Appunti di sviluppo di farmaci biotecnologici

Sviluppo di farmaci biotecnologici

Gandin

05/03/2021

Introduzione

08/03/2021

Lezione 1

Definizione di farmaco

Un farmaco (drug) è una molecola, o insieme di sostanze o molecole (principio attivo ed eccipienti) con azione specifica che ha un target molecolare (funzione fisiologica preesistente), ad attività su un enzima o un recettore, per ristabilire equilibrio fisiologico compromesso o funzione fisiologica corretta, o anche a scopo diagnostico o preventivo (per esempio, risonanza con contrasto, quando la sostanza viene assunta dalla persona, o farmaci usati nella diagnostica per immagini). Non deve essere né cibo né un supplemento o integratore. La normativa è diversa nei diversi campi. Ogni sostanza riconosciuta dal testo della farmacopea ha carattere precettivo, con funzione regolatoria. Ai sensi della legge, è un testo di riferimento che contiene tutte le sostanze considerate farmaci. Sono contenute tutte le informazioni sulla sostanza: formula, struttura, composizione, modo di preparazione, usi ed effetti avversi. Ha anche tutte le indicazioni sui metodi da utilizzare per verificare identità della sostanza, qualitativo e quantitativo, e informazioni sui contenitori dei vari farmaci.

La Farmacopea europea è un testo che armonizza i contenuti di tutte le farmacopee dei singoli stati in uno unico. Esiste anche un tentativo di creare una farmacopea internazionale per armonizzare i contenuti di tutte le comunità statali, per questioni di sicurezza e di produzione. Questo crea problemi per il produttore, che deve seguire le farmacopee singole per poter commercializzare il prodotto in ogni diverso paese. Tuttavia, il vantaggio è soprattutto per il paziente, poiché può conoscere e avere accesso a tutti i farmaci approvati. Un'armonia internazionale è utile per i produttori, poiché vengono armonizzate le specifiche per produrre il farmaco e analizzarlo.

Glossario

• Composizione del farmaco
• Principio attivo
• Eccipienti
• Nome del marchio
• Nome genetico del principio attivo
• Nome chimico

Farmacopea: definizioni e metodi

La farmacopea fornisce definizioni, metodi di analisi e riconoscimento, preparazione e indicazioni per la produzione, convalide del processo. Cosa rende un farmaco tale? La dose. Effetto terapeutico ed effetti avversi si verificano alle dosi terapeutiche. L'efficacia del farmaco va presa in considerazione insieme alla sua sicurezza. La condizione essenziale è efficacia e sicurezza per l’approvazione. Si valuta la sicurezza prendendo in considerazione l’indice terapeutico, cioè la dose tossica rispetto alla dose efficace. L'indice terapeutico o finestra terapeutica sono la stessa cosa.

Vie di somministrazione

Le vie di somministrazione sono importanti per lo sviluppo di un farmaco. Due grandi famiglie: enterali e parenterali. Enteros (intestino), hanno a che fare col sistema gastro-intestinale. Parenterali sono per lo più quelle infusive (iniettive). Altre due vie classificate nelle parenterali, ma sono due cose a parte: via inalatoria e via topica.

Le differenze principali tra parenterali ed enterali riguardano la degradazione delle proteine nella via enterale, con una quantità che raggiunge il sangue molto bassa. Va somministrato molto più farmaco, con una parte persa per il pH dei succhi gastrici e l'effetto di primo passaggio, dove tutte tali preparazioni vengono drenate attraverso la vena porta nel fegato e trasformate con inattivazione del farmaco. Anche quando inietto il farmaco per via parenterale, non è detto che la quantità che arrivi sarà uguale a quella somministrata, ma almeno non c’è la presenza di tale effetto. Non tutte le vie enterali subiscono l’effetto di primo passaggio allo stesso livello. Le vie parenterali però non lo subiscono affatto.

Il 98% dei farmaci biotech è somministrato per via parenterale. Gli svantaggi delle vie parenterali sono che sono vie iniettive, quindi il farmaco deve avere delle caratteristiche, deve essere solubile, o comunque devo portarlo in un mezzo disperdente. Discomfort per il paziente o compliance, la pratica deve essere sterile e anche tutto il materiale iniettato (pirogeni). Il preparato farmaceutico deve essere sterile quindi. Sono quindi vie di somministrazione più costose.

