Appunti completi del corso di Bioinformatica e genomica funzionale

Bioinformatica e genomica funzionale

Bioinformatica

La bioinformatica è una combinazione di metodi matematici, statistici ed informatici per analizzare dati biologici, biochimici e fisiologici. Richiede un mix di competenze negli ambiti della biologia classica, biologia del genoma e analisi dei dati (matematica applicata, algoritmi di analisi dati, statistica). Si tratta, dunque, di una materia fortemente interdisciplinare, che può avere diverse applicazioni, tra cui sicuramente lo studio di:

• Dati di sequenza;
• Dati di espressione;
• Problemi di struttura;
• Analisi di reti;
• Analisi filogenetica (studio delle relazioni tra sequenza, geni ed organismi);
• Genomica comparativa;
• Post-genomica.

Siamo entrati nell’era in cui la capacità di sequenziare il DNA ha rivoluzionato la biologia classica, creando quella moderna e permettendo un nuovo punto di vista in ambito medico e biologico. I nuovi strumenti messi a disposizione dalle biotecnologie forniscono un input essenziale e consentono passi avanti sempre più importanti. La bioinformatica ha, in questo contesto, un ruolo fondamentale per l’analisi dell’enorme mole di dati biologici prodotti dalle nuove biotecnologie (sequenziamento automatico, DNA chips, next generation technologies, array proteici, spettrometri di massa), fornendo nuove informazioni per uso biologico e medico.

Date fondamentali della biologia moderna

• 1953: Scoperta della struttura a doppia elica del DNA (Watson e Crick);
• 1966: Decodificazione del codice genetico. Per la prima volta si è stati in grado di mappare ogni possibile tripletta di basi azotate con il corrispondente aminoacido sintetizzato. In questo caso, quindi, "svelare il codice genetico" non significa comprendere cosa sia codificato nel DNA (capire l’informazione in esso nascosta), ma "semplicemente" capire come siano codificati gli aminoacidi;
• 1990: Inizio del progetto genoma umano. Finanziato da un consorzio pubblico negli USA, ha avuto lo scopo di sequenziale l’intera sequenza (3 miliardi di basi) dell’homo sapiens (una sequenza master e non una specifica alla ricerca di mutazioni) per poter avere una realizzazione concreta del genoma di un individuo e comprenderne la geografia;
• 2003: Fine del progetto genoma umano. La fine del progetto era, in realtà, prevista per il 2005, ma l’introduzione di nuove biotecnologie ha permesso di accelerare i tempi. Si è trattato di un progetto molto costoso, che ha visto il coinvolgimento di tanti istituti di ricerca, che hanno sequenziato diversi “pezzi” del genoma.

Dopo il progetto genoma umano ne sono partiti molti altri per sequenziare il genoma di moltissimi organismi più semplici, appartenenti sia al mondo animale che vegetale. L’idea era confrontare le conoscenze acquisite su questi, per poi proiettarle sull’homo sapiens. Siamo, quindi, nell’ambito della genomica comparativa, che ha come obiettivo la comprensione del genoma degli organismi più semplici, dove risulta agevolata la comprensione di alcuni meccanismi, poi proiettabili sul genoma umano attraverso l’individuazione delle differenze tra i genomi. Le somiglianze sono tante e, grazie agli strumenti computazionali, possono essere valutate in maniera analitica oggettiva, e non solo in modo qualitativo: sappiamo, ad esempio, di essere distanti dal topo “solo” 80 milioni di anni, ovvero che più di 80 milioni di anni fa l’homo sapiens ed il topo erano un unico essere vivente. Ovviamente, quindi, una parte del nostro genoma è in comune (le somiglianze sono notevoli, motivo per cui i topi sono spesso usati come animali di laboratorio), e le sequenze che si sono conservate nel tempo sono, evidentemente, quelle rivelatesi fondamentali durante il processo di evoluzione della specie.

