi.

Targeting attivo

Targeting attivo richiede un residuo mobile (ligando o targeting mojety) attaccato alla superficie del carrier che riconosce le cellule bersaglio del farmaco. Il ligando deve essere legato covalentemente alla superficie del carrier, generalmente si tratta di anticorpi monoclonali, ma anche lectine, lipoproteine, ormoni, folato, mono-oligo-polisaccaridi. Prima si fa un targeting passivo o Carrier Stealth e poi si lega covalentemente il targeting mojety. Non è necessario legare il targeting mojety a tutte le catene di Peg! Un carrier stealth che contiene il targeting mojety penetra nella cellula solo tramite endocitosi mediata da recettore, a cui consegue il rilascio del principio attivo. I carrier stealth con targeting mojety consentono di veicolare maggiori quantità di principio attivo rispetto all’anticorpo monoclonale legato a una molecola (in questo caso è la molecola a indirizzare la delivery, rapporto 1:1), permettono di consegnare qualsiasi tipo di sostanza.

Liposomi

Liposomi: Carrier vescicolari, molto simili alle cellule, micro vescicolari o submicrovescicolari, costituiti da lamelle, formate da fosfolipidi, separate da compartimenti acquosi e da una parte centrale acquosa. Ogni lamella è costituita da un doppio strato fosfolipidico, in cui i fosfolipidi anfifilici, si distribuiscono in H₂O in maniera conforme alla polarità. Un fosfolipide è costituito da una molecola di glicerolo, le cui due catene alcoliche in C2 e C3 sono esterificate con due molecole di acidi grassi di lunghezza variabile, in C1 c’è un gruppo fosfato legato a una testa polare variabile (colina, serina, etanolammina, inositolo). In natura le catene di acidi grassi sono variabili, nei fosfolipidi di sintesi le catene C2 e C3 sono generalmente identiche. Per costruire i liposomi, si possono usare anche gli sfingolipidi, cioè lipidi presenti in natura costituiti da uno scheletro di sfingosina, un amminoalcol con lunga catena insatura, distinti in ceramidi, sfingomielina e glicolipidi. La ceramide con aggiunta una testa polare (un fosfato e una colina) costituisce la sfingomielina, che ha maggiore stabilità metabolica nel sangue. La singola catena si dispone nell’ambiente acquoso a formare un monostrato o una micella, si ottengono micelle quando si supera la CMC (concentrazione micellare critica). Le molecole si possono organizzare in diverse conformazioni sulla base del solvente utilizzato, del tipo di lipide presente. Tanti coni invertiti formano una micella, se le catene si impaccano in una forma a cilindro, si avrà un doppio strato. La conformazione preferita è data dall’Indice di Impaccamento: Volume della Porzione idrofobica/Area superficiale media occupata dalla molecola all’interfaccia acqua-aria per Lc: lunghezza della catena acilica. Nel caso di una miscela ideale nel bilayer si può definire un valore medio di P come la somma delle frazioni molari di valori individuali di P di lipidi individuali.

• Se P < 1, la conformazione utilizzata è micella inversa
• Se P = 1, la conformazione è cilindrica

Comportamento termotropico del bilayer fosfolipidico

Comportamento termotropico del bilayer fosfolipidico: Temperatura di transizione principale: T_m segna il passaggio da fase gel a fase liquida. Se i fosfolipidi vengono messi in frigorifero per diversi giorni (4 gradi), arriveranno a una fase definita L_β in cui essi sono perfettamente allineati, con catene aciliche estese nel loro livello massimo, l’impaccamento è cristallino o orto rombico come fosse solido talmente è l’ordine di disposizione dei fosfolipidi; portandoli fuori dal frigorifero, essi supereranno la temperatura di transizione arrivando alla fase L_β’ in cui le catene aciliche subiscono un’inclinazione rispetto al piano del bilayer, l’impaccamento è sempre orto rombico ma c’è maggiore flessibilità, perciò riscaldando ulteriormente, superiamo la temperatura di pretransizione (T_p) arrivando alla fase P_β’ in cui le catene aciliche sono organizzate in un lattice esagonale con una densità inferiore, non aumenta il numero di molecole d’acqua associate a un fosfolipide. L’ultima fase o L_α (fase liquida-cristallina) si ottiene superando la transizione principale (T_m) in cui le catene aciliche sono sovrapposte e intrecciate fra loro, i legami singoli C-C da conformazione trans diventano gauche perciò le catene aciliche occuperanno volume maggiore, lasciando maggiore possibilità alle molecole d’acqua di interagire con le teste polari.

La fluidità del doppio strato dipende dalla lunghezza della catena acilica (maggiore è la lunghezza, minore è la fluidità perché maggiore è l’interazione fra catene di lipidi vicini), dalle insaturazioni (maggiori insaturazioni, maggiore fluidità perché c’è minore impaccamento fra fosfolipidi adiacenti), dalla temperatura (maggiore è la temperatura del comparto, maggiore sarà la velocità di avvicinamento alla T_m, maggiore la fluidità).

Nomenclatura dei fosfolipidi: 4 lettere

• Prima lettera “D” sta per “di” perché i fosfolipidi di sintesi hanno in C2 e C3 la stessa catena acilica.
• Seconda lettera indica il nome dell’acido grasso.
• Le ultime due lettere caratterizzano la testa polare del fosfolipide.

• DLPC: dilaurilfosfatidilcolina T_m = 1 a t ambiente è in fase gel
• DMPC: dimauristilfosfatidilcolina T_m = 23 a t ambiente è in fase liquida-cristallina
• DOPC: dioleilfosfatidilcolina T_m = -20 a t ambiente è in fase liquida-cristallina (la presenza di un doppio legame abbassa drasticamente la T_m)

Colesterolo

Colesterolo: Sostanza considerata antipatica sebbene prettamente apolare, diminuisce la fluidità del doppio strato perché interagendo con le catene aciliche dei fosfolipidi, agirà da blocco al movimento delle catene aciliche. Se inserito all’interno dei fosfolipidi, ...