Appunti Chimica analitica

Chimica analitica campionamento

Fase molto difficile che spesso può rappresentare una importante fonte di errore. È importante avere chiari:

• L’obiettivo dell’analisi (es. studio del contenuto di polifenoli e resveratrolo in uva)
• Le variabili che influenzano il parametro da misurare (stadio di maturazione, esposizione della pianta al sole, posizione acini, integrità acini, ecc.)

In molti casi è importante scegliere il momento adatto per il prelievo. Il campione deve essere rappresentativo, cioè la composizione del campione da esaminare deve essere tale da rappresentare fedelmente quella della massa del materiale da cui è stato prelevato. Se la massa è grande ed eterogenea, è richiesto un grosso lavoro per ottenere un campione rappresentativo. È necessario porre attenzione nel caso di liquidi non omogenei, emulsioni, sospensioni, solidi con particelle di dimensioni diverse. Importante anche il passaggio da grossolano a campione di laboratorio. Campioni replicati – porzioni di un materiale aventi approssimativamente la stessa grandezza e che vengono sottoposti ad una procedura analitica nello stesso tempo e nello stesso modo.

Trattamento del campione

Trasporto e/o conservazione

• Importante controllare umidità/assorbimento o desorbimento di acqua
• Valutare possibile evaporazione se il campione è liquido o contiene analiti volatili

Trattamenti

• Macinazione/omogeneizzazione se campione liquido, dissoluzione per solubilizzare l’analita/estrazione
• Eliminazione delle interferenze (specie che possono determinare un errore in un’analisi aumentando o attenuando la quantità da misurare)

Operazioni analitiche generali

1. Dissoluzione: porta in soluzione il materiale da analizzare
2. Diluizione: operazione mediante la quale viene diminuita la concentrazione della soluzione in esame
3. Concentrazione: eliminazione di parte del solvente mediante evaporazione (riscaldamento diretto, a bagnomaria o rotavapor)
4. Essiccamento: evaporazione spinta fino all’eliminazione totale del solvente (rotavapor, capsula su fiamma diretta, stufa)
5. Calcinazione: ulteriore riscaldamento del residuo ottenuto dopo essiccamento con decomposizione di alcuni componenti. Ad esempio: CaCO₃ → CaO + CO₂
6. Precipitazione: formazione di una fase solida all’interno di una soluzione
7. Decantazione: si lascia depositare un solido sul fondo del recipiente e successivamente si versa o si pipetta il liquido senza trascinare le particelle del precipitato
8. Filtrazione: impiego di una parete porosa (filtro) che lascia passare il liquido e trattiene le particelle solide
9. Centrifugazione: separazione di solido da liquido mediante impiego di centrifuga

Soluzione

Soluzione e sospensione. Solubilità: “il simile scioglie il simile”

• Composti ionici (Sali, acidi, basi) o polari solventi polari (acqua)
• Composti apolari (idrocarburi) solventi non polari

Es: NaCl – solido, elettrolita, solubile in acqua; Saccarosio – solido, non elettrolita, ma polare, solubile in acqua; Vitamina A – non polare, non solubile in acqua. La polarità di un solvente si misura mediante la costante dielettrica. In particolare, i solventi polari presentano valori elevati della costante dielettrica, mentre i solventi apolari presentano bassi valori della costante dielettrica.

Preparazione di una soluzione

Per sostanze igroscopiche necessario un preventivo essiccamento in stufa e la conservazione in essiccatore.

• Pesata: Bilancia tecnica vs. analitica
• Portata/Capacità: quantità massima che lo strumento può apprezzare.
• Sensibilità: rapporto tra risposta strumentale e quantità dell'analita.
• Limite di rivelabilità: minima quantità che può essere determinata.
• Risoluzione: capacità di discriminazione tra due valori.
• Accuratezza/Esattezza: capacità di dare un risultato vicino a quello vero.
• Precisione: capacità di riprodurre sempre lo stesso dato in seguito a misure ripetute nelle stesse condizioni.