Il DNA

Il DNA è una molecola con struttura a doppia elica di due filamenti complementari di nucleotidi, costituenti fondamentali e portatori di informazione. Con il termine nucleotidi facciamo riferimento all’insieme di zucchero pentoso, gruppo fosfato (questi primi due elementi, insieme, costituiscono lo scheletro dell’elica, e quindi garantiscono alla molecola di DNA il necessario supporto strutturale) e base azotata (parte variabile, e dunque vera sede dell’informazione). Le basi azotate sono individuate da 4 caratteri che si alternano nella sequenza di 3 miliardi di basi che costituisce il genoma umano: l’ordine delle basi costituisce l’informazione genetica. L’appaiamento delle basi avviene secondo regola della complementarietà: la A-T e C-G; l’informazione risulta, dunque, definita da un singolo filamento, perché il secondo sarà, dato il primo, automaticamente determinato.

Genomica e struttura del DNA

La genomica è una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio del genoma umano ed in primis, dunque, si pone come obiettivo quello di capire cosa ci sia scritto nelle basi (che portano l’informazione genetica in maniera codificata). Le nostre 3 milioni di basi (anche dette bp-base pairs) sono fisicamente organizzati in unità strutturali dette cromosomi: il genoma umano ha 23 paia di cromosomi, 22 autosomici (ogni paio contiene due copie dello stesso cromosoma), mentre il 23-esimo paio, quello dei cromosomi sessuali, contiene due X per l’individuo di sesso femminile, una X ed una Y per quello maschile. In totale ci sono, quindi, 24 tipi di cromosomi.

Se svolto linearmente, il singolo filamento di DNA contenuto in tutti i cromosomi dà un filo di lunghezza di circa 2 metri. Questi 2 metri sono racchiusi in ogni cellula del nostro corpo, con un preciso impaccamento. Elemento fondamentale di questo sistema è il nucleosoma: un complesso proteico (fatto da istoni, o proteine isteriche) compresse tra loro a formare una sorta di cilindretto attorno al quale il DNA si avvolge. I nucleosomi si avvicinano, poi, tra loro, a formare una fibra più spessa. Questo meccanismo è fondamentale per ottenere una fibra efficiente da un punto di vista dell’occupazione spaziale e permette di ottenere i cromosomi, ovvero le strutture tipicamente osservabili al microscopio.

Il dogma centrale della biologia

Con questa espressione si fa riferimento al flusso di informazione che va dalla sequenza del DNA alla trascrizione in RNA (acido nucleico copia di una certa parte di DNA), fino alla successiva formazione di una catena di aminoacidi, secondo le informazioni contenute nel DNA, che costituisce il prodotto proteico dell’elemento genico tradotto. La successione di aminoacidi si avvolge, poi, spazialmente, per raggiungere la forma tridimensionale necessaria alla corretta funzionalità della proteina. Questo è quanto viene tradizionalmente narrato dalla biologia classica, ma molti aspetti della biologia moderna (genomica) costituiscono un superamento di questa visione, non scorretta, ma sicuramente incompleta.

I nucleotidi si legano tra loro attraverso il legame fosfodiesterico, che determina il modo in cui scriviamo le sequenze e ci riferiamo a queste. Ad un’estremità della catena di nucleotidi avremo sempre un gruppo fosfato, mentre all’altra ci sarà sempre un gruppo ossidrile: questa polarizzazione della molecola ci fornisce la corretta direzione di lettura della stessa. La nomenclatura deriva dal fatto che al 3’, il gruppo ossidrile si lega al terzo carbonio, mentre al 5’ il gruppo fosfato è legato al quinto carbonio dello zucchero pentoso. La notazione 5’ e 3’ viene comunemente usata per indicare inizio e fine sequenza. I due filamenti complementari sono, però, antiparalleli: quindi se uno si legge in un senso, il complementare si leggerà in senso contrario. In questo modo il 5’ di un filamento corrisponde sempre al 3’ dell’altro. Non c’è un vero e proprio “primo filamento” né un “secondo”, ma per convenzione, quando si osserva una sequenza, si indica sempre su quale filamento la si sta guardando, e sono possibili diverse notazioni (1 e 2, ma anche Watson e Crick).

Elementi funzionali della sequenza

Chiaramente non possiamo pretendere di analizzare allo stesso modo tutte le 3 miliardi di basi, ma dobbiamo cercare l’informazione contenuta in queste, motivo per cui è importante capire come leggere la sequenza.

