Appunti di lezione di Farmaci biotecnologici

Lezione 1 prodotti dalla tecnologia del DNA ricombinante

Esistono due tipologie di cellule:

• La cellula procariote, molto semplice, unicellulare, il materiale genetico della cellula procariotica è una molecola circolare di DNA non protetta da alcun involucro, si trova libera nel citoplasma della cellula, manca il nucleo.
• La cellula eucariote, il materiale genetico è organizzato in cromosomi, ed è racchiuso all’interno di un nucleo, quindi di una compartimentazione separata dal resto della cellula da una membrana porosa e selettiva che è la membrana nucleare.

Il citoplasma è più semplice della cellula eucariotica. Tra i vari sistemi di membrana, nel procariote manca il sistema del Golgi, il quale ha lo scopo di apportare delle modifiche post traduzionali alle proteine, nel Golgi avviene la glicosilazione. Le proteine quindi dei procarioti non saranno mai glicosilate, manca la struttura che si lega a questa molecola semplice.

Il citoplasma è un insieme di strutture membranose, ognuna delle quali ha una funzione. Sono presenti il reticolo endoplasmatico liscio e rugoso, il sistema del Golgi, le proteine vengono glicosilate e la cellula è in grado di aggiungere zuccheri una volta che questa è stata prodotta, i mitocondri per produrre energia, batteri endosimbionti che vivono all’interno della cellula eucariotica scambiandosi i favori della cellula.

DNA, RNA e proteine

Il DNA viene trascritto in mRNA, poi tradotto da mRNA a proteina. Cambia il linguaggio da polinucleotidico del DNA a polinucleotidico dell’RNA a polipeptidico della proteina.

Il DNA va incontro ad un processo di replicazione o duplicazione quando da una molecola di DNA ho ancora una molecola di DNA.

Enzimi: la duplicazione e replicazione è catalizzata dalla DNA polimerasi DNA dipendente, che polimerizza il DNA partendo da uno stampo di DNA.

Poi DNA viene trascritto in mRNA per azione della RNA polimerasi DNA dipendente, che polimerizza una molecola di RNA dipendendo da uno stampo di DNA.

Esiste una trascrittasi inversa, che fa il lavoro opposto, che è una DNA polimerasi RNA dipendente che polimerizza DNA appoggiandosi su uno stampo di RNA.

Esistono anche le RNA replicasi, che sono RNA polimerasi RNA dipendenti.

DNA trascrizione mRNA traduzione proteina replicazione duplicazione RNA polimerasi RNA pol DNA dip proteina traduzione DNA mRNA trascrittasi inversa DNA pol RNA dip RNA replicasi DNA polimerasi RNA pol RNA dip DNA pol DNA dip.

La traduzione poi porta a proteine.

Esistono differenze tra cellule procariotiche ed eucariotiche.

Nella cellula procariote gli mRNA vengono trascritti e tradotti direttamente, dal DNA viene trascritto un mRNA che poi viene tradotto tal quale in proteina. Esiste un codone di inizio, tripletta, e un codone di arresto, termine, tutto quello compreso tra i due codoni viene tradotto in proteina. 1 Gli RNA trascritti, mRNA, dei procarioti vengono tradotti direttamente. Gli mRNA trascritti dei procarioti vengono tradotti direttamente.

Il processo di traduzione nella cellula eucariote è più complicata, abbiamo un passaggio intermedio, ovvero la maturazione dell’RNA. L’mRNA che deriva direttamente dalla trascrizione del gene ha delle caratteristiche peculiari, che sono: una coda di poli-A in 3’, adenina/A/A/A/A, e un cappuccio in 5’ che è una adenina modificata. Quindi è protetto alle due estremità, all’interno tra i due codoni ci sono sequenze che devono venir tradotte e sequenze che non vengono tradotte. Le prime si chiamano esoni, mentre gli introni vengono eliminati attraverso il processo di splicing. Il passaggio da trascritto primario a mRNA si chiama maturazione. Molti degli RNA trascritti primari degli eucarioti devono essere rielaborati prima di essere tradotti. Molti degli RNA trascritti primari degli eucarioti devono essere rielaborati in mRNA prima di essere tradotti.

Scoperta del DNA

Il DNA fu scoperto da Miescher a metà del 1800, medico, nel 1869-1871.

