Appunti di Citologia per esame

Introduzione alla biologia

La biologia (dal greco βιολογία, composto da bìos, vita e lògos, studio) è la scienza che studia tutto ciò che riguarda la vita e gli esseri viventi. Vivere è l'insieme delle funzioni che rendono un organismo animale o vegetale capace di conservarsi, svilupparsi, riprodursi e mettersi in rapporto con l'ambiente e con gli altri organismi. Per l’essere vivente, vivere significa avere un grado di complessità direttamente correlato al proprio livello di organizzazione. Gli esseri viventi sono organismi costituiti da cellule e le cellule sono le unità fondamentali della vita. Esse sono piccole unità racchiuse da una membrana e piene di una soluzione acquosa concentrata di sostanze chimiche, che sono capaci di crescere e dividersi in due creando copie di sé stesse.

La cellula è composta da varie componenti, ognuna con il suo ruolo ben preciso e ognuna in stretta relazione con le altre. Nella cellula tutto è estremamente organizzato, nulla è lasciato al caso: ogni reazione chimica che avviene non è fine a sé stessa ma è l’inizio di un’altra reazione. Le forme di vita più semplici sono cellule solitarie e sono dette organismi unicellulari (microrganismi, batteri, lieviti e amebe). Gli organismi superiori (pluricellulari), compresa la specie umana, sono comunità di cellule derivate per crescita e divisione da una singola cellula fondatrice e sono costituiti da un numero variabile di cellule: da poche decine fino a 30 miliardi nell’uomo. Ogni animale o pianta è costituito da un’immensa colonia di singole cellule organizzate in tessuti che compiono funzioni specializzate, regolate tramite un intricato sistema di comunicazione cellula-cellula.

Le specie viventi sul nostro pianeta sono almeno 100 milioni. Le cellule non sono tutte uguali, anzi sono estremamente diverse. Le cellule differiscono per:

• Dimensioni: la maggior parte delle cellule ha dimensioni comprese tra 1 e 100 micrometri. Ci sono delle eccezioni: una cellula nervosa può avere prolungamenti lunghissimi, anche di oltre un metro. I prolungamenti delle cellule nervose, pur essendo molto lunghi, sono estremamente sottili e gli scambi avvengono con facilità. Un uovo di gallina, formato da una sola cellula, ha un diametro di 5-8 centimetri. Le uova, pur essendo talvolta enormi, sono in gran parte occupate da sostanze nutrienti di riserva. La porzione metabolicamente attiva è limitata ad una piccola e sottile area superficiale di poche decine di µm.
• Forma: le cellule sono altrettanto variabili per la loro forma. Possono essere filamentose (nei funghi), sferiche (cellula uovo) e assumere altre forme in base a fattori chimici e fisici.
• Metabolismo: le cellule differiscono anche per le sostanze chimiche di cui necessitano. Per alcune l’ossigeno è indispensabile, mentre per altre è letale; alcune hanno bisogno di aria, acqua e luce mentre altre necessitano di una miscela complessa di molecole prodotte da altre cellule.
• Funzione: alcune cellule si presentano come produttori specializzati di particolari sostanze (come grasso, pigmenti e ormoni). Altre funzionano da motori, come le cellule muscolari che bruciano combustibile per svolgere lavoro meccanico. Altre ancora sono generatori elettrici (anguilla elettrica).

Perché le cellule sono così piccole?

1. Mantenimento di adeguate concentrazioni di molecole coinvolte nei processi cellulari: perché una reazione chimica possa avvenire, i reagenti devono avere un’adeguata concentrazione. Maggiore è la dimensione, maggiori devono essere le capacità sintetiche della cellula per mantenere tali concentrazioni.
2. Velocità di diffusione: minore sarà il volume della cellula minore sarà il tempo impiegato da una molecola per spostarsi da una parte all’altra della cellula.
3. Necessità di un adeguato rapporto volume/superficie: gli scambi nutritivi avvengono attraverso la superficie della cellula. In una cellula sferica la superficie varia con il quadrato del raggio (A=4πR²) mentre il volume varia secondo la terza potenza del raggio (V=4πR³/3). Una cellula del diametro di 100 micrometri ha un volume 1000 volte maggiore di una cellula di 10 micrometri, mentre la superficie è soltanto 100 volte maggiore. Più la cellula è grande, meno efficienti saranno gli scambi attraverso la superficie.

