Agire sul DNA

Agire sul DNA: le biotecnologie

Origine ed evoluzione delle biotecnologie

Dalla seconda metà del secolo scorso si sono sviluppate le tecniche di ingegneria genetica grazie alle quali è stato possibile manipolare i geni, introdurli in altri organismi e fare in modo che si esprimano ottenendo così prodotti commerciali.

Ad oggi disponiamo di interi genomi sequenziati, così che ogni organismo può essere visto come una sorta di catalogo di geni di potenziale applicazione biotecnologica.

Come isolare un gene di interesse

Per ottenere un gene di interesse si possono seguire almeno quattro vie:

• Si può isolare il gene direttamente dalle cellule che lo possiedono, per mezzo degli enzimi di restrizione.
• Si può sintetizzarlo “a ritroso” a partire dallo specifico mRNA prelevato dalle cellule in cui avviene la sintesi della proteina. L’impiego della trascrittasi inversa rende possibile ottenere una sequenza di DNA a singolo filamento da uno stampo di mRNA. Il successivo impiego della DNA-polimerasi produce una catena complementare, formando così cDNA, che rappresenta il gene ricercato.
• Si può impiegare la reazione a catena della polimerasi, detta PCR.
• Lo si può ottenere per sintesi chimica a partire dai singoli nucleotidi da cui è composto.

Gli enzimi di restrizione

Se si vuole isolare un gene di interesse si può tagliare il DNA in sequenze più brevi, fra le quali si può individuare quella che contiene il gene. Questo risultato si può ottenere con l’impiego di enzimi di restrizione, grazie ai quali è possibile tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche di basi.

Questi enzimi sono stati scoperti nei batteri, dai quali vengono prodotti per difendersi dall’attacco dei virus batteriofagi (questi enzimi riescono a frammentare il DNA virale rendendolo così inoffensivo, ma non tagliando il DNA batterico in quanto protetto tramite metilazione per essere riconosciuto dagli enzimi).

Ogni enzima di restrizione riconosce e taglia il DNA quando incontra specifiche sequenze di basi, dette siti di restrizione; tali sequenze sono palindrome, cioè presentano la stessa sequenza se sono lette nella direzione 5’-3’ su entrambi i filamenti.

Per identificare gli enzimi di restrizione (es. EcoRI), si usano sigle che indicano:

• Il batterio di origine (prime tre lettere scritte in corsivo);
• Il ceppo batterico particolare (viene aggiunta una quarta lettera, può essere anche omessa);
• La successione temporale di scoperta dell’enzima (numero scritto in lettere romane).

Il taglio operato dagli enzimi di restrizione può essere di due tipi:

• Si ha un taglio simmetrico quando l’enzima taglia al centro della sequenza, producendo così sequenze complementari di DNA della stessa lunghezza.
• Nel taglio asimmetrico l’enzima effettua un taglio sfalsato, in questo modo si generano frammenti con estremità di lunghezza differente. Le estremità a singolo filamento sono dette sticky ends, possono appaiarsi per complementarietà alle estremità di un altro frammento di DNA di origine diversa.

La presenza di estremità sfalsate favorisce la ricombinazione di frammenti di DNA, tuttavia per saldarsi stabilmente tra loro è necessario l’intervento di enzimi, chiamati ligasi, che per funzionare richiedono ATP e specifiche temperature.

L’elettroforesi su gel di frammenti del DNA

Quando una molecola di DNA è trattata con un enzima di restrizione si produce una miscela di frammenti di lunghezza diversa. Per separare questi frammenti si utilizza la tecnica di separazione mediante elettroforesi su gel, che sfrutta le differenze fisico/chimiche dei frammenti di DNA ottenuti.

Questa tecnica sfrutta la capacità di una molecola carica elettricamente di migrare all’interno di un campo elettrico. Il DNA possiede cariche negative (conferite dal gruppo fosfato presente in ogni nucleotide) quindi, se sottoposto all’azione di un campo elettrico, si muove verso il polo positivo.

L’elettroforesi prevede l’utilizzo di una matrice di separazione (di solito un gel di agarosio) che funge da setaccio per i frammenti che durante la corsa elettroforetica si separano.

La matrice deve essere disciolta in un tampone di corsa (una soluzione che consente la conduzione della corrente).

