Appunti di genetica molecolare

Genetica molecolare umana

Citogenetica clinica

Studia, mediante microscopio ottico, la morfologia e il numero dei cromosomi, e il loro ruolo nell'eredità. Inizialmente era usata per il mappaggio dei geni sui cromosomi; oggi è utile in diagnostica e in ricerca per evidenziare anomalie del cariotipo. L'analisi dei cromosomi permette di ricostruire il cariotipo, ossia l'insieme dei cromosomi di una cellula, in un individuo. I cromosomi sono visibili solo nelle cellule in attiva proliferazione.

Importanza dello studio del cariotipo

È importante lo studio del cariotipo perché:

• 1:200 neonati ha patologia cromosomica
• >50% degli aborti spontanei ha anomalie cromosomiche
• 1:100 è portatore di anomalia bilanciata (il portatore non ha fenotipo clinico) che può essere associata a infertilità/abortività e prole con fenotipo patologico
• La maggior parte dei tumori ha anomalie cromosomiche multiple

Cromosomi

Il cariotipo umano è di 46 cromosomi, 23 coppie → 22 autosomiche e 1 sessuale. I membri di una coppia di cromosomi sono chiamati omologhi, sono uguali per dimensione, forma e posizione dei loro centromeri. I cromosomi omologhi portano l'informazione per il controllo degli stessi tipi di caratteristiche genetiche, sebbene non necessariamente l'identica informazione. I cromosomi omologhi sono uno di derivazione paterna, l'altro materna.

Ogni cromosoma è una molecola lineare di DNA che, attraverso il coinvolgimento di istoni e proteine non istoniche, forma strutture tridimensionali che raggiungono la massima compattazione in divisione mitotica → metafase: fase in cui si può analizzare il cariotipo. I cromosomi sono formati da due cromatidi → molecola di DNA lineare attaccate l'una all'altra tramite centromero → osserviamo in mitosi prima dell'anafase. In fase G1 abbiamo molecole di DNA singole, poi si replica → il DNA neosintetizzato rimane legato: cromatidi fratelli uniti a formare un cromosoma. I cromatidi fratelli sono repliche esatte, i cromosomi omologhi no.

Componenti strutturali e funzionali di un cromosoma

Nella regione centromerica si forma il cinetocore. Il cinetocore è il componente del centromero su cui prendono attacco i microtubuli del fuso mitotico. In genere il cinetocore è duplice, uno per ciascun cromatidio. Il centromero divide il cromosoma in due regioni diverse fra loro: distinguiamo il braccio corto (p) e il braccio lungo (q).

Un'altra regione importante è la regione telomerica; la telomerasi impedisce l'accorciamento durante le diverse replicazioni. Questa struttura forma una specie di uncino e interagisce con complessi proteici che proteggono questa struttura e la mantengono stabile → importanti per la stabilità del cromosoma.

Storia

Già nel XIX secolo si ebbero le prime immagini dei cromosomi umani. Non si sapeva quale fosse il numero, si pensava circa 48 negli anni '50. Solo nel 1956 si stabilì come 46 il numero del corredo cromosomico corretto umano, aprendo la strada all'individuazione della causa di alcune patologie associate ad aneuploidie di specifici cromosomi. Nel '59 si iniziavano a capire le cause cromosomiche di diverse patologie (es. Down) → aneuploidie. Mediante lo studio dei cromosomi si scoprì che pazienti con leucemia mieloide cronica hanno il cromosoma Philadelphia → questa condizione ha un'origine genetica. Si intuì che la presenza del riarrangiamento cromosomico avvantaggia la cellula tumorale.

Si stabilì come chiamare e ordinare i cromosomi: ordinati dal più grande al più piccolo, raggruppati in base alla morfologia. Esistono alcuni cromosomi non distinguibili per grandezza e morfologia fra loro; fino agli anni '70 con il cariotipo mediante colorazione con Giemsa possiamo identificare solo anomalie numeriche, ma non riarrangiamenti strutturali più piccoli → con l'introduzione del bandeggio cromosomico siamo capaci. Agli inizi del 1970 si misero a punto tecniche di bandeggio che permisero di identificare in modo inequivocabile i diversi cromosomi. Il primo bandeggio è con quinacrina → ogni cromosoma ha bande fluorescenti e specifiche. Sono state messe a punto altre metodiche come il bandeggio G (bande chiare e scure).

Questo ha permesso di identificare e capire meglio anomalie strutturali → Philadelphia è dovuto a riarrangiamenti tra cromosomi 22 e 9. Le tecniche sono state implementate, la citogenetica classica che ha risoluzione di circa 10 megabasi → per anomalie al di sotto di questa soglia abbiamo citogenetica molecolare.

