Appunti del modulo di Genetica molecolare umana

Genetica molecolare umana

Progetto genoma umano

Il genoma umano ha portato al sequenziamento di parte del genoma, una parte è rimasta fuori ed è rappresentata ad esempio da centromeri che sono costituiti da sequenze ripetute.

Tappe fondamentali

• '53: Watson e Crick determinano la struttura del DNA
• '77: Maxam e Gilbert e Sanger mettono a punto due modi per sequenziare il genoma umano
• '85: Mullis inventa la PCR
• '86: Vengono stanziati soldi per il progetto
• '90: Viene istituito sotto la guida di Watson l’HGP che distribuisce diversi cromosomi a diversi laboratori (Italia Y)

L'intervento di forze esterne, ovvero company privata, fa cambiare l'approccio iniziale e si passa alla costruzione di tre grandi centri.

Obiettivi del progetto

• Identificare tutti i geni contenuti nel genoma umano
• Determinare la sequenza di 3 miliardi di basi che compongono il DNA umano
• Sviluppare tecnologie di sequenziamento più rapide ed economiche
• Catalogare queste informazioni in database informatici
• Sviluppare programmi per l’analisi delle sequenze
• Rispondere a quesiti etici, legali e sociali legati allo svolgimento del progetto

Un passo importante è stata l’invenzione di macchine che possono automaticamente sequenziare il genoma come l’elettroforesi capillare che restituisce un elettroferogramma. Le nuove macchine possono sequenziare 300 mila basi al giorno, il costo per base diminuisce negli anni, nell’ '85 era 10 $ e nel '93 0.10 $ → da 30 miliardi a un milione di dollari.

Pietre miliari di HGP

Nel '92 Venter lascia il progetto pubblico e ne apre uno parallelo privatamente a scopo di lucro → Celera Genomics. I due progetti corrono perché vogliono arrivare entrambi al completo sequenziamento del genoma umano. I primi cromosomi ad essere sequenziati sono stati il 21 e il 22 (sono i più piccoli).

Se Celera avesse pubblicato per prima i suoi dati, le sequenze sarebbero state brevettate. Gli scienziati del progetto pubblico velocizzano il sequenziamento, nel '99 erano al 9% e nel 2000 al 90%. Celera era riuscita a sequenziare prima il genoma ma è stata fermata dal pubblicarlo → le sequenze sono pubblicate insieme. Il progetto genoma umano prosegue per riempire i buchi.

Sequenziamento

Approcci

Celera ha un approccio shotgun: prendiamo tutto il DNA e lo sonichiamo, cloniamo i frammenti ottenuti in plasmidi e poi sequenziamo il tutto. Assemblo il genoma in base a frammenti sovrapposti e sequenze note presenti nella banca dati forniti da HGP. Dal punto di vista metodologico è un processo rapido, ma richiede un enorme lavoro dei software.

L’approccio di HGP è un approccio gerarchico, si cerca di generare frammenti contigui, selezioniamo il clone più rappresentativo, lo suddividiamo in frammenti più piccoli e lo sequenziamo (shotgun nel singolo contiguo). Creo delle librerie genomiche clonando i frammenti in vettori BAC (hanno origine di replicazione più bassa), se sequenziamo le estremità dei cloni possiamo metterli insieme. Il primo step è rimettere insieme i contigui, poi si scelgono cloni più rappresentativi che sono sequenziati. È un metodo più lento ma più sicuro. Le librerie sono instabili e in alcuni casi il clonaggio è difficile, inoltre devono essere costruite librerie di subcloni.

Banche dati

Nelle banche dati bisogna depositare tutto quello che concerne una determinata sequenza:

• Posizione dei geni
• Struttura esoni-introni
• Inizio e termine della trascrizione
• Posizione regioni di controllo
• Eventuali splicing alternativi
• Sequenza delle proteine codificate
• Profili di espressione
• Funzioni biologiche (gene ontology: funzione molecolare, processo biologico, compartimento cellulare)
• Identificazione di geni ortologhi e paraloghi
• Sequenze ripetute
• Polimorfismi

Il genoma umano è uguale al 99.9% tra i diversi individui, lo 0.1% è variabile.

Risultati

I risultati dell'HGP sono stati il sequenziamento e mappaggio del genoma umano con l'identificazione dei geni e di sequenze potenzialmente codificanti, il sequenziamento e mappaggio del genoma di organismi modello, lo sviluppo di tecnologie di analisi dedicate, lo studio delle implicazioni etiche, sociali e legali e la diffusione dei dati attraverso database pubblici. Nella ricerca di base sono stati scoperti meccanismi biochimici e molecolari alla base della biologia della cellula, della biologia dello sviluppo e sono state svolte ricerche antropologiche.