L’agarosio viene sciolto nel tampone di corsa e poi depositato e fatto solidificare in un supporto orizzontale in cui sono stati creati diversi pozzetti, in cui poi successivamente vengono depositati i campioni da analizzare. Si applica poi il campo elettrico con un alimentatore che fornisce corrente continua per 25-30 minuti. A fine corsa i frammenti possono essere osservati solo dopo colorazione del gel mediante un colorante.

Gli scopi dell’elettroforesi su gel del DNA consistono nel disporre di frammenti separati per:

• Valutare e studiare le caratteristiche dei singoli frammenti;
• Estrarre singoli frammenti per ottenere DNA ricombinante;
• Individuare in quale frammento si trova il gene di interesse.

L’individuazione del gene di interesse si realizza impiegando sonde a DNA marcate.

Localizzare un gene tramite sonde molecolari

Le sonde molecolari sono sonde in grado di localizzare le sequenze complementari rispetto a quelle con cui sono costruite.

Le sonde molecolari

Per ricercare e identificare fra migliaia di sequenze quella desiderata (gene target) è possibile ricorrere all’uso di sonde molecolari a DNA o a RNA.

Una sonda è un frammento specifico di DNA o RNA marcato radioattivamente o con fluorocromi che può ibridare, cioè riconoscere e legarsi solo ai tratti di DNA bersaglio che hanno la sequenza complementare (affinché si possa formare l’ibrido sia la sonda che l’acido nucleico bersaglio devono essere sotto forma di singoli filamenti).

Le sonde sono sintetizzate mediante:

• La clonazione del DNA in vettori molecolari;
• L’uso della trascrittasi inversa, che permette la sintesi di cDNA;
• L’uso della PCR;
• La sintesi chimica, partendo da nucleotidi trifosfati modificati.

Le sonde devono avere un sistema che gli permette di essere facilmente localizzabili.

Le sonde possono essere infatti:

• Radioattive o calde: si ottengono grazie alla marcatura degli acidi nucleici con gli isotopi radioattivi del fosforo o dello zolfo. Esse sono delle sonde molto sensibili, tuttavia gli elementi radioattivi le rendono pericolose, costose e di difficile smaltimento.
• Non radioattive o fredde: sono più stabili e di uso meno problematico.

Si possono unire anche filamenti non perfettamente complementari, infatti affinché si possa formare un ibrido stabile, è sufficiente che le basi azotate di due filamenti di DNA siano complementari per almeno 15-20 nucleotidi continui.

Tecniche di ibridazione

L’ibridazione su filtro avviene su un filtro di nylon o su membrana di nitrocellulosa.

1. Lo schema di questa tecnica prevede:

• Il trasferimento su filtro o membrana degli acidi nucleici bersaglio denaturati;
• Il fissaggio dell’acido nucleico mediante il calore o esposizione a raggi UV;
• Una pre-ibridazione con il tampone di ibridazione;
• L’ibridazione con il tampone di ibridazione e la sonda marcata denaturata;
• Una serie di lavaggi;
• La rivelazione dell’ibrido target/sonda.

2. L’ibridazione in situ è una tecnica usata non solo per verificare la presenza o meno di una sequenza, ma anche per identificare su quale cromosoma è posizionato un dato gene.

Inserire geni nelle cellule: i vettori molecolari

L’introduzione di molecole di DNA esogeno in cellule competenti si chiama trasformazione, se avviene in una cellula ospite batterica, o trasfezione, quando riguarda cellule eucariotiche.

Lo scopo di queste tecniche è far sì che il DNA esogeno sia mantenuto stabilmente nella cellula, venga trasmesso alle cellule figlie e sia espresso per poter poi raccogliere un prodotto.

I metodi più diffusi per veicolare il DNA prevedono l’uso di vettori molecolari, elementi genici extracromosomici che possono contenere e trasportare un frammento di DNA esogeno, detto inserto, e mantenerlo stabile nella cellula ospite.

Tutti i vettori devono avere i seguenti requisiti:

• Penetrare facilmente nella cellula ospite;
• Essere stabili e compatibili con la cellula ospite;
• Avere la capacità di replicarsi in modo autonomo rispetto al genoma della cellula ospite;
• Possedere siti di restrizione unici per ogni enzima di restrizione;
• Possedere geni marcatori selezionabili che permettono l’identificazione e l’isolamento delle cellule trasformate e ricombinate.

Ciò che differenzia i vettori è soprattutto la dimensione dell’inserto che possono integrare.

I vettori batterici: i plasmidi

I plasmidi sono molecole circolari di DNA extracromosomico a doppio filamento dotati di replicazione autonoma.

