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Filogenesi molecolare

Storia

L'obiettivo della filogenesi molecolare è la lettura della storia del DNA. Nel 2003 un blob si trovò spiaggiato in Cile, senza ossa o riferimenti morfologici identificativi. Venne chiamato globster, come un altro essere simile trovato nel 1886, e uno del 1960 in Tasmania. Nel 2004, sequenziando il suo DNA, si vide che corrispondeva al capodoglio. Questo dimostra l'utilità della genetica quando la morfologia non è sufficiente, per mancanza di dati.

Il DNA non consente tuttavia solo l'identificazione della specie ma anche quella dell'individuo, come si fa con la genetica forense. Ovviamente la maggior parte del DNA, ad esempio del capodoglio, è conservata tra gli individui della stessa specie (ammonta a circa 3 miliardi di nucleotidi). Tuttavia alcune differenze possono essere apportate senza che vengano distrutte le proteine funzionali alla sopravvivenza, e grazie a queste differenze possiamo identificare gli individui. Si possono usare le stesse informazioni per identificare i gruppi sociali e le parentele tra i diversi membri dello stesso gruppo. Nel caso dei capodogli che si aggregano in gruppi, questo è abbastanza semplice.

Le tecniche filogenetiche si usano per la costruzione degli alberi filogenetici. Grazie al DNA possiamo anche risalire al luogo di nascita di ogni individuo e ricostruire le migrazioni della specie nel tempo. In genere, in molte specie che hanno distribuzione globale, le femmine tendono a essere stanziali, mentre i maschi tendono a muoversi di più. Questo è utile dal momento che ci basiamo sia su DNA mitocondriale (trasmissione femminile) e DNA nucleare (trasmesso da entrambi i genitori). Per capire le origini dell'individuo useremo quindi il primo. Questo tipo di applicazione è usato soprattutto nella genetica di popolazione, ma le tecniche sono simili a quelle filogenetiche.

Utilizzando la variazione del DNA si capisce come sono cambiate nel tempo le dimensioni di una popolazione e quindi la risposta ai cambiamenti ambientali passati. Ad esempio, sui capodogli si osserva un collo di bottiglia durante l'ultima glaciazione vedendo le varianti genetiche della specie. Prendendo la sequenza del capodoglio e confrontandola con quelle di altri mammiferi si può identificare il parente più stretto e vedere quando sia avvenuto il ritorno all'acqua. Servono numerose sequenze, geni e individui per costruire un data-set adeguato.

Il campione di DNA può ricostruire l'evoluzione di importanti adattamenti (es. ecolocazione). Alcuni cetacei ne mancano, mentre è caratteristico degli Odontoceti, si può quindi vedere lungo la storia evolutiva per vedere come sia avvenuta la selezione per questo gene, e confrontarla con altri mammiferi che hanno lo stesso carattere. Vi è stata una convergenza molecolare tra pipistrelli e odontoceti, ma percorsi diversi. Con gli stessi metodi si può scoprire quando si sono evoluti i mammiferi per poi estendersi in tutto il mondo, vedendo che la loro comparsa è precedente all'estinzione dei dinosauri. Si può risalire alla diversificazione fra le varie linee filogenetiche. Confrontando le sequenze genetiche dei 3 regni dei viventi si può anche risalire alla loro origine.

Filogenesi e tecniche

Specie vicine a un genere incluse nell'albero filogenetico. Valori di lustro: affidabilità dei dati presenti, indicati a ogni nodo dell'albero. Il termine filogenesi, che è la scienza che analizza le relazioni evolutive a tutti i livelli, da gene a specie a phylum. Il primo a coniare il termine fu Haeckel. La filogenesi determina l'ordine degli eventi evolutivi per ricostruire le relazioni fra gli organismi. L'albero filogenetico è la tecnica di rappresentazione grafica di questa idea.

L'evoluzione è il processo attraverso cui i caratteri variano da una generazione all'altra. I 3 principi di Darwin:

• Variazione tra individui della popolazione
• Variazioni ereditarie
• Alcune forme ereditate consentono diverse probabilità di sopravvivenza

Darwin non conosceva il DNA, ma ora si sa che gli stessi meccanismi si possono osservare anche a livello genetico. Usando tecniche molecolari, statistiche e informatiche si possono dedurre le relazioni filogenetiche tra i dati molecolari. Questo risulta molto più preciso rispetto a un confronto morfologico, che è soggetto a valutazioni soggettive. L'albero filogenetico complessivo che può risultare da questo lavoro è l'albero della vita che rappresenta tutte le relazioni tra gli organismi esistenti comparsi sul nostro pianeta.