Vantaggi e svantaggi delle vie di somministrazione

Il vantaggio delle vie parenterali è che sono più veloci delle enterali e più riproducibili. La quantità che raggiunge il sangue è più standardizzata rispetto la media della popolazione. Per via sottocutanea la quantità deve essere piccola, maggiore per la via intramuscolare e venosa. Quella sottocutanea soffre di variabilità, le altre molto meno. Intradermica è più profonda della sottocutanea, quantità più piccola della muscolare ma abbiamo il vantaggio che il farmaco è assorbito molto lentamente. Potrei volere assorbimento lento ma prolungato nel tempo. Intravenosa dà la velocità maggiore, posso anche somministrare a flusso continuo. Procedura invasiva e più costosa perché richiede operatore sanitario, sito di iniezione può essere usato per un tempo limitato perché il sito collassa. Problema: le proteine possono aggregarsi per via intravenosa.

La via più desiderata è quella orale. Non ci sono farmaci biotech in questo senso. Ma molti sono in fase di studio per la via sottolinguale, assorbimento rapido perché parte molto ricca di vasi. Queste fenestrazioni però non sono grandi quindi assorbimento di macrobiomolecole non sempre è efficace. L’effetto di primo passaggio è praticamente nullo.

La via inalatoria o polmonare è molto studiata, viene impiegata per farmaci con effetto a livello del parenchima polmonare, meno efficace per farmaci che devono arrivare a livello sistemico. Il problema è che non è facile la standardizzazione, per la quantità di muco presente. E richiede device di somministrazione particolari.

Farmacocinetica e farmacodinamica

Farmacocinetica: quello che il corpo fa al farmaco. Parametri: assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione.

Farmacodinamica: ciò che il farmaco fa al nostro corpo. Parametri: parametri che interferiscono con l’efficacia del farmaco, interazione con il bersaglio del farmaco.

12/03/2021

Farmacocinetica: assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione.

15/03/2021

I farmaci più difficili da sviluppare sono quelli per organi e tessuti poco raggiunti dal sistema circolatorio (tessuto adiposo, tessuto osseo). Sistema nervoso per la barriera ematoencefalica e barriera placentare.

Pharmacokinetic molecular optimization per modificare il profilo farmacocinetico della molecola. Si può lavorare sulla solubilità, funzionalizzarlo con policationi, modificare la dimensione.

Se scarsamente assorbito posso aumentare la solubilità, posso cambiare dimensioni e carica funzionalizzando la molecola con policationi, proteggere particolari gruppi chimici coniugando la molecola con siti facili da idrolizzare o da ossidare in modo da inattivare o rallentare il suo metabolismo. Se ha emivita troppo breve: posso cambiare la via di somministrazione. Se troppo tossico cambio via di somministrazione, uso antagonisti, alcalinizzo, favorisco eliminazione, funzionalizzo.

Se il farmaco viene metabolizzato troppo velocemente posso proteggere i gruppi reattivi.

Se l’emivita è troppo bassa? posso cambiare via di somministrazione. Se è tossico posso cambiare via di somministrazione, posso abbassare tempo di emivita, posso somministrare un antagonista o sostanza che stabilizza e aumenta eliminazione, o funzionalizzare il farmaco (drug delivery) in modo da fargli raggiungere un bersaglio specifico.

Prima si andava a tentativi, ora il processo di sviluppo è più razionale. Dal 2010 si seleziona un bersaglio molecolare suscettibile al trattamento di una patologia (rational design).

Prognostico: alterazione può essere indice che la patologia si svilupperà.

Predittivo: sopravvivenza media/totale etc. è legato alla risposta di successo terapeutico. Non solo al farmaco ma in risposta ad ogni tipo di terapia.

Modelli di studio

1. Modelli in vitro
2. Da affiancare agli studi in silico con modelli computazionali
3. Per legge il farmaco va testato almeno su due modelli animali
4. Validazione percorso di scaling up e produzione
5. Formulazione e stabilità della formulazione
6. Trial clinici

29/03/2021

Drug development process

Dal’idea al medicinale passano in media 15 anni e da 10.000 molecole si arriva ad una molecola approvata ad uso terapeutico. Passi da percorrere: discovery e razionalizzazione, fase di validazione in vitro o test pre-clinici in laboratorio e poi nei modelli animali e poi le 3 fasi cliniche seguite da approvazione e commercializzazione e poi fase 4.

Qualità, sicurezza, purezza. Sono rilevanti le contaminazioni del farmaco e delle cellule e del medium. Approvazione dei prodotti da FDA e EMA. All’interno vi sono delle sottocommissioni che si occupano di biofarmaci.

