Appunti di Biologia molecolare

Biologia molecolare

Appunti del corso di Prof. Fabrizio Damiano A.A. 2021/2022

Definizione

1938 – Weaver: “Spiegare manifestazioni della vita in termini di eventi fisico-chimici a livello delle molecole”
Oggi: “Scienza che studia le interazioni tra macromolecole ad alto contenuto informazionale: acidi nucleici e proteine”.

Sviluppo della biologia molecolare

1° fase: anni ‘40/’60

• Caratterizzazione strutturale del DNA e della sua funzione nell’ereditarietà
• DNA e proteine

Per raggiungere questi obiettivi sono stati usati batteri, virus, fagi perché hanno un’informazione genetica più semplice da studiare. Inoltre, si possono indurre mutazioni per studiare i geni.

2° fase: sviluppo nelle metodologie per studiare gli acidi nucleici

• Enzimi di restrizione
• Vettori di clonaggio
• Tecniche di sequenziamento degli acidi nucleici

Ciò ha permesso lo studio dei geni nel dettaglio tramite:

• Isolamento di un gene
• Clonaggio
• Analisi di sequenza

Cos’è un gene? È un’unità di informazione, e lo studio riguarda:

• Genetica contenente la regione codificante
• Regioni codificanti e la regione di controllo dell’espressione
• Regioni con funzione di controllo a monte o a valle

3° fase: studio dei meccanismi di trasmissione dell’informazione genetica

• Definizione del Dogma centrale della Biologia Molecolare: Il DNA può auto-replicarsi. Inoltre, il DNA trasmette la propria informazione genetica in una molecola intermedia detta RNA. Con gli anni si è osservata in cellule eucariotiche e virus una violazione di questo dogma, dove l’RNA si retrotrascrive in DNA, grazie a una retrotrascrittasi (o trascrittasi inversa).
• Geni interrotti, ossia presenza di introni (non codificanti) ed esoni (codificanti). Il rimaneggiamento dell’RNA porta a proteine diverse. Non è più corretta quindi la convinzione 1 gene 1 proteina. Il numero di geni interrotti aumenta salendo nella scala evolutiva. Il vantaggio dei geni interrotti è la possibilità di ottenere più trascritti maturi partendo da un solo trascritto precursore attraverso lo splicing alternativo. Si ottiene così una grande quantità di proteine partendo dalle stesse informazioni geniche.
• RNA capaci di auto-splicing, ossia capaci di auto-processarsi. Questi RNA possiedono quindi attività enzimatica e prendono il nome di ribozima.
• Elementi trasponibili (trasposoni): elementi di DNA capaci di muoversi nel genoma.
• Geni sovrapposti: tipici di DNA mitocondriale o di genomi virali. Sono geni la cui sequenza è parzialmente sovrapposta, ossia parte della sequenza di un gene fa parte anche del gene successivo. In questo modo si hanno più geni in un genoma di dimensioni più piccole.
• Sequenze ripetute nel genoma, spesso con nessuna funzione codificante.
• Studio dell'attivazione o inattivazione selettiva di geni. Regolazione dell’espressione genica: Perché alcuni geni si esprimono solo in alcuni tessuti o solo per un periodo di tempo specifico?
• Studio dell’evoluzione a livello molecolare tramite analisi delle sequenze.

Storia del DNA

Friedrich Miescher, biologo svizzero, isola una sostanza contenente fosforo (nucleina) dai nuclei di cellule del pus (leucociti) (1868). Parte acida (DNA) Nucleina Parte basica (Proteine). Miescher riuscì a purificare i leucociti dalle garze delle ferite infette che prelevava dagli ospedali. Da queste riuscì a isolare i nuclei e quindi la nucleina. Dimostrò che la nucleina era particolarmente ricca in azoto e fosforo e non conteneva zolfo. Una molecola nuova, presente in tutte le specie. Dimostrò che la quantità di nucleina aumentava quando le cellule andavano incontro a divisione, suggerendo che la nucleina si duplicava assieme ad esse e passava di conseguenza alle cellule figlie. Tuttavia, Miescher non riteneva che fosse coinvolta nella trasmissione dei caratteri acquisiti, poiché la nucleina estratta da cellule di specie diverse mostrava identiche proprietà chimiche, pertanto non poteva essere responsabile dell'acquisizione delle caratteristiche specifiche di ogni organismo o specie.

Frederick Griffith, biologo inglese, con l’esperimento su Streptococcus Pneumoniae (1928). Usò due ceppi del batterio: il ceppo R, non virulento e le cui colonie apparivano rugose, e il ceppo S, virulento e con le colonie dall’aspetto liscio. Con questo esperimento, Griffith inizia a parlare di principio trasformante, non ancora identificato come DNA.