“Composizione chimica delle cellule del pus”: raccoglieva cellule e isolava quelle che secondo lui erano nuove proteine, in realtà isolò qualcosa che le proteine non contengono, ovvero una forte acidità e la presenza di fosforo, che chiamò nucleina, ne aveva trovata tanta nello sperma di salmone, pensò che avesse a che fare con la trasmissione dei caratteri. Ma questo era il DNA, Miescher aveva isolato per la prima volta il DNA che è stato poi studiato dai successori hanno capito come era fatta la molecola di DNA tutto ciò ha portato alla conoscenza del DNA ricombinante.

Rosalind Franklin l’unica che non ha preso il Nobel, perché era già morta, la foto 51 permette con i raggi X a capire come è fatto il DNA.

Tecnologia del DNA ricombinante

DNA ricombinante ha dato origine a tutti i prodotti biotecnologici di natura proteica.

La tecnologia del DNA ricombinante, inserimento di un gene, di una porzione di materiale genetico che ha un’informazione per la proteina terapeutica che viene inserito in un vettore, questa operazione si chiama ricombinazione, la molecola che si forma è ibrida, ha un vettore e si chiama DNA ricombinante, questa viene 2 poi trasferita attraverso due sistemi che sono la trasfezione o trasformazione a seconda che la molecola che entra in un ospite sia un plasmide o un virus. La molecola ricombinante entra in un ospite e mette in moto i sistemi di trasformazione e si ottiene il prodotto proteico per scopo terapeutico.

Così si sono ottenuti prodotti per uso farmaceutico, tra cui l’insulina: nativa, ingegnerizzazione ad azione rapida e ad azione lenta. Recombinant DNA technology ricombinazione trasformazione/trasfezione.

Insulina e diabete

Prima della scoperta dell’insulina, il diabete era una malattia temuta che avrebbe sicuramente portato alla morte. I medici sapevano che lo zucchero peggiorava le condizioni dei pazienti diabetici e che il trattamento più efficace era sottoporre i pazienti a diete molto rigide in cui l’assunzione di zucchero fosse ridotta al minimo. Nella migliore delle ipotesi, questo trattamento potrebbe far guadagnare ai pazienti qualche anno in più, ma non li ha mai salvati. In alcuni casi, le diete dure hanno persino causato la morte di fame dei pazienti.

L’insulina serve per il trattamento del diabete, si era visto che alcuni individui non tolleravano gli zuccheri, avevano come sintomi fortissima sete e diuresi, e via via andavano indebolendosi giorno dopo giorno. Lo zucchero quindi faceva male.

Bisognava mettere i pazienti a dieta strettissima, niente zuccheri nella dieta, le persone si indebolivano a tal punto che spesso morivano di stenti e non di diabete.

Uno studente di medicina tedesco nel 1869, Paul Langerhans si rende conto che istologicamente all’interno del pancreas ci sono tante cellule di un certo tipo e le isole di Langerhans. Paul Langerhans scoprì che all’interno del tessuto pancreatico che produce i succhi digestivi c’erano gruppi di cellule la cui funzione era sconosciuta. Nel 1889 in Germania, dimostrarono che se il pancreas veniva rimosso da un cane, l’animale avrebbe avuto il diabete. Alla fine del 800 si facevano molto le sperimentazioni sugli animali, rimuovendo il pancreas dal cane si vide che ci sono correlazioni tra diabete e pancreas. Strozzando il pancreas, il dotto pancreatico in modo che non riversi nel tratto digerente, il cane ha problemi digestivi ma non sviluppa il diabete. Il pancreas ha due funzioni: una attraverso il dotto di favorire la digestione producendo succhi digestivi e l’altra funzione ha a che fare con il diabete.

Due ricercatori all’inizio del 1921, Banting e Best iniziarono i loro esperimenti rimuovendo il pancreas da un cane e videro che tolto il pancreas il cane ha tutti i sintomi del diabete. Così isolano il pancreas nel cane, ne causano la degenerazione, estraggono il succo pancreatico e trovano una sostanza “isolettina”, la iniettano in un altro cane con il diabete e vedono che il secondo cane sta meglio, più forte.

Chiamano un analita, per estrarre in grandi quantità tale sostanza però passano alla mucca per avere più quantità di tale sostanza dal pancreas, Collip prepara il succo/estratto, e la chiamano insulina, decidendo di testarla sull’uomo. Lo provano su di loro Banting e Best, si indeboliscono, hanno le vertigini ma non muoiono. Lo purificano e lo somministrano nel 1922 ad un ragazzo di 14 anni diabetico. Il test è stato un successo, il ragazzo ha rapidamente riacquistato forza e appetito. 3

Insulina

L’insulina, proteina costituita da due catene, la catena A con 21 amminoacidi e la catena B con 30 aminoacidi, sono tenute assieme da due ponti disolfuro ed esiste anche un ponte intracatena all’interno della catena A. Viene prodotta nelle isole di Langerhans del pancreas, viene prodotta come un precursore che è la pre-proinsulina, la quale viene formata nel reticolo endoplasmatico rugoso, dopo di che nell’uscire da questo perde una prima porzione che è il peptide segnale, perde una coda idrofobica, rimane un pezzo costituto dalla catena A, da un peptide di connessione C e dalla catena B, prosegue la sua maturazione all’interno del citoplasma e viene tagliato enzimaticamente il peptide C o di connessione lasciando le due catena A e B connesse dai ponti di solfuro. Va incontro ad una maturazione nel citoplasma.