Preparazione

• Allestimento coltura
• Preparazione dei vetrini
• Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
• Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi, acquisizione delle immagini e ricostruzione del cariotipo

I cromosomi sono identificabili solo in metafase → dobbiamo scegliere cellule che sappiano dividersi bene per bloccarle in metafase. Per la citogenetica clinica classica le fonti sono sangue periferico (non invasivo e facile da ottenere), la fonte dipende da quale cellula voglio analizzare → per un paziente con leucemia mieloide cronica va analizzato il midollo, posso usare tessuti solidi, in ambito prenatale cellule fetali presenti nel liquido amniotico. Tutte le cellule devono essere in grado di dividersi.

Coltura delle cellule

Aggiungo al campione anticoagulanti (eparina) e litio, metto il sangue in terreni (soluzioni saline isotoniche, aminoacidi, vitamine, nucleotidi, indicatore pH) con sieri (additivo insostituibile, proteine, fattori di crescita, zuccheri) e mitogeni (PHA: mucoproteina linfociti T; LPS e ConA: linfociti B midollo dipendenti). Aggiungo colchicina, vinblastina, farmaci che inibiscono il fuso mitotico → impediscono che la cellula passi in anafase. Lascio in coltura per 48-96h, mezz'ora prima aggiungo colchicina, centrifugo, ottengo un pellet che risospendo in soluzione ipotonica e centrifugo e aggiungo fissativo (acido acetico e metanolo in 3:1).

Ciclo cellulare e preparati

Il ciclo cellulare dei linfociti T dura 24h → per avere un numero sufficiente di cellule aspetto 48-96h per poi analizzarle, posso usare anche fibroblasti che possono dividersi spontaneamente. Per prelevare fibroblasti faccio un carotaggio → prelievo più invasivo, si usa quando devo analizzare più tessuti come nel caso del mosaicismo; a volte i riarrangiamenti avvengono dopo la formazione dello zigote → cellule con riarrangiamento e cellule normali; a volte il paziente ha fenotipo che ricorda anomalie cromosomiche o puntiformi e analizzando il sangue il cariotipo è normale, ma il paziente ha particolare fenotipo → analizzo altri tessuti per confermare la diagnosi clinica. Tutto deve essere effettuato correttamente, per avere un preparato da utilizzare bisogna tenere conto di temperatura (20°C) e umidità (50%), ogni laboratorio ha le proprie particolarità per avere un preparato ottimale.

Classificazione

I cromosomi sono classificati in base a morfologia e grandezza, distinguiamo tre forme:

• Metacentrici: braccia uguali
• Submetacentrici: braccio corto molto più corto
• Acrocentrici: braccio corto costituito solo da eterocromatina e DNA ripetuto per rRNA in tandem → è su tutti e 5 i cromosomi acrocentrici

Tecniche di bandeggio cromosomico

I bandeggi usati sono:

• Bande G: trattamento con soluzione salina con tripsina (degrada proteina dello scaffold cromosomico), colorazione con Giemsa. Bande scure ricche in AT
• Bande Q: colorazione con quinacrina, colorante fluorescente che non si lega preferenzialmente alle zone ricche in AT. Nelle regioni ricche in AT la fluorescenza è più stabile e quindi più "luminosa" perché decade più lentamente. La quinacrina si lega in maniera uniforme lungo tutto il cromosoma
• Bande R: denaturazione al calore in soluzione salina, poi colorazione con Giemsa. Denaturazione delle zone ricche in A e T, quindi si ottiene un pattern di bandeggio reverse rispetto al bandeggio G. Ci sono due metodiche:
  • RHG (R-banding by heat using Giemsa): denaturazione con il calore (85°C) delle proteine e DNA AT-rich, mentre restano nella forma nativa le regioni GC-rich riconosciute da questo bandeggio attraverso la colorazione con Giemsa. Bande scure = ricche in GC. Bande chiare = ricche in AT perché il trattamento con il calore denatura il DNA ricco in AT
  • RBA: si ottiene aggiungendo in coltura nella fase tardiva S del BrdU (Bromodiossiuridina) con incorporazione dello stesso solo nel DNA che si replica tardivamente. I cromosomi ottenuti vengono colorati con Arancio di Acridina. Bande fluorescenti = ricche in GC; bande poco fluorescenti (+ spente) = ricche in AT incorporazione di BrdU e X inattivo (replica tardivamente)
• Bande C: non serve a identificare il cariotipo, è utile in diagnosi prenatale, è possibile riscontrare cariotipo anomalo con presenza di un piccolo cromosoma in più. Questo bandeggio aiuta a vedere se questo marcatore sovrannumerario è composto da eterocromatina → rischio di avere feto affetto basso

Analisi

Sempre con BrdU, facendo fare due cicli cellulari, ho che un filamento di DNA ha DNA con BrdU, mentre l'altro ha solo una parte e posso distinguerli. Nella sindrome di Bloom, che causa deficit della funzione di elicasi, abbiamo un aumento di rotture cromosomiche e scambi tra cromatidi fratelli, i pazienti hanno predisposizione all'insorgenza di tumori. Uso questa tecnica per confermare il sospetto clinico perché esistono diversi scambi che in individui normali non sono presenti (10 volte di più) → cromosomi con pezzi chiari e pezzi scuri.