Il progetto ha permesso di studiare la medicina molecolare e le malattie ereditarie, questo ha permesso la diagnosi e il trattamento delle malattie ereditarie e dei tumori e l’identificazione di circa 5.000 malattie ereditarie monogeniche. È più facile studiare la funzione di un gene partendo dal gene malato rispetto a quello sano.

Implicazioni etiche e legali

Le implicazioni etiche e sociali sono importanti infatti bisogna stabilire chi può avere accesso a informazioni genetiche personali e come queste potranno essere usate; chi conserva e controlla tali informazioni; se i geni possono influenzare l’individuo in un particolare aspetto della vita; se potrà una persona controllare il suo aspetto; chi può possedere e manipolare il DNA. Queste informazioni potrebbero essere usate per le assunzioni, per le assicurazioni (sulla salute e nella previdenza), nei processi, nell’istruzione, nelle adozioni e per scopi militari.

Sviluppi di HGP

HGP ha portato allo studio della funzione dei geni e del DNA non codificante, dei meccanismi di controllo dell’espressione genica a livello trascrizionale, traduzionale e post trascrizionale, allo studio delle interazioni tra proteine, all'identificazione della conservazione evolutiva delle funzioni biologiche, allo studio delle variazioni del DNA e suscettibilità alle malattie, all'identificazione di geni coinvolti nelle malattie poligeniche, allo studio della genetica dello sviluppo e cellule staminali.

Progetto ENCODE

È un progetto che ha lo scopo di fare una lista che comprende tutti gli elementi funzionali non genici del genoma umano. Questi elementi includono sequenze regolatrici come promotori, enhancer, silencer, siti di metilazione e di acetilazione e altri elementi coinvolti nel controllo della struttura cromatinica e dell’espressione genica. Include in quali cellule esprimiamo determinati geni, proteine ed RNA → sequenzio l’RNA di una cellula in un determinato momento.

Post genomica

I progetti genoma quindi permettono di ottenere sequenze di riferimento per il genoma umano e i genomi di organismi modello e di molte altre specie. Da questi progetti si può fare uno studio della funzione o dei cambiamenti. Lo studio della funzione è la genomica funzionale e consiste nel catalogare tutti i geni, i prodotti genici e le sequenze regolatrici; definire gli stati della cromatina; studiare le interazioni tra i prodotti genici e sequenze regolatorie. Lo studio dei cambiamenti è la genomica di popolazione e comparativa, la prima consiste nell’ottenere sequenze di genomi da molti individui in diverse popolazioni umane; valutare la variazione genetica all’interno e tra popolazioni umane; definire varianti di DNA specifiche della popolazione; la seconda invece si occupa di confrontare le sequenze tra le specie, compresi i fossili di ominidi; identificare sequenze funzionalmente importanti e in rapida evoluzione; valutare le relazioni evolutive; definire le varianti specifiche del DNA umano.

Malattie e terapie

Le applicazioni del progetto genoma umano sono la ricerca di geni-malattia in patologie mendeliane e la ricerca di geni e mutazioni predisponenti in patologie. L’individuazione dei fattori genetici coinvolti nella determinazione o predisposizione delle malattie permette:

• La definizione della patogenesi
• La diagnosi
• La prevenzione
• La terapia

Le malattie genetiche sono:

• Mendeliane monogeniche: malattia dovuta alla mutazione di un singolo gene; alto rischio di ricorrenza familiare; ca 7000 note (2000 con difetto biochimico noto)
• Multifattoriale: malattia dovuta al coinvolgimento di più geni, molto frequenti; interazione con l’ambiente; basi molecolari e meccanismo patogenetico spesso sconosciuti; predisposizione a sviluppare determinate patologie; l’ambiente ha una grande influenza
• Delle cellule somatiche: a carico generalmente di un unico tipo cellulare; generalmente dovute ad una mutazione ereditata (predisposizione) e una seconda mutazione nelle cellule somatiche

Nell’era della post genomica si identificano i geni-malattia che causano la malattia genetica, si fa una mappatura, si identifica il gene e si fa uno screening della mutazione e posso:

• Avere una diagnosi → prevenzione, per esempio nel caso delle diagnosi prenatali
• Terapia genica
• Difetto biologico → terapia, potrei sostituire il gene malato con uno sano ma spesso si ricorre a una terapia

Non si fa più l’analisi del singolo gene, ma si analizzano più geni e le vie metaboliche (metabolomica). Si studia l’azione del gene e quindi si analizza l’intero proteoma con la regolazione del gene stesso (proteomica). Si studia la patogenesi della malattia. Si passa dalla genomica alla proteomica.