Preproinsulina Proinsulina Diabete mellito Insulina.

Diabete mellito

Diabete mellito: l’insulina trova implicazione nel trattamento del diabete mellito, compromissione delle risposte biologiche all’insulina. Diabete di tipo I o insulina dipendente, diabete di tipo II o insulina indipendente.

Abbiamo due tipi di diabete: diabete I, insulina dipendente, perché non vi è produzione endogena di insulina, patologia che compare precocemente nei ragazzi giovani adolescenti e insorge con una specie di malattia autoimmunitaria, c’è una reazione anti cellule di Langerhans, si ha distruzione di queste cellule e quindi mancata produzione di questa proteina, trova collocazione l’insulina prodotta dalle biotecnologie; diabete II, insulina indipendente, nei pazienti che hanno un’età più avanzata, 50-60 anni, l’insulina c’è, ma vi è una mancata risposta, dovuta a diversi fattori, ad esempio i recettori hanno diminuito l’attività, ci sono meno recettori o la risposta che dal recettore va all’interno della cellula è compromessa, non ha senso somministrare l’insulina in questo tipo di diabete.

Distruzione autoimmune delle cellule pancreatiche. Ridotto numero di recettori. Ridotta affinità del recettore. Mancata risposta intracellulare.

C’è un altro diabete insipido, la sintomatologia è la stessa delle precedenti, elevata diuresi e tanta sete, il problema è dato dalla vasopressina, che promuove il riassorbimento di acqua a livello renale, la causa molecolare del diabete è completamente diversa. Le urine dei pazienti in un caso sono dolci e nell’altro caso non lo sono. 4

I tessuti principalmente coinvolti sono tessuto adiposo, fegato e muscolo.

Nel fegato l’insulina promuove la sintesi di glicogeno, quindi l’immagazzinamento, lo rimuove dal plasma e viene immagazzinato come glicogeno nel fegato, la sintesi del glicogeno è stimolata anche a livello muscolare. Mentre a livello di tessuto adiposo stimola la sintesi degli acidi grassi.

Il paziente diabetico, quindi, ha beneficio dalla somministrazione di insulina, sono stati messi a punto una serie di passaggi cronologici per migliorare la produzione di insulina da utilizzare in questi pazienti.

1. La prima stata prodotta è l’insulina convenzionale, si prendeva il pancreas di bovino o suino si faceva una estrazione e poi si andava a cristallizzare l’insulina. Se si fa una corsa cromatografica o corsa eritropoietica di questa insulina, si vedono 3 picchi, quindi non è assolutamente pura. Il picco a più alto PM contiene proteasi, enzimi proteolitici, poi il secondo picco di peso intermedio, che conteneva la proinsulina, il terzo picco non è insulina pura neanche questa, perché contiene forme di insulina modificata, insieme ci sono anche proteine pancreatiche contaminanti con un peso molecolare simile all’insulina. Il risultato terapeutico era la immunogenicità molto forte di questi preparati bovini e suini e la disomogeneità delle preparazioni. Somministrazione e dosaggi sono molto difficoltosi.
2. Si cerca di migliorare l’aspetto analitico e quindi accanto alla cristallizzazione si fa un gel filtrazione e si ottiene l’insulina a singolo picco, abbiamo eliminato i primi due picchi, è rimasto solo il picco dell’insulina non pura, ma contaminata. Stessi problemi di prima immunogenicità e impurezza delle preparazioni.
3. Si aggiunge una cromatografia a scambio ionico, arriviamo a purificare ancora meglio i preparati di insulina, arriviamo ad avere contaminanti inferiori a 10 ppm, parti per milione, però è sempre una proteina non uguale a quella endogena, qualcosa che causa immunogenicità, nei pazienti abbiamo risposta anti-biofarmaco.

Questo problema dell’immunogenicità con l’insulina era particolarmente spiccato, perché si tratta di un farmaco che il paziente diabetico prende tutti i giorni e più volte al giorno e per tutta la vita; quindi, anche una bassa immunogenicità era un problema pesante per la terapia.