Geni

I geni sono evidentemente contenuti nel genoma, ma è necessario capire come sono fatti e codificati nell’intera sequenza, dato che costituiscono delle parti di questa. In un organismo eucariote come l’uomo, nella sequenza di DNA si alternano:

• Esomi: parti codificanti che vengono tradotte in aminoacidi;
• Introni: parti non codificanti che, dopo la trascrizione in RNA, vengono rimossi.

L’RNA viene elaborato per trattenere solo gli esoni, quindi alla fine avrà una sequenza fatta, in realtà, di “sottosequenze” e di elementi detti “UTR” (untranslated region - regioni non tradotte). Come intuibile, queste regioni vengono trascritte (copiate in RNA), ma la traduzione non le prende in considerazione. Si trovano agli estremi del filamento di RNA (UTR al 5’ ed al 3’).

Il processamento dell’RNA che conduce alla rimozione degli introni prende il nome di splicing alternativo. Questo processo consente, da uno stesso trascritto, di ottenere trascritti maturi (successivi alla rimozione degli introni) differenti. Può succedere che si salti un esone in un determinato punto, se ne lasci uno in coda o se ne salti uno all’inizio. Dunque, grazie a questo processo, da una sequenza (gene e sua trascrizione), si possono ottenere trascritti finali con sequenze differenti.

Avendo 3 possibili posizioni nella tripletta ed un alfabeto di 4 caratteri abbiamo 64 triplette possibili, ma gli aminoacidi sono solo 20. Si dice, quindi, che il codice genetico umano è degenerato: più triplette possono corrispondere allo stesso aminoacido. La degenerazione significa ridondanza, ma non casualità: ci sono studi sull’utilizzo dei diversi codoni che mostrano come l’utilizzo di un codone piuttosto che di altri sia dettato da una necessità, ma i meccanismi di scelta non sono ancora del tutto chiari.

Esistono, poi, delle triplette particolari, ad esempio:

• ATG, la tripletta codificante la metionina, è la prima della sequenza da tradurre (di solito, quindi, le proteine iniziano da una metionina);
• Triplette di stop: la traduzione generalmente si arresta quando trova una tripletta tra TAA, TGA e TAG.

La parte del DNA che contiene geni codificanti proteine (che vengono trascritti e poi anche tradotti in aminoacidi) è in realtà molto piccola (appena il 2% dell’intero genoma), quindi ciò che resta dei 3 miliardi iniziali di basi è, in realtà, molto poco. A differenza di quanto si pensasse inizialmente, i geni (o ciò che per molto tempo è stato indicato come tale, in quanto codificante delle proteine) sono una piccola parte del genoma.

Si può osservare come, in organismi con livelli di evoluzione diversi, la percentuale di geni codificanti sia diversa: più ci spostiamo verso organismi superiori minore è il numero di geni codificanti. All’inizio degli studi sul genoma umano non ci si aspettava una situazione del genere: man mano che il genoma veniva sequenziato, l’obiettivo principale era cercare le porzioni codificanti, dato che l’elemento essenziale della biologia è la proteina. La stima iniziale era che esistessero più di 100.000 geni codificanti, e man mano che le prime porzioni venivano rese note questo numero ha iniziato a scendere: per molto tempo si è pensato fossero 80.000, mentre ad oggi sappiamo che esistono appena 22.000 geni codificanti, numero non molto diverso da organismi notevolmente più semplici dell’uomo. Ciò ha spinto a chiedersi da dove provenisse allora la complessità dell’homo sapiens: la genomica funzionale sta rispondendo anche a questo interrogativo, ed il fenomeno dello splicing alternativo è un primo indizio. Se utilizzando assortimenti diversi di esoni, la cellula è in grado di ottenere sequenze, e quindi proteine, differenti, questo le conferisce già un ottimo livello di complessità, che evidentemente va oltre il numero di geni codificanti. Per molto tempo si è parlato di “junk DNA”, in riferimento alla parte non codificante del DNA, ed il “gene non coding” è stato un tema di ricerca importante. In realtà tutto il materiale genetico che sembrava inutile non lo è: la presenza di DNA non codificante non può essere un caso, e molta ricerca genomica è, ad oggi, rivolta a capire cosa ci sia in quelle porzioni di sequenza, che sembrerebbero contenere le istruzioni per vari meccanismi di regolazione fine. Quello della “regolazione” è un concetto chiave: è fondamentale comprendere l’abbondanza e l’utilizzo dei pochi elementi componibili in modo da dare origine alle diverse cellule dell’uomo.