Secondo la legge di Driesch, un grande organismo non avrà grandi cellule; le cellule di un elefante non sono più grandi di quelle di una formica, semplicemente sono di più.

Introduzione alla citologia e istologia

La citologia (dal greco kytos, contenitore e logos, studio) è lo studio della cellula. L’istologia (dal greco istos, tela e logos, studio) è lo studio dei tessuti e degli organi. L’origine e il progredire dello studio della cellula sono strettamente connessi allo sviluppo di strumenti e di metodiche sempre più potenti che hanno consentito di osservare la cellula e gli organelli in essi contenuti. L’origine della citologia risale alla fine del 1500 con l’invenzione del microscopio ottico composto ad opera di Zacharias Jansenn. Nel 1665, Robert Hooke esaminò al microscopio la sezione di un sughero osservando una struttura costituita da tante piccole camere, simili a celle del convento, in latino cellule. Antoni van Leeuwenhoek, grazie a sistemi di ingrandimenti di sua invenzione (microscopio ottico semplice), individuò dapprima i protozoi e successivamente i batteri. Occorsero più di due secoli dalle prime osservazioni perché gli studiosi di scienze naturali riuscissero ad andare al di là delle pure e semplici osservazioni e comprendessero la reale importanza delle cellule per gli esseri viventi.

Robert Brown nel 1833 studiando in vivo le cellule di un’orchidea osservava al loro interno un globulo centrale che chiamò nocciolo (in latino nucleo). Nel 1857, Albert von Kölliker descrive i mitocondri nelle cellule muscolari. Teodor Schwann e Matthias Schleiden (1838), e successivamente Rudolf Virchof (1855), formulano la teoria cellulare che afferma: tutti gli organismi consistono di una o più cellule; la cellula è la più piccola entità vivente identificabile ed autonoma; tutte le cellule derivano da cellule preesistenti. Oggi sappiamo che la cellula possiede delle proprietà essenziali che le permettono di essere autonoma: membrana plasmatica (separa la cellula dall'ambiente), genoma (codifica tutte le strutture cellulari), trasferimento dell'informazione (esprime l'informazione immagazzinata nel codice genetico), utilizzazione dell'energia (raccoglie l'energia per formare componenti più complessi).

Ci sono delle eccezioni alla teoria cellulare: non tutte le cellule sono microscopiche (la cellula uovo umana raggiunge i 200 µm); non vi è sempre un solo nucleo (sincizi e plasmodi nel muscolo scheletrico); la materia vivente non è fatta solo di cellule (tessuti con elementi extracellulari come il tessuto connettivo); l’autonomia cellulare non è assoluta: ci possono essere interazioni tra cellule e inibizione da contatto; i virus sono organismi viventi non cellulari. L’osservazione al microscopio ha permesso di distinguere due grandi categorie di esseri viventi: i procarioti e gli eucarioti, che si basano su una differenza basilare: presenza e assenza del nucleo. Eucarioti (dal greco eu, preciso e karyion, nucleo); procarioti (dal greco pro, prima).

Procarioti

Spesso sono rivestiti da parete cellulare posta attorno alla membrana plasmatica; non presentano organelli intracellulari; hanno una forma sferica, bastoncello, elicoidale e dimensioni ridotte (2 μm); sono unicellulari ma alcune si uniscono in catene, gruppi o altre strutture organizzate. Si riproducono in maniera asessuata molto rapidamente (in condizioni ottimali 20 minuti). Nell’arco di 11 ore da una singola cellula procariotica si potrebbero generare più di 8 miliardi di discendenti.

I procarioti sembrano semplici e limitati quanto a forma e struttura, ma sono presenti in tutti gli ambienti del nostro pianeta, dal nostro organismo alle profondità marine o al sottosuolo, dal gelo fino alle pozze bollenti dei fanghi dei vulcani a temperature superiori a 100 °C. Sono presenti in molti milioni di specie diverse (soltanto nelle nostre cavità gengivali almeno 415 specie mentre nella microflora intestinale da 500 a 1000 specie). Grazie al loro elevato tasso di crescita e alla loro diversità in termini biochimici, sono le cellule più diversificate e versatili di tutte. Non esiste materiale organico ricco di carbonio, dal legno al petrolio, cui non corrisponda un batterio capace di utilizzarlo come alimento. Alcuni procarioti vivono interamente a spese di sostanze inorganiche ricavando il carbonio da CO₂, l’azoto da N₂ atmosferico e l’ossigeno, l’idrogeno, lo zolfo e il fosforo dall’aria, dall’acqua o da minerali inorganici.