Estrazione

Isolamento di una sostanza matrice. Da considerare l’effetto di parametri quali:

• Ratio campione/solvente
• Temperatura
• Tempo di contatto
• Mescolamento
• Esposizione a luce e/o aria

Esempi:

• Caffeina, teofillina, teobromina da foglia di tè: acqua, temp. elevata, pochi minuti
• Olio essenziale da agrumi: alcool, temp. ambiente, più ore

L’estrazione può essere solido/liquido o liquido/liquido. Per la scelta del liquido bisogna fare riferimento alla scala di polarità dei solventi. È più efficace ripetere l’estrazione con piccole quantità di volume piuttosto che effettuarne una sola con un volume maggiore. Ad esempio, è meglio effettuare 3 estrazioni con 10 mL ciascuna che una con 30 mL. È importante controllare se l’estrazione è esaustiva.

Estrazione liquido/liquido

I solventi più comunemente usati per estrarre una o più sostanze organiche da una soluzione acquosa sono generalmente:

• Etere dietilico, etere diisopropilico, etere di petrolio, acetato di etile, benzene, ecc. (meno densi dell’acqua)
• Cloroformio, diclorometano, tetracloruro di carbonio, ecc. (più densi dell’acqua)

La scelta viene dettata in funzione della solubilità della sostanza da estrarre, del punto di ebollizione del solvente usato, dell’inerzia chimica nei confronti del prodotto da separare, dell’infiammabilità, ecc. Legge di distribuzione di Nernst regola un processo di estrazione liquido/liquido: “In condizioni di equilibrio, il rapporto tra le attività di un soluto distribuito fra due liquidi immiscibili fra loro è costante quando la temperatura viene mantenuta costante”.

Estrazioni multiple

Quando il coefficiente di ripartizione (K) ha un valore molto grande, la quantità di soluto che rimane nella fase acquosa risulta molto piccola e quindi un’unica estrazione potrebbe essere sufficiente per estrarre tutto il farmaco dalla fase acquosa. In pratica si usa effettuare più di una estrazione allo scopo di usare sempre solvente fresco e quindi più efficace per estrarre. È possibile calcolare il numero delle estrazioni necessarie per estrarre una quantità voluta di farmaco. È possibile inoltre calcolare la quantità totale di farmaco estratto dopo un certo numero di estrazioni conoscendo il valore della costante di ripartizione, il volume di estraente usato per ogni estrazione ed il volume della fase estratta. È più conveniente fare una serie di estrazioni con piccole quantità di solvente, piuttosto che farne una in un’unica soluzione.

Estrazioni in continuo

I vapori del solvente, portato a ebollizione nel pallone, raggiungono, tramite il raccordo laterale, il refrigerante dove condensano e, ricadendo nella camera di estrazione, attraversano il filtro a ditale ed estraggono il soluto. Quando il livello del liquido (contenete la miscela sostanza da estrarre e solvente) aumenta fino a sfiorare la curva superiore del sifone, questo viene risucchiato nel pallone e il solvente può ricominciare un nuovo ciclo.

Estrazione solido/liquido

Campioni reali ed effetto matrice. L’analisi di un campione reale è complicata dalla presenza della matrice del campione che può contenere specie con proprietà chimiche simili a quelle dell’analita. Alcuni componenti presenti nella matrice possono reagire allo stesso modo dell’analita e generare una risposta simile causando sovrastima, oppure possono mascherare l’analita causandone una sottostima.

• Tecniche analitiche specifiche: impiegano proprietà chimiche o fisiche caratteristiche per il solo analita in esame (es: alcuni saggi colorimetrici – Ni²⁺ dimetilgliossima)
• Tecniche analitiche selettive: impiegano reazioni o proprietà caratteristiche di un gruppo ristretto di composti (es: saggi di riconoscimento per i carboidrati)

Purificazione estrazione in fase solida (SPE)

È un processo fisico che utilizza una fase solida e una fase liquida. La fase solida viene scelta in modo che il composto da isolare abbia una affinità maggiore con essa rispetto al solvente in cui è sciolto. Quando il campione passa attraverso la fase solida, gli analiti vengono concentrati sulla superficie del materiale adsorbente mentre gli altri composti eluiscono senza interagire. Ciò può essere ottenuto grazie ad interazioni specifiche fra i gruppi funzionali dei composti e il substrato della fase solida. La cartuccia funziona al contrario di un filtro: l’analita rimane “intrappolato” nella cartuccia, le sostanze della matrice invece vengono eliminate. Infine, per rimuovere l’analita isolato nella cartuccia, si utilizza un solvente molto affine all’analita per lavare la cartuccia e raccogliere l’analita. Risultato: purificazione e concentrazione delle sostanze isolate.