Avery, McLeod e McCarty dimostrarono che il principio trasformante individuato da Griffith era il DNA. I ricercatori misero in coltura liquida batteri del ceppo S, ne uccisero un campione e da questo isolarono le 5 macromolecole principali: polisaccaridi, proteine, lipidi, DNA e RNA. Ognuna di queste componenti venne poi miscelata con batteri del ceppo R e piastrata su un mezzo di coltura solido. Solo nella piastra contenente il DNA si notarono colonie lisce caratteristiche del ceppo S dimostrando così che il principio trasformante era il DNA. A dimostrazione di questa affermazione, gli scienziati usarono poi DNAasi, RNAasi e proteasi notando che le DNAasi annullavano il principio trasformante, mentre gli altri enzimi non sortivano alcun effetto.

Esperimenti di Hershey e Chase

Un'ulteriore dimostrazione che il DNA fosse portatore del materiale genetico è stata fatta da Hershey e Chase utilizzando il batteriofago T2 ed Escherichia coli. Chimicamente parlando, il DNA contiene fosforo ma non zolfo, le proteine invece contengono zolfo ma non fosforo. I due scienziati prepararono quindi due colture di E. coli:

• Nella prima introdussero fosforo radioattivo ³²P.
• Nella seconda introdussero zolfo radioattivo ³⁵S.

In entrambe le colture, i fagi infettano i batteri e ne provocano la lisi, rilasciando una nuova generazione di virus. La differenza tra le due sta nella progenie virale dopo la lisi.

• Nella prima coltura, la sintesi del DNA fagico avvenuta nel batterio ha usato il ³²P presente nel terreno di coltura. In questo modo i fagi della nuova generazione avevano il DNA marcato e le proteine del capside normali.
• Nella seconda coltura, invece, la progenie aveva il DNA normale e le proteine del capside con lo ³⁵S, quindi erano proteine marcate.

I due scienziati separarono poi i fagi marcati dai terreni di coltura e, separatamente, li utilizzarono per infettare colonie di E. coli in terreni standard privi di isotopi radioattivi.

• Quelli con DNA marcato trasferirono la radioattività all'interno delle cellule batteriche.
• Quelli con proteine marcate non trasferirono la radioattività ai batteri perché le proteine del capside restano fuori dalla cellula batterica sotto forma di ombra fagica.

Per evidenziare ciò, il terreno di coltura veniva posto in un omogeneizzatore in modo da staccare le ombre fagiche dalla superficie delle cellule batteriche. In seguito veniva centrifugato.

• Nel caso del DNA marcato, la radioattività si concentrava sul fondo dove appunto andavano i batteri.
• Nel caso di proteine marcate, la radioattività rimaneva nel soprannatante.

La trasfezione introduce nuovo DNA in cellula

Cellule eucariotiche difettive del gene TK non possono produrre la timidina chinasi e quindi non crescono in un terreno privo di timidina. Se però alla coltura di cellule si aggiunge del DNA contenente il gene TK, alcune cellule trasfettano, acquisiscono il gene TK e riescono a crescere nel terreno privo di timidina.

"Per le cellule eucariotiche, si parla di trasfezione e non di trasformazione (come nei procarioti) perché il termine trasformazione negli eucarioti indica la trasformazione in cellule tumorali."

Altri studi sul DNA

Nel 1949, Chargaff cercò di capire che relazione ci fosse tra le basi azotate attraverso la cromatografia. Egli notò che le percentuali di basi azotate sono diverse tra le specie. Tuttavia notò che i rapporti A/T e C/G erano all'incirca pari a 1 in tutte le specie, così come il rapporto purine/pirimidine. Il rapporto che varia tra le specie è. Arrivò quindi ad affermare che:

• A = T
• C = G
• A + G = C + T

Con le conoscenze attuali sappiamo spiegare questi risultati perché l'adenina si appaia con la timina con 2 legami idrogeno e la guanina si appaia con la citosina con 3 legami idrogeno.

Struttura del DNA

• Il DNA è una doppia elica destrogira, con all'esterno lo scheletro costituito da deossiribosio e fosfato, e all'interno le basi azotate. Questo perché lo scheletro è idrofilo mentre le paia di basi sono idrofobe.
• La distanza tra due basi è di 3,4 Å, il passo dell'elica (un giro completo) è di 34 Å. Ogni giro ha quindi circa 10 basi. Ogni coppia di basi è ruotata di 36° rispetto all’asse, quindi 10 coppie = 360°.
• I due filamenti non sono sempre equidistanti perché il legame N-glicosidico, che lega la base azotata al deossiribosio, non si trova sullo stesso piano del diametro della doppia elica. Se vicini, si parla di piccolo solco o piccola scanalatura, se distanti si parla di grande solco o di scanalatura principale (il piccolo misura 12 Å, il grande 22 Å).
• I due filamenti sono antiparalleli, ossia vanno in direzione opposta.
• A pH 7 i gruppi fosforici sono dissociati a gruppi fosfato con carica negativa.