I procarioti si dividono in due:

• Batteri (eubatteri): maggior parte dei procarioti che si incontra nella vita di tutti i giorni (responsabili di malattie, nel suolo).
• Archea (archeobatteri): vivono anche in habitat estremi (sorgenti vulcaniche, fondali marini, pozze coperte di ghiaccio dell’Antartide, stomaco dei ruminanti).

Eucarioti

(animali, piante, funghi e altri organismi semplici come protisti): possono essere unicellulari o pluricellulari, presentano organelli intracellulari, svolgono riproduzione sia asessuata che sessuata. Il citoplasma è tutta la regione compresa tra l’Involucro nucleare e la membrana plasmatica, comprende gli organelli cellulari. Il citosol è la sostanza semifluida che si trova nel citoplasma e contiene proteine, enzimi, sali minerali e le sostanze solubili; non comprende gli organelli cellulari. Il nucleo è l’organello cellulare più grande e racchiude il DNA; è racchiuso da un involucro nucleare formato da una doppia membrana.

Sistema di endomembrane: le membrane degli organelli cellulari sono in relazione le une con le altre (involucro nucleare, reticolo endoplasmatico, vescicole di trasporto, apparato del Golgi, lisosomi, membrana plasmatica). Il reticolo endoplasmatico è costituito da un complesso sistema di membrane che crea un insieme di tubuli e cisterne intercomunicanti. È sede di sintesi di molti composti, tra cui le stesse componenti delle membrane, lipidi e proteine. L’apparato del Golgi è costituito da un complesso sistema di membrane e rappresenta la centrale di rielaborazione e smistamento delle proteine derivanti dal reticolo endoplasmatico.

I lisosomi sono circondati da membrana e contengono enzimi destinati a digerire materiale fagocitato dalla cellula o organelli cellulari destinati alla demolizione. I mitocondri sono presenti sia in cellule vegetali che animali e sono degli organelli deputati alla respirazione cellulare con una doppia membrana ed un proprio DNA; svolgono un processo catabolico, esoergonico aerobico; estraggono energia da macromolecole organiche (glucosio) per produrre ATP. I cloroplasti sono presenti solo in cellule vegetali e sono organelli con una doppia membrana ed un proprio DNA e sono deputati alla fotosintesi; svolgono un processo anabolico, endoergonico, anaerobico; converte l’energia luminosa ed acqua in macromolecole organiche.

Il nucleolo è una regione del nucleo in cui i ribosomi vengono sintetizzati; possono esserci anche più nucleoli per nucleo. I ribosomi si trovano nel nucleo e sono composti per il 60% da proteine e per il 40% da RNA ribosomiale; sono sito della sintesi delle proteine. Il citoscheletro è una rete di fibre che si spande in tutto il citoplasma; ha la funzione di supporto cellulare e movimento.

Analogies between eucarioti and procarioti

Composizione chimica simile, informazione genetica con lo stesso codice, vie metaboliche simili, membrane cellulari di composizione e struttura simili, meccanismi simili per la conservazione e la trasformazione dell’energia, meccanismi simili per la conservazione e l’utilizzazione dell’informazione genetica.

Evoluzione cellulare: diverse teorie proposte

Tutte le cellule attuali si sono evolute da un progenitore comune: gli eucarioti si sono evoluti dai procarioti circa 1,5 miliardi di anni fa. Ci sono diverse teorie sull’evoluzione degli eucarioti come la teoria della fusione e la teoria dell’inglobamento o dell’endosimbionte.

Teoria dell’invaginazione: l’invaginazione della membrana plasmatica dei procarioti ha dato origine agli organelli intracellulari ed al sistema di endomembrane.

Teoria dell’endosimbionte: due organismi che vivono in stretta collaborazione, uno all’interno dell’altro, traendone reciproco vantaggio. Consiste nel movimento di piccoli procarioti eterotrofi e aerobici (mitocondri) o autotrofi (cloroplasti) all’interno di cellule pre-eucariotiche anaerobiche più grandi. Entrambe traggono reciproco vantaggio perché la cellula pre-eucariotica diventa aerobica mentre il mitocondrio non viene espulso dalla cellula e può continuare a vivere al suo interno.