Non serve far approvare il farmaco in ogni paese.

Target validation: silenzio target. Variabilità di espressione da valutare (sesso, età, univocità del target, etc.). vedere se il target è raggiungibile dal farmaco. Solo il 10% dei target è raggiungibile dai farmaci. Fenomeni di compensazione con isoforme dello stesso enzima o di enzimi diversi che si sostituiscono alla proteina che ho bersagliato col farmaco. Target undrugable.

1. Saggi in vitro e studi in silico con modelli computazionali risparmiando tempo e soldi simulando interazione con la mia molecola con il target. Ipotizzo attività ma devo conoscere struttura e binding site della molecola. Prima faccio screening in silico e poi verifico attività in vitro. Sistemi biochimici con enzimi isolati e vedo se c’è interazione con test colorimetrici etc. saggi cellulari e con tessuti isolati (modelli ex vivo).
2. Verificata l’azione della mia molecola, seleziono nel gruppo di molecole quelle più promettenti. La legge prevede obbligatorietà di testare i farmaci sui modelli animali (almeno 2 modelli animali), uno superiore e uno inferiore. Danno indicazione, anche se limitata dal corredo genetico diverso dall’uomo. Serve per avere informazioni su efficacia e tossicità del farmaco. Praticati secondo linee guida e limitando la sofferenza dell’animale. Utili per ottenere informazioni sulla farmacocinetica anche se spesso il corredo enzimatico è diverso dall’uomo quindi sono solo studi preliminari da ripetere nell’uomo.
3. Fasi cliniche: Va fatta formulazione in parallelo e fase di produzione su larga scala. Lo scaling up va validato con uniformità di produzione con analisi dei lotti. Studi di stabilità. Scelgo via di somministrazione in base al principio attivo (solubile o no), in base al paziente di destinazione etc. la formulazione serve per rendere stabile il principio attivo e non solo per la somministrazione.
4. Test clinici (trial): Seguono parere di una commissione etica che valuta ragionevolezza.
5. Fase 1: sicurezza e tollerabilità, si inizia a studiare farmacocinetica e farmacodinamica. Solo se è efficace e ben tollerato si passa alla fase 2. Volontari sani.
6. Fase 2: dura di più, di solito due anni, e solo il 35% dei farmaci la superano. I pazienti aumentano e non sono volontari sani ma pazienti. Si raffina la conoscenza di farmacocinetica e dinamica ed efficacia. Si valuta la risposta dose-effetto e si indaga il dosaggio migliore senza avere effetti avversi. Vengono coinvolti pazienti malati.
7. Fase 3: multicentrica, coinvolge più centri e più di 1000 pazienti. Si inserisce la valutazione della comparazione con il placebo o con un gold standard di riferimento usato in precedenza. Si valuta rischio-beneficio. Ultima fase. Dura fino a 5 anni. Si assembla un dossier su tutto quello che è stato fatto con la data molecola con dati molto dettagliati che viene inviata alle autorità competenti (EMA, AIFA, FDA). Non è un processo statico, può essere richiesta revisione del dossier se non si ha immissione in commercio per via emergenziale. Infine, vi è approvazione.
8. Fase 4: post marketing, il farmaco continua ad essere studiato dalle agenzie regolatorie. Si tiene conto di tutto ciò che avviene in termini di reazioni avverse e indesiderate, interazione con altri farmaci o effetti avversi che possono essere positivi per essere sfruttati per nuovi utilizzi del farmaco stesso. Non ha una durata temporale prefissata. Ci possono essere parziali o totali ritiri dei farmaci in via di nuove analisi e valutazioni per capire se ci sono cause relazionali o temporali. Ritiro per effetti collaterali a lungo termine. Si studiano interazioni o combinazioni con altri farmaci che nello studio clinico non vengono valutati di solito.
9. In parallelo agli studi clinici si tiene in considerazione che gli studi sul farmaco non si fermano perché si cerca di capire il meccanismo d’azione per arrivare a scoprire e disegnare nuovi farmaci più promettenti. Si opera riposizionamento della molecola. Anche in vista di trattare altre patologie.

Evidenze di tipo genico o proteico

• Alterazione o prodotto che porta a patologia o che protegge dalla patologia.
• Differenze tra molecole piccole e biologiche: Piccole modifiche nelle piccole molecole determinano grandi differenze nell’effetto terapeutico. Nelle biomolecole un piccolo cambiamento non porta a modifica nel profilo di attività terapeutica.