Un altro esempio per analizzare il cariotipo è in saggi funzionali: nell'anemia di Fanconi abbiamo coinvolti i geni del riparo del DNA, i pazienti hanno aumentata predisposizione a tumori e hanno incapacità di produzione di cellule del sangue (anemia). Se il clinico sospetta una patologia simile, il citogenetista mette in coltura le cellule e usa diepossibutano per vedere se ho cromosomi riarrangiati. Oggi non si usa più tanto questa tecnica → uso NGS, sono test di secondo livello.

Dopo aver bandeggiato le metafasi, alcuni laboratori decidono di eleggere al microscopio i cromosomi di 10 metafasi, se sono 46 ne prendo altre e le salvo e poi viene ricostruito il cariotipo.

Cariotipo normale

Il cariotipo normale è:

• 46,XX : cariotipo normale femminile
• 46,XY: cariotipo normale maschile

Questo modo di scrivere ci dà due informazioni:

• Numero totale dei cromosomi (46)
• Sesso dell'organismo

I cromosomi sono identificati grazie a ISCN → ogni cromosoma può essere identificato da tecniche di colorazione specifiche. Ogni cromosoma è caratterizzato da una serie di bande, ogni banda è indicata con un numero. Ogni braccio è distinto in regioni, la numerazione parte dalla regione prossimale al centromero, ogni regione ha diverse bande numerate dalla regione prossimale al centromero.

Polimorfismi

Posso fare un confronto tra loro due omologhi per capire se abbiamo riarrangiamento, possiamo avere polimorfismi → frequenza nella popolazione maggiore dell'1%. Esistono alcuni cromosomi che hanno questi polimorfismi, le regioni spesso implicate in questi polimorfismi sono le sequenze centromeriche e braccio corto di cromosomi acrocentrici. Possiamo avere:

• Variazione della grandezza del braccio lungo del cromosoma Y
• Variazione dei satelliti dei cromosomi acrocentrici
• Variazione dell'eterocromatina pericentromerica in cromosomi 1, 9, 16

I polimorfismi sono importanti perché possono essere usati come marcatori → posso capire osservando il cariotipo da chi è stato ereditato il cromosoma. È stato teorizzato che esistono forme di malattie derivate da disomia uniparentale → entrambi i cromosomi di una coppia di omologhi derivano dalla madre o dal padre. Esistono disordini da imprinting dove, per esempio, sul cromosoma 15 alcuni geni sono espressi solo come allele materno e altri solo come paterno → condizione patologica.

Esistono polimorfismi di regioni eucromatiniche che riguardano cromosomi 9 e 18 → il numero di copie di questi geni può variare tanto da sembrare diversi, ma non abbiamo fenotipo patologico → geni non sensibili a dosaggio. Siti fragili sono una specifica regione cromosomica che appare come un intervallo non colorato (gap) o come una franca rottura sul cromosoma metafasico, sono una sorta di artefatto.

Anomalie cromosomiche di numero

Per anomalie cromosomiche si intendono le mutazioni che producono un'alterazione cromosomica. Possono essere suddivise in anomalie di numero e anomalie di struttura. Entrambe queste anomalie possono essere inoltre suddivise in anomalie costituzionali (se presente alla nascita) oppure anomalie somatiche o acquisite (se acquisita in un secondo momento → fase post zigotica, es. cancro, ma anche altre condizioni). Non tutte le alterazioni cromosomiche possono essere identificate perché esiste un limite di risoluzione della citogenetica standard pari a 5-10 Mb. Possono essere:

• Bilanciate: nella maggioranza dei casi non sono correlate ad un fenotipo anomalo, non c'è né perdita né acquisizione di materiale genetico
• Sbilanciate: sono correlate ad un fenotipo anomalo (malformazioni multiple e congenite e/o disabilità intellettiva → fenotipo cromosomico)

Cariotipo sotto presente nel 3% dei pazienti con sindrome di Down → ha 46 cromosomi, ma sul 14 ha un cromosoma soprannumerario del 21 → situazione sbilanciata (un 21 in più), questa situazione viene ereditata da un genitore con traslocazione robertsoniana portatore sano (condizione bilanciata → 1:1000). Cariotipo in alto a 45 cromosomi, è presente solo un cromosoma 21, il secondo 21 è attaccato al 14 → situazione bilanciata.