Alberi filogenetici

Tutte le discipline biologiche comportano l'uso di alberi filogenetici, vengono usati per descrivere delle relazioni. I metodi usati per costruire gli alberi non variano da ambito ad ambito. Sulla base dell'albero costruito si possono trarre delle conclusioni in base alle relazioni evidenziate. L'albero consente anche di costruire ipotesi. Per costruire questi alberi occorre partire dagli organismi viventi o, in alcuni casi, DNA antico di specie estinte. Ad esempio, mammiferi Monotrenata, Marsupialia e Euthera ancora esistenti, rapportati con le specie estinte Triconodonte, Multitubercolata, Palaeiryctois. Le specie estinte non sono ai nodi, ma sono rappresentate come linee diverse.

Tutte le filogenesi che rappresentano relazioni tra organismi sono le filogenesi classiche, ma ve ne sono di più specializzate per dedurre altri dati: dedurre la sequenza di proteine ancestrali, saggiare ipotesi biogeografiche, evoluzioni di malattie. A livello molecolare si può evidenziare la ricombinazione genica, la conversione genica, i trasferimenti orizzontali (es. batteri, salto tra procarioti ed eucarioti), osservare sequenze soggette a selezione. Importante in filogenesi è il principio della parsimonia.

Punti salienti della filogenesi molecolare

Augier e Lamarck, prima della pubblicazione dell'origine delle specie. Il loro principio relazionale era di mettere il simile vicino al simile. Scala paleontologica, mette insieme le relazioni fra gli organismi e la loro comparsa negli scavi paleontologici. Haeckel fu il primo a realizzare dei veri alberi filogenetici per vari taxa, partendo dagli animali semplici fino ad arrivare all'uomo all'apice. Sono rappresentazioni ovviamente errate, poiché tutti gli animali hanno continuato il processo di evoluzione fino ad oggi, quello dell'uomo è semplicemente iniziato più tardi.

Tree of Life web project: tutte le relazioni filogenetiche esistenti. Dovrebbe contenere tutti i dati e le filogenesi disponibili, sempre aggiornato. Di norma gli alberi sono biforcati a ogni nodo, ma esistono altri modi per rappresentarli. Solitamente si pensa che due linee una volta separate restino indipendenti, ma possono avvenire dei salti tra una linea e un'altra, i già citati trasferimenti orizzontali, ad esempio tra batteri e Archaea. Nuttall cercò di trovare l'antenato tra i primati più simile all'uomo. Dimostrò che i dati molecolari potevano essere utilizzati in filogenetica già nel 1904 ma iniziarono ad essere utilizzati a partire dagli anni '50. Stuntevant nel 1921 ipotizzò le inversioni cromosomiche e costruì degli alberi filogenetici tra i vari ceppi di Drosophila pseudo-obscura. Chargaff scoprì la regolarità nelle proporzioni delle basi del DNA.

Zimmermann e Hennig furono i primi a definire dei metodi oggettivi per costruire la storia evolutiva. Definirono il metodo dei caratteri condivisi per determinare la filogenesi tra specie ed organismi. I metodi cladistici erano basati sull'analisi morfologica dei caratteri, poi subentrò la tecnica molecolare. Mayr e Sibley iniziarono a utilizzare metodi molecolari per la filogenesi. Pauling e Zuckerkandl ipotizzarono l'orologio molecolare vedendo che il numero di differenze a livello proteico osservato tra due specie era proporzionale al tempo trascorso nella diversificazione tra le due specie. Schroeder sviluppò quest'idea nello studio dell'emoglobina, capendo che le forme di emoglobina tra i diversi organismi erano riconducibili a una sola proteina ancestrale. Le mutazioni si accumulano quindi in modo proporzionale alla divergenza fra due specie. Tuttavia sembra che le proteine evolvano in maniera costante nel tempo.

Kimura nel 1968 formula la teoria neutrale dell'evoluzione: suggerisce che a livello molecolare le variazioni siano sostanzialmente neutrali. Nello stesso anno vengono scoperti gli enzimi di restrizione. Dalla fine degli anni sessanta si sviluppano degli algoritmi per creare dei metodi di ricostruzione filogenetica specifici per i dati molecolari. Analizzando sequenze amminoacidiche si può vedere che a volte la mutazione può riportare una base la sequenza allo stato originale, mentre usando i dati morfologici si pensava ad una evoluzione direzionata e quindi che non comportasse salti all'indietro. Nel 1977 si svilupparono le tecniche per ottenere sequenze di DNA e passare dal confronto amminoacidico a questo. Grazie a queste tecniche fu scoperto il regno degli Archaea.