Controllo di qualità dei metodi analitici

Valutare l’attendibilità dei risultati

L’accuratezza o esattezza indica quanto una misura vicina è al valore accettato. Ad esempio, ci aspettiamo che una bilancia legga 100 grammi se poniamo un peso standard di 100 grammi su di essa. In caso contrario, la bilancia non è accurata. La precisione, invece, indica quanto vicini o quanto ripetibili siano i risultati. Uno strumento di misura preciso darà quasi lo stesso risultato ogni volta che viene utilizzato. In altre parole, la precisione di un esperimento, di uno strumento o di un valore è una misura dell’affidabilità e della coerenza.

Errori nei dati sperimentali

• Errori casuali: errori che possono avvenire con la stessa probabilità sia in difetto che in eccesso. Hanno un’origine aleatoria e spesso temporanea. Non dipendono dall’operatore. Possono essere ridotti mediante ripetizione delle misure. Infatti, all’aumentare del numero delle misure, le fluttuazioni introdotte tendono a “bilanciarsi” in quanto avvengono sia in difetto che in eccesso con la stessa probabilità. Facendo la media delle misure annullo l’errore. Incidono sulla precisione.
• Errori sistematici: la differenza tra il valore reale della grandezza in esame e il valore assunto dalla misura effettuata. Le incertezze sperimentali che non possono essere individuate attraverso la ripetizione delle misure sono dette sistematiche. Il trattamento degli errori sistematici è tanto importante quanto delicato. La loro natura subdola, che “forza” la misura sempre nello stesso verso, ne rende difficile l’individuazione. Spesso derivano da un’errata taratura degli strumenti (es: la bilancia che invece che segnare 0 segna 0,01) incidono sull’accuratezza.
• Errori sistematici costanti: l’errore (o deviazione) è indipendente dalla concentrazione dei componenti analizzati. Spostamento parallelo della curva di calibrazione su matrice (2) (con deviazione sistematica costante) in relazione alla curva di calibrazione (1) preparata con soluzioni standard pure. Possibili cause: insufficiente selettività, causata da altri componenti che interferiscono con la risposta; inadeguata correzione con analisi del bianco.
• Errori sistematici proporzionali: l’errore (o deviazione) è dipendente dalla concentrazione dei componenti analizzati. Spostamento della pendenza della curva di calibrazione su matrice (2) (con deviazione sistematica proporzionale) in relazione alla curva di calibrazione (1) preparata con soluzioni standard pure. Principali fonti di errore: errori nella calibrazione (effetto matrice), incorretta assunzione di linearità nell’intervallo di concentrazioni analizzato.
• Errori grossolani: racchiudono tutti gli errori madornali errori sulla lettura dello strumento, sulla trascrizione di dati, errori dovuti a problemi di trasmissione dati in strumenti digitali o a transienti (variazioni brusche) nell'alimentazione degli apparati di misura. Meritano di essere considerati a parte poiché non sono del tutto assimilabili né agli errori di tipo casuale, mentre producono effetti di tipo sistematico se sono pochi: se invece, per esempio, si commettono tanti errori grossolani, questi alla fine possono anche compensarsi.

Radiazioni elettromagnetiche

Maggiore è la lunghezza d’onda minore è l’energia associata alla radiazione = lunghezza d’onda ed energia sono inversamente proporzionali. Spettro elettromagnetico: radio, TV, microonde, infrarossi, spettro visibile, UV, raggi X, raggi gamma, raggi cosmici. Le zone di interesse per l’analisi strumentale sono gli infrarossi (1550 nm), spettro visibile e UV (100 nm). Vari metodi analitici sono basati sull’interazione di radiazioni elettromagnetiche con la materia. Radiazione elettromagnetica: simultanea propagazione nello spazio e nella medesima direzione di un campo elettrico e di un campo magnetico tra loro perpendicolari. Molte delle proprietà delle radiazioni elettromagnetiche sono convenientemente descritte utilizzando due diversi modelli:

• Modello ondulatorio: la radiazione è costituita da onde (Secondo Huygens la luce è composta da onde, generate da un'origine ignota e sconosciuta nell'Universo, che si propagano nell'etere in ogni direzione)
• Modello corpuscolare: la radiazione è costituita da piccole particelle cariche di energia che si muovono attraverso lo spazio. Nello spazio non si muove un’onda ma un insieme di fotoni, ogni fotone porta un quanto, un’unità indivisibile. (La teoria corpuscolare della luce venne formulata da Newton. Secondo il fisico inglese, la luce era composta da corpuscoli che si propagavano in linea retta nell'etere.)

Modello ondulatorio

La radiazione elettromagnetica è caratterizzata da determinati parametri d’onda.

• Ampiezza: quantità vettoriale che fornisce la misura della forza del campo elettrico o magnetico ad un massimo dell’onda.
• Periodo: tempo (s) necessario per il passaggio di massimi o minimi successivi per un punto nello spazio.
• Frequenza (ν): numero di oscillazioni che si hanno in un secondo (misurata in hertz: 1 ciclo/sec)
• Lunghezza d’onda (λ): distanza lineare tra due punti equivalenti su onde successive
• Numero d’onda: Reciproco della lunghezza di un’onda elettromagnetica
• Velocità di propagazione (v): In un qualunque mezzo contenente materia, la velocità della radiazione e.m. è rallentata dall’interazione degli atomi o molecole del mezzo con il campo e.m. della radiazione. Poiché la frequenza (ν) di un raggio è costante e dipende dalla sorgente che lo emette, se la velocità diminuisce, avremo una diminuzione della lunghezza d’onda. La velocità e la lunghezza d’onda della radiazione e.m. diventano più piccole quando la radiazione passa dal vuoto o dall’aria in un mezzo più denso.
• Indice di rifrazione: rapporto tra la velocità della luce nel vuoto e la velocità nel mezzo.

Modello corpuscolare

Proprietà particellari della radiazione elettromagnetica: la radiazione elettromagnetica è costituita da pacchetti discreti di energia chiamati fotoni. Il fotone è il "quanto" di radiazione, ossia la quantità indivisibile di energia elettromagnetica, derivante dal campo elettrico e dal campo magnetico generati da cariche elettriche in movimento. L’energia di un fotone dipende dalla frequenza della radiazione E=hν. Il prodotto hν rappresenta il minimo valore di energia che può essere trasportata da un’onda elettromagnetica di frequenza ν. Questa minima energia fu chiamata da Plank quanto di luce.

Interazioni radiazione e.m. – materia

Se una sostanza è irradiata con una radiazione e.m., le particelle di cui essa è costituita possono interagire con i fotoni della radiazione. Fenomeni riconducibili al succedersi di due fondamentali eventi:

1. Trasferimento di energia dalla radiazione alla materia (assorbimento);
2. Restituzione dell’energia sotto diverse forme (emissione).

Transizioni energetiche

Assorbimento ed emissione di energia da parte della materia. All’istante t₁ l’atomo o la molecola nel suo stato fondamentale assorbe una quantità di energia (E₂ - E₁). Ciò si traduce nel passaggio di un elettrone dal suo livello base ad uno stato eccitato (livello energetico E₂). Subito dopo si verifica un processo di rilassamento ed all’istante t₂ si ha emissione dell’energia acquisita con ritorno al livello energetico di partenza. Le molecole possono subire tre diversi tipi di transizioni quantizzate quando sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica, a seconda dell’energia in gioco: UV > visibile > infrarosso.

• Transizioni elettroniche: la radiazione UV-visibile comporta la promozione di elettroni residenti in orbitali atomici o molecolari a bassa energia su livelli energetici ad energia più alta.
• Transizioni vibrazionali (Infrarosso e microonde): Vibrazioni di stiramento: simmetrico e asimmetrico; Vibrazioni di piegamento
• Transizioni rotazionali (Infrarosso e microonde): Ad ogni livello elettronico sono associati diversi livelli vibrazionali ed a ciascuno di questi sono associati diversi livelli rotazionali. All’interno di un livello di energia vibrazionale, la molecola potrà trovarsi in diverse situazioni.