Endocrinologia Granata parte 2

Lezione 6: recettori accoppiati a proteine G

I R accoppiati a proteine G sono dei R con 7 domini transmembrana che, differentemente dai R accoppiati alle tirosine-chinasi, attivano di solito un secondo messaggero, che generalmente è l’adenilato ciclasi; c’è una proteina G che passa dalla forma inattiva alla forma attiva quando il R si lega all’ormone, c’è poi uno scambio GDP-GTP, quindi l’attivazione ulteriore della forma GTP dell’enzima e in questo modo si forma il secondo messaggero (proteina G + enzima dà origine a secondo messaggero), che può essere cAMP o diverso a seconda del segnale che viene attivato.

Recettori accoppiati a proteine G (GPCRs)

7 domini transmembrana. Il legame con il R attiva le proteine G (trimeriche) ad esso associate e l’enzima effettore (es. adenilato ciclasi) che catalizza la sintesi del secondo messaggero (es. cAMP). Il secondo messaggero innesca le reazioni cellulari, regola la trascrizione di geni specifici e modifica l’attività di E e proteine non enzimatiche.

I G protein-coupled R sono la famiglia più importante di R perché sono codificati da molti geni, sono riconosciuti da molti ormoni e sono anche bersaglio di molti farmaci. Sono anche attivati da molte sostanze, che possono essere ormoni, peptidi, aminoacidi, ioni, molecole che trasportano gli odori, gusto e fotoni, quindi diciamo che sono una miriade di sostanze e non soltanto gli ormoni. Adrenalina, somatostatina, GHRH.

Controllano l’attività di molti enzimi, hanno questo effetto sullo scambio GDP-GTP su proteine G eterotrimeriche, le Galfa-betagamma. La subunità Galfa è la subunità più importante associata all’ormone che induce la trasduzione del segnale. Ci sono molte malattie che sono associate ai polimorfismi di questi R, quindi sono anche un bersaglio importante di numerosi farmaci, che sono in grado di modulare l’attività di questi R.

G protein-coupled receptors

Hanno una struttura abbastanza simile, con 7 domini alfa elica che attraversano la membrana, non hanno omologia di sequenza e non sono filogeneticamente correlati.

Questo è uno schema che permette di vedere come sono fatti questi R, e vedete la quantità di sostanze che possono legarli, dalla luce al calcio, agli odori, ai feromoni, alle piccole molecole e proteine. C’è il solito meccanismo di legame, l’attivazione del GDP che diventa GTP, la subunità alfa beta e gamma delle G protein, l’effettore, come adenilato ciclasi, e poi il messaggero intracellulare, che può essere cAMP o l’inositolo trifosfato.

Diversity of G-protein-coupled receptors (GPCRs)

Questo è un altro esempio di come sono fatti i R, qua sono diverse le subunità alfa per esempio, e ci può essere l’alfa inibitoria (alfa I), che è quella che per definizione inibisce le vie di segnale che sono ad esempio l’adenilato ciclasi e l’cAMP, per cui anziché indurre la produzione di cAMP la inibisce, quindi ha effetti prevalentemente di inibizione.

L’alfa Q ha degli effetti diversi sulla fosfolipasi C, sul diacilglicerolo, sul calcio e sulla proteinchinasi C; l’alfa S invece ha un effetto opposto, infatti si chiama alfa stimolatoria, e quindi induce la produzione di adenilato ciclasi e fa aumentare i livelli di cAMP e normalmente stimola la secrezione degli ormoni. Ce ne sono anche altre che sono meno importanti, ma diciamo che l’alfa I e l’alfa S sono le più importanti.

Rodopsina, agonisti adrenergici, catecolamine, adenosina, somatostatina.

Glucagone, ormone paratiroideo, growth hormone-releasing hormone (GHRH), gonadotropin-releasing hormone (GnRH).

Ci sono le subunità Bgamma che hanno altri effetti, e il risultato finale è quello di attivare a livello del nucleo delle risposte biologiche che includono come sempre la proliferazione, il differenziamento, lo sviluppo, la sopravvivenza, l’angiogenesi, l’ipertrofia e il cancro.

Glutammato, Ca⁺⁺, acido gamma-aminobutirrico (GABA_B).

Ci sono diverse classi di GPCR, diverse famiglie, qua vedete la famiglia 1, 2 e 3: la famiglia 1 è legata soprattutto dalla somatostatina, la famiglia 2 è legata dal GHRH (stimola il rilascio del GH dall’ipofisi), e l’acido gamma-aminobutirrico (GABA), un neurotrasmettitore, lega invece i R della famiglia 3.

Modello monomerico dell’amplificazione del segnale

I GPCR sono abbastanza diversi dai R tirosina-chinasi anche per la loro capacità di formare dimeri, ossia di unirsi con altri R e trasmettere il segnale in modo sinergico aiutandosi e avvalendosi della vicinanza di un altro R sempre accoppiato a proteine G.

Questo è un modello monomerico, quindi il classico modello di trasduzione/attivazione del segnale, ossia c’è un ormone che lega il GPCR, quindi c’è il legame con la proteina G, l’attivazione e la formazione dell’enzima, e quindi la risposta.