Negli anni ottanta comparvero l'utilizzo del Bootstrap e il maximum likelihood. Nel 1983 viene inventata la reazione a catena della polimerasi, nei primi anni '90 comparvero le macchine da PCR. 2001: sequenziamento genoma umano. Pyrosequencing e Illumina-Solexa furono metodi di sequenziamento scoperti nel 1996. Filogenomica: non è l'analisi di tutto il genoma ma di geni conservati tra i diversi organismi da analizzare.

Presentazione di Omar

La multicellularità è evoluta più di una volta lungo la storia dei viventi. Il carattere più importante per la suddivisione dei viventi era la presenza o meno del celoma, quindi a livello macrostrutturale. Questo voleva dare una direzione all'evoluzione. Artropodi e Anellidi, per segmentazione, erano considerati specie sorelle per quanto in effetti fosse solo una caratteristica morfologica della macrostruttura (post embrione).

Nel 1997 uscì un articolo di James Lake intitolato "Evidence for a clade in nematodes, arthropods and other moulting animals". Sequenziarono il DNA 18S, un DNA ribosomiale e fecero delle filogenesi basandosi su queste sequenze. Quelle preesistenti concordavano con l'albero già presente ma erano errate poiché i nematodi erano considerati una delle prime linee a differenziarsi in quanto pseudocelomato mentre artropodi anelli e cordati erano messi assieme come celomati. Lake dimostrò che i nematodi potevano essere raggruppati con gli artropodi formando il gruppo degli ecdisozoi basandosi sulle sequenze ribosomali confrontate. Il cambiamento era dovuto al fatto che aveva preso la specie di nematode con minore tasso di mutazione. Questa nuova suddivisione, unendo nematodi ad artropodi, diventava incompatibile con la suddivisione animale basata sul celoma. Gli artropodi formano dunque un gruppo distinto rispetto agli anellidi. In una review del 2000 la filogenesi adottò la nuova suddivisione, sulla base del fatto che la muta (moulting) fosse comparsa una volta sola e raggruppasse così quei phylum.

Cambiò anche il paradigma per definire l'evoluzione degli organismi. Quella precedente prevedeva una variazione di complessità scalata, da organismo semplice a complesso. In realtà la complessità non è una marcia graduale ma un adattamento relativo all'ambiente, dipende dalla pressione evolutiva, non c'è evoluzione maggiore e minore. Batteri con genomi ridotti ad esempio non sono per forza ancestrali ma hanno subito una spinta evolutiva in tal senso.

La filogenesi precedente era sbagliata per un errore sistematico, dovuto alla carenza di dati. Errore sistematico: l'errore sistematico è dovuto ad un bias nell'osservare un evento biologico da esplicare. Meno è efficiente il modello interpretativo, maggiore sarà l'errore. L'errore stocastico, dovuto al caso, è invece solitamente legato allo scarso numero di campioni o di dati. La lunghezza del braccio di un albero filogenetico rappresenta il numero di mutazioni che separa un punto da un altro. LBA è la Long Branch Attraction, rami di lunghezze simili vengono raggruppati assieme. I rami lunghi rappresentano alte velocità di evoluzione/mutazione. La zona di Felsestein è una zona dello spazio filogenetico dove è inevitabile la presenza di errori sistematici, che raggruppano i rami lunghi, ossia la LBA.

Come si riduce un errore sistematico?

• Aumento il numero di specie dei taxa: un errore sistematico può ricostruire in modo migliore i nodi ancestrali, quindi aumentare il taxon sample è un metodo per correggere. Ci sono casi in cui però può aumentare il tasso di errore.
• Avoid bad Taxa: se sostituendo un organismo che evolve rapidamente con un altro dello stesso genere che evolve più lentamente la struttura dell'albero cambia, probabilmente il caso precedente era errato (vedi caso di Lake, che usò un nematode con tasso di evoluzione basso rispetto a quello degli studi precedenti).
• Cambiare il modello con uno meno rigido.
• Distinguere i siti che evolvono più o meno velocemente fra di loro. Ad esempio, l'evoluzione dell'emoglobina è lenta, dell'istone è più lenta, di un recettore olfattivo è molto più velocemente. Non è detto però che tutti i siti della proteina evolvano con la stessa velocità. Le partizioni per geni non funzionano ma è meglio unire i siti di due o tre proteine diverse. L'evoluzione di una proteina è in realtà una media tra quelle dei suoi siti. Nel caso si identifichino i siti interferenti è sufficiente fare l'analisi senza includerli. Il modello che descrive il dataset è composto da un albero filogenetico creato con regole matematiche, il migliore tra i possibili ma non necessariamente esatto.