Medicina personalizzata

La medicina genomica fa un’analisi su larga scala del genoma umano e dei suoi prodotti, includendo anche lo studio del controllo dell'espressione genica, della variabilità genica e delle interazioni tra geni e ambiente, al fine praticare cure mediche. Lo scopo è sviluppare la medicina personalizzata che prende in considerazione le differenze genetiche esistenti tra gli individui. Tradizionalmente un medico per porre diagnosi teneva in considerazione: storia familiare, stile di vita, ambiente in cui viveva il paziente. Ora ed in futuro il medico dovrà tenere in considerazione: test genomici e genetici, profilo proteomico e analisi metabolomica.

La post-genomica sta permettendo di attuare in tempi brevi la medicina personalizzata. Il paradigma one drug fits for all è sbagliato. Le nuove tecnologie di sequenziamento permettono di muoversi verso una medicina che viene definita delle 4P:

• Predittiva → un determinato assetto genomico può portare a x
• Preventiva
• Personalizzata
• Partecipativa

Usando analisi molecolari del genoma si possono dividere i pazienti in sottogruppi: quelli che rispondono al trattamento e che non rispondono, oppure quelli per i quali il trattamento è tossico o ben tollerato → riduce gli effetti collaterali.

Organizzazione genoma umano

Il corpo umano ha 10 cellule, ogni cellula ha nucleo (10 µm) con DNA nucleare e tanti genomi mitocondriali all’interno del citoplasma. Il genoma nucleare è suddiviso in 46 cromosomi. Il DNA nucleare è associato a proteine istoniche e non istoniche a formare cromatina con compattamento diverso a seconda della regione di DNA e a seconda dello stato in cui si trova la cellula. La suddivisione dei cromosomi in termini di lunghezza e contenuto di geni codificanti non è egualitaria.

Differenze tra genoma mitocondriale e nucleare

Il genoma mitocondriale è circa 17 kb, il genoma nucleare è 3mila megabasi. Le molecole nucleari sono lineari mentre quelle mitocondriali sono circolari → teoria endosimbiontica. Il genoma mitocondriale non è protetto da membrana ma libero nei mitocondri e non associato a proteine → DNA più soggetto all’esposizione di quello che viene prodotto all'interno del mitocondrio (es. radicali liberi). È più soggetto a mutazioni. Il genoma nucleare contiene circa 20mila, nel mitocondrio sono 37 di cui solo 13 codificanti → geni senza interruzioni e policistronici. La trasmissione del DNA mitocondriale è materna.

Genoma umano

L’eterocromatina costitutiva è solo il 7%, il 93% è eucromatina, ma non corrisponde per forza a geni. Solo il 30% delle sequenze del DNA è correlata ai geni, la rimanente parte è DNA extragenico. All’interno della classe delle sequenze correlate ai geni solo il 10% è costituito da sequenze codificanti, mentre la restante parte sono sequenze non codificanti. Nel DNA extragenico il 20% è costituito da sequenze di DNA ripetute (in tandem o intersperso). L’80% sono DNA a singola copia → sequenze di cui non si conosce la funzione ma potrebbero regolare l’espressione genica.

Da un punto di vista funzionale:

• Copie funzionali di geni
• Sequenze di DNA ripetuto:
  • Sequenze funzionali → famiglie geniche e sequenze non codificanti funzionali
  • Sequenze senza funzioni → eterocromatina centromerica e sequenze in tandem
  • Sequenze trasposte → retrotrasposoni e trasposoni

Paradossi

• Paradosso K: il numero di cromosomi non correla con la complessità del soggetto in analisi
• Paradosso C: la quantità di DNA nucleare di una cellula aploide non è correlata alla complessità di un individuo. Per appartenere a una determinata classe tassonomica serve un quantitativo minimo di DNA, ma all’interno della stessa classe ci sono ampie variazioni di quantitativo. Il numero di sequenze diverse presenti nel genoma determina l'appartenenza a una determinata specie.
• Paradosso N: il numero di geni e la complessità degli organismi non sono correlati

Base del paradosso C

Una grossa acquisizione di complessità è il fatto che i geni non sono continui ma sono costituiti da intervalli di esoni e introni. Gli introni permettono splicing alternativo e essendo molto grandi assorbono le mutazioni. Le proteine possono diventare più complesse grazie all’acquisizione di esoni diversi.