Sviluppo dei biofarmaci

Cambia un po' il drug discovery e il drug design rispetto alle piccole molecole.

Step 1

Devo conoscere patologia e sapere quale molecola è suscettibile di interazione per ottenere effetto diagnostico o curativo. Seleziono gene target e identifico un modo per isolarlo e per clonarlo. Faccio esprimere il prodotto del gene in un sistema adatto (cellulare). Ottenuto il prodotto verifico espressione e livello di espressione e purifico (3 fasi di purificazione successive, iniziale, intermedia e finale) e verifico la struttura molecolare e la funzione. Produzione e verifica del prodotto. From function to gene approach. Altro modo di sviluppo è from gene to screen (ottengo librerie di cDNA da fonti conosciute, faccio analisi e identifico sequenze principali e le clono ed esprimo. Ottenuto il prodotto purificato, lo testo. Simile alla creazione di migliaia di molecole a caso che poi testo, trial and error. Approccio casuale e non razionale). Pro del from function: so già se il target è drugable e suscettibile di interazione. Contro: più costoso e porta via più tempo. È più veloce e semplice esprimere tutto, purificare e vedere se funziona, ho più probabilità che qualcosa funzioni.

Step 2

Ottimizzazione della resa e del sistema di espressione.

Step 3

Molecular optimization per massimizzare farmacocinetica e farmacodinamica e potenziale terapeutico. Modificare solubilità modificando gruppi funzionali. Nei prodotti bio l’ottimizzazione modifica la farmacodinamica e la farmacocinetica perché è fortemente limitato dalla natura stessa della molecola. Posso ridurre metabolismo o aumentare l’escrezione. Lo faccio con metodi di simulazione computazionali o svolgo saggi di valutazione dell’attività e tento di avere relazioni struttura-attività in modo da capire fondamenti che portano a farmacocinetica e dinamica e modifico le caratteristiche con modifiche strutturali. Esempio: posso modificare la biomolecola che pesa meno di 50 kDa e facilmente eliminata in modo da aumentare la sua emivita coniugandola con un dominio Fc con uno spaziatore chimico o con residui specifici in modo che la coniugazione porta a una dimensione e ingombro maggiore e quindi vi è meno attacco da enzimi deputati al metabolismo. Aumento emivita.

Tecniche strumentali per verificare struttura, folding (spettroscopia Raman) e meccanismo/funzione (taglio proteolitico con fluorescenza emessa da molecola coniugata al substrato).

Stabilità chimico-fisica

Denaturazione, aggregazione, si lavora sugli eccipienti e packaging. Instabilità chimica dovuta a ossidazione e proteolisi e si lavora su eccipienti e biomolecola in sé.

Test da fare per garantire purezza e stabilità: ci sono le indicazioni nelle linee guida per tali validazioni. Il compito del biotecnologo e dell’equipe in ambito regulator, risponde alla autorità competente e ricerca metodi sufficienti per garantire stabilità e purezza ma in linea con la farmaceutica. Non si usa una tecnica soltanto ma si usano più tecniche. Aggregazione e precipitazione dovuti a interazione idrofobica tra le proteine. Può anche avvenire durante la filtrazione perché le molecole vengono a contatto tra loro tramite avvicinamento.

Stabilità microbiologica

Difficile da ottenere se non ho intervento precedente, per natura questi prodotti portano con sé contaminazioni. Per garantire per 6 mesi una certa stabilità, non è sufficiente usare una formulazione con agenti antibatterici o conservanti ma è necessario sterilizzare il prodotto di partenza, ma non è semplice. È necessario fare ciò nel caso dell’iniezione. Metodi: fisici e chimici. Fisici: autoclave, irradiazione, filtrazione. Chimici: composti gassosi come formaldeide ed etanolo con effetto nei confronti dei patogeni. Gli unici utilizzabili sono irradiazione (ma non per DNA ed RNA), filtrazione (il più impiegato, si fanno filtrazioni successive). Il metodo chimico viene usato solo se non ci sono particolari della proteina esposti che possono reagire con queste sostanze.

Strategie di acceleramento nello sviluppo del farmaco

Sviluppato per più applicazioni in parallelo da usare per molte patologie diverse, si fa per risparmiare soldi e per cercare di avere più approvazioni possibili per le diverse malattie. Si fa anche per le piccole molecole ma mol...