Eccezioni alla teoria cellulare

I virus possono riprodursi e mutare il loro genoma ma non hanno metabolismo autonomo (utilizzare, produrre o trasformare energia). Un virus (dal latino tossina) è una molecola di acido nucleico confezionata in un involucro proteico. Il DNA virale entra nella cellula ospite e la cellula infettata esegue il programma contenuto nel DNA virale, producendo molte copie del virus. Le nuove copie del virus escono e infettano altre cellule; tutti i virus sono parassiti obbligati di animali, piante o batteri. Al di fuori dell’ospite sono inerti, non hanno un proprio apparato per la sintesi proteica.

I virus sono classificati in base al tipo di cellula parassitata (virus vegetali, animali, batteriofagi), al tipo di acido nucleico che funge da genoma (desossiribovirus DNA e ribovirus se RNA) e alla forma (simmetria cubica, elicoidale, complessa). Il virus dell’epatite C è l'agente responsabile dell’epatite virale C. Il materiale genetico del virus è costituito da una molecola di RNA a filamento singolo. Il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) è l'agente responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). L’HIV ha una struttura sferica del diametro di circa 100-120 nm. Il materiale genetico del virus è costituito da due copie di RNA identiche. I viroidi sono piccole molecole di RNA chiuse ad anello e capaci di auto replicazione; normalmente parassitano cellule vegetali. Il prione è una molecola proteica che in particolari condizioni modifica la propria configurazione acquisendo la capacità di trasmettere i propri caratteri alle molecole sane alterandone il significato biologico (agente eziologico della sindrome della mucca pazza).

Metodi di studio: approcci strumentali

Le cellule possono essere studiate da un punto di vista: morfologico, studia l’organizzazione strutturale della cellula e delle sue diverse componenti; biochimico e funzionale, studia la natura chimica e il funzionamento delle cellule. Lo studio delle cellule e dei tessuti oggi si avvale di numerose tecniche e in questo contesto il microscopio è uno strumento fondamentale. Gli studi su cellule, tessuti e organi si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi e sulle relative procedure. Esistono diversi metodi di microscopia: la microscopia ottica, la microscopia elettronica, la microscopia a fluorescenza, la microscopia FTIR. La risoluzione è la distanza minima a cui si distinguono due oggetti: la risoluzione dell’occhio è di 0.2 mm (200 µm), la risoluzione del microscopio ottico è di 200 nm (2,000 Angstroms), la risoluzione del microscopio elettronico a trasmissione è di 2 Angstroms (0,2 nm).

Il microscopio ottico ha un limite di ingrandimento massimo di circa 1000, questo permette di riconoscere la forma delle cellule e di individuarne alcuni dei dettagli più grandi (nucleo). Aumentando l’ingrandimento oltre i 1000 non aumentano i dettagli, cioè non aumenta l’informazione. Una cellula al microscopio è scarsamente visibile, in quanto trasparente e praticamente incolore. Occorre utilizzare coloranti per aumentare il contrasto tra le varie componenti della cellula:

• Coloranti vitali: le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento. Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente strutture cellulari diverse.
• Coloranti che richiedono fissazione: le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule.

Preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica

• Acquisizione del campione (tessuto) tagliandolo in pezzi di 1 cm³.
• Fissazione (fisica o chimica) per immobilizzare e preservare i tessuti che sono molli e fragili; la fissazione deve essere fatta rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il tessuto. La fissazione chimica avviene per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) e conservazione in etanolo al 75%. Il campione viene incluso in paraffina o resina calda, la paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione. La fissazione fisica avviene per congelamento tramite il criotomo (5-20µm). Il vibratomo è un macchinario che ha una lama vibrante che permette di tagliare un campione fresco senza fissazione o congelamento (20-50 µm).
• Taglio in sezioni sottili per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 µm. Le sezioni vengono montate su vetrini per microscopia e in base a come il campione viene posizionato nel blocchetto di paraffina si avranno diversi tipi di sezioni: piano trasverso, piano frontale (o coronale) e piano sagittale.
• Colorazioni (istologiche) permettono di colorare i vari compartimenti cellulari per l’osservazione dettagliata.