Banche dati pubbliche

Le sequenze del genoma sono messe a disposizione in banche dati pubbliche, per tutta la comunità scientifica. Le banche dati primarie per le sequenze nucleotidiche, in cui sono presenti sequenze sia del genoma umano che di altri genomi, sono:

• EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Cambridge);
• GenBank (presso NCBI del NIH, USA);
• DDBJ (banca dati del Giappone).

Si tratta di banche dati equivalenti da un punto di vista del contenuto, poiché l’aggiornamento è continuo (ogni due o tre giorni): ci sono, però, delle differenze sulla specificità dei singoli database, e si possono trovare alcune differenze in termini di formato e sintassi. Si tratta di importanti archivi contenenti sequenze derivati da progetti sul genoma, centri di sequenziamento e singoli scienziati.

Proteine

I geni codificanti hanno un prodotto proteico, ovvero una molecola che si forma per traduzione della sequenza di nucleotidi: la sequenza di aminoacidi ricavata viene detta struttura primaria (il termine struttura può essere fuorviante, dato che si intende semplicemente la successione delle unità base). La struttura secondaria fa, invece, riferimento a delle effettive conformazioni strutturali di base (tipicamente alpha eliche e lamenti beta), costituenti fondamentali del folding finale: la struttura terziaria tridimensionale complessa che la proteina assume per essere funzionale. La struttura quaternaria si ha quando ci sono 2 prodotti proteici che si complessano tra loro a formare una struttura più complicata ed evoluta.

Le proteine sono da sempre identificate come le molecole che effettuano le operazioni necessarie all’interno della cellula, distinguiamo:

• Enzimi: proteine che catalizzano le reazioni chimiche;
• Proteine di struttura;
• Proteine di trasporto;
• Proteine di canale: permettono il passaggio di specie attraverso la membrana cellulare;
• Proteine del sistema immunitario.

Questo non vuol dire che le proteine debbano essere il nostro unico scopo finale: ci interessano i geni, nella loro anatomia e nella sequenza, l’RNA che si forma quando la cellula attua un certo tipo di programma e, solo infine, anche tutti i prodotti proteici (se funzionali) e gli eventuali elementi di regolazione che intervengono per modularne l’utilizzo. La regolazione dell’utilizzo dei geni è un aspetto chiave nella comprensione dei meccanismi fisiologici e patologici.

Le scienze omiche

Si parla di diverse omiche (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica, ecc) che, studiando diversi tipi di molecole, forniscono diversi layers di informazione. Anche a livello sperimentale, è facile passare da un layer all’altro, anche se c’è una certa specializzazione tra le varie tecnologie. L’alterazione della proteina è il tipo di difetto di cui ci si è occupati maggiormente, perché è il problema più chiaro da affrontare e risolvere: le alterazioni della sequenza (mutazioni) sono sempre state cercate, quindi, tipicamente, nella parte del genoma che codifica le proteine (che viene trascritta e tradotta in aminoacidi). Nel momento in cui c’è un cambio di base che rende un aminoacido differente da quello della maggior parte degli altri individui, questo può essere individuato come il responsabile di una condizione non fisiologica. Le patologie maggiormente studiate da questo punto di vista sono quelle in cui c’è una mutazione puntiforme (di una singola base), dove l’alterazione della sequenza del DNA porta ad un’alterazione dell’RNA con il cambio del relativo aminoacido. Un esempio di patologia di questo tipo è l’anemia falciforme, dove un’Adenina diventa Timina, determinando il cambio dell’acido glutammico in valina, e dunque il cambiamento strutturale dell’emoglobina, che ne altera la forma ed altera l’efficienza sia di questa che dei globuli rossi. In questo caso la catena di eventi che determina la condizione patologica è chiara, ma la vera sfida è comprendere i meccanismi molecolari alla base delle malattie “complesse”, in cui concorrono diversi elementi già a livello genico. Tutto ciò è intrinsecamente diverso dalla genetica, che si occupa dello studio delle differenze inter-individuali dei genomi.

Database di proteine

Ce ne sono molti, ma quelli di riferimento sono:

• UniProt