Un agonista attiva un singolo R e l’amplificazione del segnale avviene a livello della proteina G o dell’effettore.

Ci possono essere dei meccanismi di desensitivazione, ossia questi R possono essere fosforilati da delle chinasi specifiche che sono in grado di fosforilare il R stesso, e questo è un modo per bloccare/inibire il legame del R con l’ormone. Quando vengono fosforilati da queste chinasi (GPCR regulatory kinases GRK) possono essere anche riconosciuti da un’altra molecola, che si chiama arrestina, che a sua volta porta a questo meccanismo di inibizione dell’attivazione del R, quindi blocca la trasmissione del segnale.

• GRK: GPCR regulatory kinases.
• Arrestina.
• Desensitizzazione.

Modello oligomerico dell’amplificazione del segnale

Meccanismo per cui il L diventa meno efficace nell’attivare il R.

Desensitizzazione: durante l’esposizione prolungata (ad es. a un farmaco).

Questo è un altro esempio dell’amplificazione del segnale (modello oligomerico), vedete come un R lega il proprio ormone, e ci possono essere dei R che si trovano vicino al R che lega l’ormone, e che possono poi amplificare il segnale attivando diverse proteine G, quindi il segnale viene ulteriormente amplificato. Anche qui ci sono i soliti meccanismi di arresto con l’arrestina e le chinasi che fosforilano il recettore.

George SR Nat Rev Drug Discov 2002.

Il legame a un R attiva gli altri R vicini.

Transattivazione dei GPCRs: amplificazione del segnale a livello recettoriale

Poi ci sono degli altri meccanismi di transattivazione, due esempi sono la somatostatina e l’acido gamma-aminobutirrico. Nel caso della somatostatina c’è un R che è capace di riconoscere la somatostatina, con la conformazione giusta, ma che non è in grado di trasdurre il segnale, e di fianco a questo ce n’è un altro che invece non è in grado di riconoscere la somatostatina (vedete che la conformazione è sbagliata rispetto al peptide).

SSTR SSTRB1 B2. Somatostatina. GABA.

Quando c’è la somatostatina il primo R è capace di riconoscerla ma non trasduce il segnale, ma accoppiandosi al secondo R è in grado comunque di attivare la via segnale, per cui la risposta avviene in ogni caso, e questo è un meccanismo di facilitazione nel caso in cui ci siano delle modificazioni, qualche aberrazione o qualche cosa di non funzionante nel R.

Adenilato ciclasi. Adenilato ciclasi.

Questo avviene per altri esempi, come l’acido gamma-aminobutirrico, e questo meccanismo si chiama anche transattivazione.

George SR Nat Rev Drug Discov 2002.

Due mutanti dei R per la somatostatina (SSTR1b) sono co-espressi; uno lega SS-14 e -28 ma non si accoppia all’adenilato ciclasi, l’altro non lega la SS. Trattando con SS-14 e con SS-28 si ha l’accoppiamento adenilato ciclasi, indicando che il legame dell’agonista con il mutante che non trasmette il segnale porta attivazione dell’altro mutante che non lega l’agonista.

Nel caso di eteromeri (R con due isoforme) dei GPCRs, il legame di un agonista ad un R nell’eteromero risulta nell’attivazione dell’altro.

Nel caso del R per il GABA, (GABA_B(1)-GABA_B(2)), la subunità B(1) non è in grado di legare la proteina G, la subunità non può legare il ligando. È necessaria quindi l’eteromerizzazione non solo per il legame ma anche per la trasmissione del segnale, che avviene per transattivazione.

Somatostatina

La somatostatina è un ormone che lega i GPCR ed è conosciuta come somatotropin-release inhibiting factor (SRIF) perché essenzialmente è un ormone che inibisce o la secrezione di ormoni o altre funzioni che vi farò vedere.

Fa parte di ciclopeptidi che sono prodotti sia dal sistema endocrino, gastrointestinale, dal sistema immunitario e nervoso, quindi SNC, ed è prodotta anche da molti tumori, soprattutto del tratto gastroenteropancreatico.

C’è un precursore, come spesso succede per questi peptidi, che dà origine a dei peptidi che sono biologicamente attivi, e quelli fisiologici che si trovano in natura sono la SST-14 (14 aa) e SST28 (28 aa). Oltre a queste due forme, nel cervello e nel sistema immunitario ci sono dei peptidi che hanno delle caratteristiche strutturali e funzionali molto simili a quelle della somatostatina, ossia legano tutti i R della somatostatina, che però hanno una struttura diversa (è un peptide diverso dalla somatostatina), e si chiamano Cortistatina 14 e 17 (CST-14 e CST-17).

La somatostatina lega 5 diverse forme di R (5 GPCR) e funziona come neuromodulatore e neurotrasmettitore, inibisce la secrezione di molti ormoni e inibisce anche la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule.

Per quanto riguarda la secrezione degli ormoni agisce sull’ormone della crescita, l’insulina (tra l’altro nel pancreas la somatostatina viene prodotta dalle cellule beta delle isole di Langerhans) e poi inibisce altri ormoni e per questo motivo viene utilizzata nelle patologie che hanno un’ipersecrezione di ormoni.