Tipi di anomalie cromosomiche

Le anomalie cromosomiche si dividono in:

• Del numero
  • Poliploidie: triploidie, tetraploidie
  • Aneuploidi: trisomie, monosomie
• Della struttura
  • Sbilanciate:
    • Delezioni
    • Duplicazioni
    • Isocromosomi
    • Cromosomi ad anello
    • Marcatori soprannumerari
  • Bilanciate:
    • Traslocazioni (reciproche e robertsoniane)
    • Inversioni (paracentriche e pericentriche)
    • Inserzioni

Gravità delle anomalie cromosomiche

La gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità di geni interessati → correla con la grandezza del segmento e dalla sua densità genica e dalla presenza di geni sensibili al dosaggio. Tanto è più grave è lo sbilanciamento cromosomico tanto più grave sarà il fenotipo o più precoce l'aborto spontaneo.

Anomalie cromosomiche di numero

Le anomalie cromosomiche di numero rappresentano la patologia più frequente del concepimento e, nonostante la fortissima selezione naturale mediante l'aborto spontaneo, la loro frequenza alla nascita è elevata. La frequenza delle alterazioni del cariotipo alla nascita, in assenza di diagnosi prenatale, è meno dell'1%. Le situazioni bilanciate sono più frequenti perché non correlano con fenotipo patologico.

Euploidia: un esatto multiplo del numero cromosomico aploide (n) è definito euploide. Le normali cellule somatiche con 46 cromosomi sono cellule euploidi. Cellule poliploidi sono euploidi, la poliploidia è la costituzione cromosomica di una cellula, o di un organismo che possiede tre o più assetti cromosomici n:

• Triploidi: contengono un set completo in più di cromosomi (3n)
• Tetraploidi: contengono due set completi in più di cromosomi (4n)

Aneuploidia: categoria di anomalie che non coinvolge un intero set cromosomico. Le anomalie di numero di singoli cromosomi sono chiamate aneuploidie. La presenza di tre copie dello stesso cromosoma è chiamata trisomia, di quattro copie tetrasomia, di una sola copia monosomia.

Poliploidie

Triploidie: nella triploidia per ogni cromosoma ho tre copie. Una cellula triploide ha 69 cromosomi (3n), con cariotipo 69,XXX, 69XYY o 69,XXY. Le triploidie rappresentano una delle cause più comuni di aborto spontaneo (15% di tutte le anomalie cromosomiche riscontrate nei materiali abortivi). Possono essere:

• Causate da una doppia fertilizzazione (66%) → un set cromosomico di origine materna e due paterni
• Causate da una errata divisione meiotica della cellula uovo (es. ritenzione del corpo polare, 10%) o del gamete maschile (24%)

Il tessuto abortivo con due set paterni ha morfologia diversa dovuta ad imprinting → molto sviluppati gli annessi embrionali; se sono due della madre gli annessi embrionali sono poco sviluppati. Questo è dovuto al fatto che il genoma materno non è uguale dal punto di vista funzionale a quello paterno.

Tetraploidie

Ha cariotipo 92,XXXX o XXYY. Non si osserva un cariotipo 92,XXXY o XYYY, questo fa pensare che il meccanismo di origine di questa condizione sia dovuto a una endoreduplicazione → sintesi di DNA non seguita da una divisione del nucleo. Cellule tetraploidi si possono trovare in tumori solidi, aborti spontanei (6% aborti spontanei con causa cromosomica). Sono stati osservati pazienti con queste condizioni a mosaico, sono molto rari → una situazione a mosaico non è facilmente identificabile.

Aneuploidi

Si definiscono aneuploidi cellule con cromosomi in più o in meno ma non equivalente ad un multiplo esatto del corredo aploide. Rappresentano le più frequenti aberrazioni cromosomiche numeriche:

• Trisomie: presenza di un cromosoma aggiuntivo
• Tetrasomie: presenza di due cromosomi aggiuntivi
• Monosomie: mancanza di un cromosoma

L'aneuploidia è il principale fattore eziologico alla base di un alterato sviluppo fetale e, nella maggior parte dei casi, esita in aborto. La frequenza nei nati vivi è 0,36%. Il principale meccanismo all'origine è la non-disgiunzione cromosomica durante la meiosi (1 e 2), ma che può avvenire anche in mitosi → rischio correlato all'età materna. Generalmente la non disgiunzione nella gametogenesi femminile avviene nella prima meiosi → non avviene disgiunzione dei due cromosomi omologhi, nella maschile durante la seconda. Può avvenire anche in fase...