I plasmidi sono i vettori più utilizzati per le loro piccole dimensioni e la loro maneggevolezza nel trasferimento di geni, tuttavia hanno il limite di non poter ospitare frammenti più grandi di 10.000 nucleotidi.

Al fine di poter funzionare come vettori, è importante che i plasmidi presentino una regione dove sono raggruppate tutte le sequenze di riconoscimento dei principali enzimi di restrizione, chiamata polylinker.

L’inserimento del DNA esogeno all’interno del plasmide ne prevede infatti il taglio con enzimi di restrizione, per cui è fondamentale che i siti di riconoscimento per questi enzimi non interrompano geni fondamentali per l’integrità funzionale del plasmide.

Nelle tecniche di trasferimento di geni occorre considerare che gli eventi non si svolgono in modo certo, per questo ci si trova di fronte a una serie di eventi probabili:

• Non è detto che il gene entri nel plasmide-vettore: le estremità del plasmide possono saldarsi nuovamente senza integrare il gene, generando un plasmide non ricombinato;
• Non è sicuro che le cellule acquisiscano il plasmide ricombinato.

I risultati dell’operazione possono quindi essere:

• Cellula ospite senza plasmide;
• Cellula ospite con plasmide non ricombinato;
• Cellula ospite con plasmide ricombinato (il risultato sperato).

Diventa dunque indispensabile disporre di geni marcatori che permettano il riconoscimento delle cellule ospiti ricombinanti.

I geni marcatori selezionabili più usati nei plasmidi batterici sono quelli che conferiscono la resistenza a un antibiotico, per cui è sufficiente far crescere le cellule batteriche in presenza dell’antibiotico specifico per poter selezionare le cellule trasformate che sono resistenti.

Altri vettori: batteriofagi, cosmidi, BAC e YAC

Oltre ai plasmidi, le biotecnologie impiegano altri tipi di vettori.

I fagi o batteriofagi sono virus che infettano le cellule batteriche e sono frequentemente utilizzati come vettori per trasferire geni in cellule procariotiche. Possono trasportare DNA esogeno di dimensioni maggiori rispetto ai plasmidi (tra 10 e 22 kbp). Il fago più utilizzato è il fago λ.

I cosmidi sono vettori ibridi ottenuti dall’unione di plasmidi e DNA fagico. La parte plasmidica include il polylinker e i marcatori di selezione, ma presenta il vantaggio di poter ricevere inserti di elevate dimensioni (fino a 45 kbp).

I cromosomi artificiali di lievito o vettori YAC sono vettori artificiali costruiti in modo che possano contenere inserti molto lunghi (fino a 2.000 kbp).

Le caratteristiche delle cellule ospiti

Un’appropriata cellula ospite deve avere diverse caratteristiche:

• Deve fornire un’ambiente adatto affinché il vettore possa permanere stabilmente e replicarsi;
• Deve essere in grado di riprodursi;
• Non deve produrre enzimi di restrizione;
• Deve essere facilmente trasformabile o infettabile.

Le cellule ospiti più utilizzate sono le cellule dei procarioti, in particolare E. coli.

Un altro ospite utilizzato è il batterio Bacillus subtilis, che secerne i metaboliti prodotti nel terreno di coltura, rendendo così più semplice la raccolta delle proteine ricombinanti.

I sistemi batterici, tuttavia, hanno lo stesso svantaggio di non poter esprimere proteine che necessitano di modificazioni post-traduzionali.

Gli ospiti eucariotici più usati sono i lieviti, i cui vantaggi sono una rapida divisione cellulare (tutto il ciclo si completa in poche ore) e la facilità di coltivazione in laboratorio.

Il maggior problema risiede nell’espressione delle proteine che necessitano di glicosilazione (processo di modifica di una proteina alla quale viene aggiunta una o più molecole di glucosio), che nelle cellule di lievito non avviene sempre correttamente.

Per superare il problema della glicosilazione esiste la possibilità di utilizzare colture di cellule di insetto, che hanno il vantaggio di avere un costo ridotto e di essere non infettabili da patogeni; tuttavia non si prestano alla produzione su larga scala e non sono in grado di introdurre tutte le modificazioni post-traduzionali che potrebbero servire.

Nell’ultimo decennio è diventato sempre più frequente l’uso delle piante come bioreattori per la produzione di molecole e proteine ricombinanti d’interesse farmaceutico; questo perché le cellule vegetali permettono di produrre una vasta gamma di proteine d’interesse farmaceutico con massima specificità e con ridotta possibilità