La Filogenesi ricapitola tutta la storia evolutiva di un organismo quindi raggruppa tutte le discipline biologiche. L'unica cosa che è possibile osservare però sono le mutazioni puntiformi. Il modello interpretativo avrà sempre un handicap. Ogni albero filogenetico è un modello dato che spiega il dataset dato l'ordine di mutazione. L=PR(DIT, θ) Maximum Likelihood (Likelihood = Probabilità del dato secondo il modello) Il Maximum Likelihood è la sommatoria di tutti i likelihood per ogni sito e per ogni nodo. In filogenesi usiamo sempre dati e replacement model. Se immaginiamo un confronto di dataset fra proteine allineate, Il Replacement model darà la probabilità di sostituzione di un dato amminoacido. Minore è l'area, meno probabile è la sua sostituzione. Può essere usato per ridurre la LBA.

Nel 2002, al principio dell'era genomica (lievito, C. elegans, Drosophila ecc.) appena ottenuti abbastanza genomi per testare le ipotesi dei celomati, si trovava nuovamente l'uomo come sister group degli artropodi. Ovviamente questo era dovuto all'utilizzo del nematode con tasso di variazione più alto ancora una volta. Questo indica che l'errore sistematico sarebbe ovviamente aumentato dovuto alla maggiore disponibilità di dati. Bootstrap: misura della robustezza di un nodo, non è indice della verità del nodo ma quanto l'allineamento supporti il modello.

Dati filogenetici

Tipi di dati filogenetici: i dati morfologici sono stati i primi a essere stati utilizzati per fare gli alberi filogenetici utilizzando degli algoritmi. Questi dati permettono di fare filogenesi profonde nel tempo, dalla filogenesi di specie fino a milioni di anni indietro. Dati comportamentali: cambiano molto velocemente quindi si possono usare tra popolazioni diverse della stessa specie o tra specie vicine tra di loro, ma non si può ricostruire la storia di una specie. Nel caso degli uccelli si possono usare ad esempio la frequenza e la durata del canto. Dati molecolari: dall'analisi dei profili degli enzimi fino alle sequenze di DNA e di proteine. Tra DNA e proteine cambiano molto i modelli di evoluzione. Con le proteine era nata la teoria dell'orologio molecolare.

Attorno al 1904 Nuttal aveva iniziato a usare i confronti immunologici per determinare le relazioni tra gli organismi. Sono reazioni incrociate tra siero e antisiero. Strategia: grado di similarità tra gli organismi ricavato dal modo con cui le due molecole reagiscono tra di loro, maggiore reazione indica maggiore similarità.

Esempio: estrazione proteine da un pesce. Si iniettano in un altro organismo, in questo caso nel coniglio che inizierà a produrre anticorpi contro le proteine. Si preleva poi il sangue del coniglio e se ne estraggono gli anticorpi, che quindi riconoscono le proteine estranee di questa prima specie. Poi si procede al confronto con una seconda specie di pesce:

• Si mescolano gli anticorpi con le proteine della prima specie aggiungendo il complemento come mezzo di contrasto.
• Si ripete con le proteine della seconda specie di pesce, con gli stessi anticorpi.

La quantità del complemento che rimane in soluzione viene misurato per vedere l'attività degli anticorpi. Poi si confrontano le due attività dell'enzima per vedere quanto i due pesci si assomigliano. Tanto più simile è la proteina tanto più simili geneticamente saranno quei pesci. In quel caso gli anticorpi reagiranno bene anche con le proteine della seconda specie. (Possiamo anche quantificare il precipitato in alternativa) Con un pesce di riferimento e un adeguato dataset posso costruire alberi filogenetici. Tanto più simili sono le proteine, tanto sarà la vicinanza all'interno dell'albero filogenetico che si andrà a costruire. Si utilizza una matrice di distanza per la costruzione dell'albero (tabella con valori accoppiati). Minore è il numero della matrice, minore sarà la distanza.

Elettroforesi proteine

Fine anni '50. Si usa per fare genetica di popolazione perché le velocità con cui migrano le proteine cambiano moltissimo tra specie e generi diversi. Una volta fatto l'estratto della proteina e caricata in un gel questo viene fatto correre sul gel. Le proteine migreranno verso uno o l'altro dei due poli a seconda della loro carica e migreranno con velocità inversamente proporzionale alla loro grandezza. Il gel si può interpretare con il criterio presente/assente nel confronto tra le specie, per vedere quante sono le proteine condivise. Nella lettura del gel, l'eterozigote per una proteina forma sem...