Si arriva all’insulina EMP che è insulina a sequenza completamente umana, identica a quella umana, ma di origine porcina/suina. 5

A catena A, B catena B.

La prima è quella umana, l’insulina di maiale ci assomiglia molto, c’è un solo aminoacido che differisce da quella umana. L’unica differenza sta nell’aminoacido 30 della catena B, nel maiale è presente un’alanina invece che treonina. L’insulina bovina ha una differenza più spinta, sono 3 gli aminoacidi che differiscono da quella umana.

L’idea è stata quella di ottenere un’insulina identica a quella umana modificando la porcina, quella con meno differenze.

Si è visto che trattando enzimaticamente l’insulina suina con tripsina, enzima proteolitico, pH 7,5 per 45 minuti, sistema relativamente semplice, si ottiene il distacco dell’ultimo residuo diverso e due punti di rottura, se ne va un opta-peptide, 8 aminoacidi della catena B, quindi bisogna risintetizzare in laboratorio in vitro quel pezzetto di 8 aminoacidi e andarlo a risaldare all’insulina suina che era stata idrolizzata/digerita con la tripsina. Così da 10 g di insulina di maiale, si ottenevano 7 grammi di insulina a sequenza completamente umana. Trypsin Trypsin, pH 7.5, 45 min, pH 7.5, 45 min.

Insulina ricombinante umana

Si è arrivati così a produrre insulina ricombinante umana, uguale a quella dell’uomo prima nei batteri, procarioti, e poi nei lieviti, eucarioti.

I vantaggi sono più di uno:

• La ragione etica.
• La ragione sanitaria, usare materiale di origine animale comporta sempre il rischio di una trasmissione di patogeni dall’animale all’uomo.

Quindi con la tecnologia del DNA ricombinante abbiamo eliminato il rischio di patologie dal bovino/suino all’uomo.

Foto rosa: le preparazioni sono molto più riproducibili, abbiamo una facilità nella produzione, si possono anche modificare le insuline ottenendo insuline ingegnerizzate, si sono pensante due cose: la prima è ottenere insuline più potenti, vantaggio soprattutto di tipo economico, e la seconda idea è modificare la farmacocinetica dell’insulina ottenendo insuline ad azione rapida o azione più lenta.

Più riproducibile e minor rischio patologie. Più potenti, economico. Insuline ingegnerizzate. Azione rapida. Farmacocinetica C-DNA modificata. Facilitato la produzione. Azione lenta. 6

Farmacocinetica dell’insulina

Il farmaco va somministrato a ragazzi giovani quando compare la malattia per tutta la vita, tutti i giorni più volte al giorno. Possono esserci esigenze particolari dal punto di vista farmacocinetico, deve esserci la possibilità di somministrarlo prima del pasto se devo mangiare a quell’ora precisa, o il jet-lag.

Il picco di attività ce l’abbiamo due ore dopo la somministrazione, dopo di che il picco dura dalle 4 alle 12 ore, se prendiamo gli estremi la somministrazione dell’insulina modificata copre circa 24 ore.

Insulina difficilmente esiste come monomero, ma tende spontaneamente a formare dimeri e aggregati anche di dimensioni superiori, quindi dimeri e oligomeri, e poi in presenza di zinco nel pancreas, l’insulina forma un esamero, 6 monomeri di insulina, come farmaco noi dobbiamo stabilizzarla e ci sono conservanti fenolici per conservarla e stabilizzarla che portano ad una modifica conformazione all’esamero che diventa regular insulin = soluble insulin = unmodified insulin ancora più stabile come forma esamerica, più stretto.

Insulina regolare = insulina solubile = insulina immodificata.

Somministriamo il farmaco, perché questo passi la membrana plasmatica/dell’endotelio deve diventare monomero, ci vuole tempo che i conservanti fenolici diffondano, l’esamero diventi da stretto a grasso, dopo di che deve diffondere lo ione zinco, a questo punto si disaggrega e dà origine a dimeri, stati di aggregazione superiore, e monomeri. Chi passa e porta all’azione terapeutica è il monomero. 7

Per ingegnerizzarla devono avere insuline ad azione rapida, voglio insuline più veloci, che agiscano più in fretta, il picco è dopo mezz’ora di efficacia, tra le 2 e le 5 ore agisce in maniera completa, oltre le 8 di quell’insulina nel paziente non c’è più traccia. Voglio ottenerla perché vogliamo un’insulina da somministrare al bisogno magari prima del pasto.

L’idea è stata ostacolare la sua tendenza all’agg