Geni e sequenze non codificanti sono presenti in copie multiple → DNA ripetitivo. I geni in genomi diploidi esistono in due forme alleliche. In aggiunta a questo grado di ripetizione, approssimativamente il 40%, è rappresentato da sequenze di DNA ripetuto non alleliche.

• Famiglie geniche funzionali: svolgono la stessa funzione, ma hanno sequenza diversa
• Famiglie di sequenze di DNA ripetuto non genico: può essere tandem o intersperso

Un’acquisizione di complessità del genoma è legato all’aumento di sequenze ripetute non codificanti.

Cinetiche di riassociazione

Prendo il DNA e lo denaturato, lo lascio poi rinaturare. L’andamento della curva Cot è funzione di due fattori:

• Le dimensioni del genoma: se paragoniamo genomi di diverse dimensioni a parità di concentrazione di DNA il numero di sequenze uniche sarà diverso
• La presenza e quantità di DNA ripetuto: se paragoniamo uguali concentrazioni di genomi di identiche dimensioni. Le sequenze ripetute assoceranno più rapidamente.

A parità di quantità di DNA ripetuto, la Cot ½ è direttamente correlata alla quantità di DNA in un genoma Co: più il genoma è grande, meno copie ci saranno di una data sequenza in una certa massa di DNA. Se denaturo il DNA umano ottengo una curva a tre gobbe → la cinetica di riassociazione del DNA è rapida per le sequenze ripetute, intermedia per le sequenze moderatamente ripetute e lenta per le sequenze uniche.

GENI

Ci sono vari tipi di geni:

• Geni che codificano per pp
• Geni che codificano per RNA funzionali → sistema di acquisizione di complessità.

Quando si parla di geni si parla di geni genomici con promotore prossimale e distale, esoni ed introni, sito poly A e UTR. In Drosophila in genere i geni sono costituiti al massimo da 10 esoni, nei mammiferi circa il 50% dei geni ha più di 10 esoni. Negli eucarioti inferiori il 96% dei geni non ha introni. Geni interrotti possono dare splicing alternativi, i mammiferi in genere hanno 5 esoni, ma alcuni geni hanno anche più di 60 esoni. La grandezza dei geni è variabile mediamente. I geni in lievito hanno una lunghezza media di 1.4 kb, negli eucarioti superiori le dimensioni medie dei geni aumentano. La lunghezza media di un gene umano è 27kb.

Se andiamo a vedere lo stato di conservazione in specie diverse rispetto al contenuto in sequenze di DNA eterocromatico, trasposoni, sequenze ripetute possiamo dire che sono poco conservate. I geni che sono mantenuti identici o simili tra specie diverse sono molto importanti. Se un gene è presente solo nell’uomo allora ha una qualche funzione specifica che è caratteristica primaria dell’uomo.

I geni totali del genoma umano sono circa 54/58 mila, 20/19 mila sono geni codificanti per proteine, 16/14 mila sono pseudogeni e 17/23 mila sono geni per RNA non codificanti. I numeri sono variabili perché possiamo trovare geni così vicini che forniscono un trascritto che è dato dalla somma dei due.

Densità genica

A fronte di una lunghezza di 3100 Mb il genoma nucleare presenta una densità genica molto bassa → 1 gene ogni 80 Kb. I genomi degli eucarioti hanno una densità genica molto ridotta. In media, i geni codificanti per proteine occupano solo il 2-4% dell’intero genoma. La scarsa compattezza del genoma nucleare è dovuta alla struttura discontinua dei geni, con introni che nei mammiferi possono raggiungere dimensioni intorno a 20-30 kb (ed oltre) e alla presenza di elementi ripetuti.

Lunghezza geni

La lunghezza media di un gene è variabile, dipende dal numero di esoni → maggior numero di esoni maggiore lunghezza. Gli esoni mediamente hanno tutti la stessa lunghezza circa 200-150 nt; esistono geni costituiti da un unico esone (SRY). Il gene della distrofina è un gene lunghissimo → 2.4 megabasi in cui il numero di esoni è 79 con esoni medi di 180 → più soggetto ad errori di splicing e mutazioni in generale → più lungo è un gene più sono le possibili mutazioni. Più il gene è lungo più fa fatica ad essere trascritto, geni maggiormente trascritti hanno pochi introni.