Caratteristiche del DNA

• Stabile a pH da 4 a 11
• Viscoso
• Sedimentazione all’equilibrio in gradiente isopicnico di CsCl

Modificazioni delle proprietà fisiche

• pH estremi
• Calore, che causa denaturazione
• Diminuzione costante dielettrica del mezzo
• Urea, che causa denaturazione
• Denaturazione causa una diminuzione di viscosità
• Aumento DO a 260 nm→ effetto ipercromico
• Denaturazione termica = fusione

TM: è la temperatura di fusione, ossia la temperatura alla quale la molecola di DNA è denaturata al 50% (se è lunga 1000 paia di basi, 500 sono separate e 500 sono ancora unite). La TM varia da specie a specie. Questo perché tra le specie varia la proporzione tra gli appaiamenti e la lunghezza del DNA. Se in una sequenza vi sono più appaiamenti C/G, la TM sarà maggiore perché l’appaiamento presenta tre legami idrogeno invece di due legami idrogeno dell’appaiamento A/T.

Basi azotate

La citosina è una 2-ossi-6-amminopirimidina. Quando legata con l’azoto 3 al deossiribosio forma la deossicitidina. Se al carbonio 5’ dello zucchero è legato un gruppo fosfato si forma la deossicitidina-5’-(mono/di/tri)fosfato.

La timina è una 5-metil-2,6-diossipirimidina. Quando legata con l’azoto 3 al deossiribosio forma la deossitimidina. Se al carbonio 5’ dello zucchero è legato un gruppo fosfato si forma la deossitimidina-5’-(mono/di/tri)fosfato.

L’adenina è una 6-amminopurina. Quando legata con l’azoto 9 al deossiribosio forma la deossiadenosina. Se al carbonio 5’ dello zucchero è legato un gruppo fosfato si forma la deossidenosina-5’-(mono/di/tri)fosfato.

La guanina è una 2-ammino-6-ossipurina. Quando legata con l’azoto 9 al deossiribosio forma la deossiguanosina. Se al carbonio 5’ dello zucchero è legato un gruppo fosfato si forma la deossiguanosina-5’-(mono/di/tri)fosfato.

L’uracile invece è il corrispettivo della timina nell’RNA. È una 2,6-diossipirimidina. Quando legata con l’azoto 3 al ribosio forma l’uridina. Se al carbonio 5’ dello zucchero è legato un gruppo fosfato si forma la uridina-5’-(mono/di/tri)fosfato.

Le altre basi dell’RNA sono uguali a quelle del DNA ma con il ribosio invece del deossiribosio. Quindi: adenosina, citosina, guanosina.

Replicazione del DNA

Furono proposti 3 modelli di replicazione:

• Dispersivo: i filamenti del DNA neosintetizzato hanno frammenti di DNA parentale e frammenti di nuova sintesi
• Semiconservativa: ciascuna delle molecole figlie di DNA ha un filamento parentale e uno neosintetizzato
• Conservativa: delle due molecole figlie, una è la parentale e l’altra è totalmente neosintetizzata

Per capire quale fosse il modello giusto ci furono gli esperimenti di Meselson e Stahl. I due ricercatori misero E. coli in coltura su un terreno contenente l’isotopo pesante dell’azoto, ¹⁵N. Per distinguere il DNA con ¹⁵N da quello con ¹⁴N viene usata la centrifugazione isopicnica con CsCl 6M.

Nell’esperimento una parte della coltura con ¹⁵N viene trasferita in un terreno contenente ¹⁴N, tenendola nel terreno per il tempo necessario a una sola divisione. Secondo il modello semiconservativo, dopo una divisione il DNA è un ibrido ¹⁵N/¹⁴N. Nella stratificazione della centrifugazione, il DNA si posizionerà in una posizione intermedia tra quella del DNA ¹⁵N e quella del DNA ¹⁴N.

Dopo il secondo ciclo di divisione in terreno ¹⁴N, si ottiene un DNA di solo ¹⁴N e un DNA ibrido. Nella centrifugazione si avranno quindi due bande, una del DNA ibrido e una del DNA solo ¹⁴N. Proseguendo con le divisioni, il DNA solo ¹⁴N diventerà sempre più preponderante.

Movimenti tautomerici

La tautomeria può causare problemi a livello dell’appaiamento delle basi. La citosina in forma imminica non si appaia con la guanina ma con l’adenina e la guanina in forma enolica non si appaia con la citosina ma con la timina.

Strutture del DNA

• Avvolgimento tipico destrorso, a volte sinistrorso
• Alcune molecole sono lineari, altre circolari
• Superavvolgimenti

La forma B è la più comune e si trova in caso di umidità al 82% e bassa forza ionica. La forma A si trova con umidità al 75% e alta forza ionica e in virus a RNA o tRNA. La forma Z invece dipende da sequenze nucleotidiche specifiche. In particolare l’alternanza sul singolo filamento di citosina e guanina favorisce la formazione della forma Z. Questo perché le purine si trovano nella conformazione sin invece della anti rispetto al deossiribosio, mentre le pirimidine si trovano sempre in anti. Quindi l’alternanza C-G, ossia alternanza pirimidina/purina, crea un andamento a zig-zag della struttura zucchero-fosfato. La forma Z influenza le interazioni del DNA con le altre biomolecole.

Molecole intercalanti

L’etidio è una molecola planare e idrofoba, capace di inserirsi nella molecola di DNA tra le coppie di basi. Per far spazio all’etidio, il DNA si allunga e si svolge e aumenta la spaziatura tra le basi. L’intercalante inibisce quindi la replicazione e la trascrizione, causando gravi danni alla cellula.

Struttura dell'RNA

Lo scheletro è costituito da gruppi fosfato e zuccheri. Lo zucchero è il ribosio e non il deossiribosio del DNA. Per quanto riguarda le basi azotate, al posto della timina c'è l'uracile.

Il DNA porta l’informazione genetica ma non può produrre direttamente le proteine. Subentra quindi l'RNA a fare da tramite. Come può l'RNA essere tradotto in proteine? Crick nel 1955 propone gli adattatori molecolari, molecole che portano uno specifico amminoacido e che si legano agli stampi.

Ma come è fatto il codice genetico?

• X Codice a 1 base → 4 amminoacidi
• X Codice a 2 basi → 16 amminoacidi
•  Codice a 3 base → 64 amminoacidi

Come decodificare queste triplette? Vengono lisate delle cellule di E. coli. Il lisato viene centrifugato per eliminare i frammenti di pareti e membrane cellulari. L'estratto acellulare ottenuto conteneva tutto il necessario alla sintesi proteica (mRNA, tRNA, ribosomi, ecc.). Alle provette con l'estratto vengono aggiunti amminoacidi radioattivi, facilmente seguibili, e trascritti sintetici omopolimerici (poli-U, poli-C, poli-A) (il poli-G non si riuscì a realizzare). Di tutti gli amminoacidi aggiunti solo uno era radioattivo. In questo modo si poteva identificare l'amminoacido codificato dalla tripletta del trascritto sintetico. Si evidenziò che:

• poli-U → "UUU" → fenilalanina
• poli-C → "CCC" → prolina
• poli-A → "AAA" → lisina

Successivamente vennero usati trascritti sintetici copolimeri con due basi. L'interpretazione dei risultati e la scoperta degli amminoacidi associati alle triplette furono più difficili perché le possibili triplette erano 6 per ogni coppia di basi del trascritto. Si è comunque riusciti a decodificare il codice genetico. Vennero poi usati trascritti fagici in seguito a mutazioni (inserzioni e delezioni) introdotte chimicamente, in modo da alterare la frame di lettura. In seguito venne identificato il codone AUG come codone d'inizio della traduzione e come codone della metionina (le proteine infatti iniziano sempre con la metionina).

Scoperta dei codoni di stop

In sistemi fago T4 - E. coli, mutazioni non-senso in uno specifico gene fagico impedivano al fago di replicarsi in E. coli selvatico. Il fago mutante cresceva solo in ceppi di E. coli con una mutazione soppressore del non-senso. Questo tipo di mutazione è a carico di un gene codificante un tRNA. Il tRNA mutato ha la mutazione a livello dell'anticodone e può riconoscere il codone di stop, inserire un amminoacido e far proseguire la sintesi proteica. Si ottiene così una proteina completa e funzionante e non una proteina più corta a causa della mutazione non-senso. Si riuscì così a identificare i codoni di stop. Fago con mutazione Mutante E. coli:

• UAG amber
• UAA ochre
• UGA opal

Dato che più triplette codificano per lo stesso amminoacido, si definisce il codice degenerato o ridondante. Il codice vale solo per i batteri o per tutti gli organismi? Vale per tutti, quindi è universale.

L’RNA rappresenta la molecola genetica di alcuni virus

L'affermazione che l'RNA non poteva essere riconvertito in DNA è smentita nel 1970 con la scoperta dei retrovirus. Questi virus hanno l'enzima trascritasi inversa.