Nel tratto gastrointestinale, caratterizzato dalla produzione di diversi ormoni, gli analoghi della somatostatina possono essere usati nei tumori per bloccare l’ipersecrezione di questi; agisce anche sulla secrezione esocrina (quindi non inibisce solo la secrezione endocrina), per esempio sugli enzimi pancreatici, il fluido intestinale e gli acidi gastrici.

Questa è la struttura della somatostatina 14 e 28: vedete che la 28 è come la 14, la struttura è identica, ma con l’aggiunta di altri 14 aa.

Pancreas adulto: SST-14 > SST-28.

Questo è uno schema sugli effetti degli ormoni a livello dell’ipofisi, ossia gli effetti della somatostatina e del GHRH, che sono gli ormoni che regolano la secrezione del GH a livello dell’ipofisi e sono prodotti dall’ipotalamo.

Pituitary growth-hormone (GH) production by somatotrophs is controlled by several factors. GH-releasing hormone.

La SST prodotta dall’ipotalamo agisce sulle cellule somatotrope, cioè sulle cellule che rilasciano GH a livello dell’ipofisi, inibendo il rilascio dell’ormone della crescita (GH), mentre il GHRH stimola il rilascio del GH, quindi hanno degli effetti opposti e regolano in questo modo la secrezione del GH.

Il GH a sua volta agisce sul fegato legandosi ai suoi R specifici e stimolando in questo modo la produzione di Igf-1, che a sua volta può fare feedback negativo, ovvero va a bloccare la secrezione del GH agendo come stimolo negativo su quest’ultima a livello centrale.

La SST è un ormone che inibisce sia la secrezione degli ormoni sia la proliferazione delle cellule, per cui è stata molto studiata in molte patologie come il diabete di tipo I e II, nei tumori ipersecernenti sia a livello gastroenteropancreatico che a livello centrale, in particolare i tumori di origine endocrina come l’adenoma ipofisario GH secernente (con eccesso di produzione di GH), nei disordini gastrointestinali perché ha effetti positivi sull’ulcera gastroemorragica e anche sulla pancreatite perché ha delle azioni antinfiammatorie.

Per la sua capacità di inibire la secrezione, la SST è studiata per il trattamento di patologie come il diabete 1 e 2, i tumori ipersecernenti (tumori neuroendocrini, adenoma ipofisario GH-secernente, gastrinoma, VIPoma*, insulinoma), i disordini gastrointestinali (ulcera gastrica emorragica, pancreatite).

A causa della sua breve emivita (<3 min per SST-14) sono stati sintetizzati composti analoghi metabolicamente più stabili.

L’Octreotide, questo è un ciclo-octapeptide che inibisce la secrezione di molti ormoni, usato nel trattamento dell’acromegalia, dei tumori neuroendocrini, nelle complicanze della chirurgia pancreatica e nella diarrea conseguente al trattamento con chemioterapici.

Il Lanreotide è un altro analogo di SST.

Entrambi questi peptidi hanno maggiore affinità per il recettore della SST di tipo 2 (SSTR-2).

Il problema di questo ormone è che la sua emivita non è più lunga di 3 minuti, per cui se si somministra come farmaco viene distrutta molto rapidamente, quindi bisogna avere degli analoghi più stabili, quindi sintetizzati dal punto di vista chimico in modo che non vengano degradati.

Per questo sono stati studiati diversi analoghi, fra questi uno dei più importanti è l’Octreotide (figura), che è un octapeptide con una forma ciclica che può essere utilizzato in terapia e nel trattamento dell’acromegalia (ovvero una patologia dove si ha un’ipersecrezione del GH per cui i pazienti sono molto alti e hanno arti molto sviluppati), poi dei tumori endocrini, delle complicanze della chirurgia pancreatica e nella diarrea conseguente al trattamento con chemioterapici.

Un altro farmaco che è stato sintetizzato ed è utilizzato nella terapia di diverse patologie è il Lanreotide, che è un altro analogo della somatostatina. Entrambi questi peptidi (lanreotide e octreotide) hanno una maggiore affinità per il R di tipo 2 della SST, e il R di tipo 2 è quello più espresso anche nei tumori, quindi si cerca in qualche modo di produrre degli analoghi che possano avere un’affinità per il R che ovviamente deve essere espresso in quella patologia, e sono studiati per avere una maggiore specificità.

VIPoma è una rara neoplasia endocrina del pancreas a carico delle cellule D1, secernenti peptide intestinale attivo (VIP).

Recettori della somatostatina

I R per la SST sono 5 abbiamo detto prima, sono R legati a proteine G, e possono essere sensibili o insensibili alla proteina della pertosse, questo vale per le proteine G inibitorie che sono sensibili alla pertosse e non per le G stimolatorie.

Recettori della somatostatina.

Ci può essere una certa omologia nelle diverse classi di R, ci sono due classi prevalenti che sono la componente SRIF1 e SRIF2. La SRIF1 comprende la 2, la 3 e la 5, mentre la SRIF2 comprende la 1 e la 4, diciamo che la 2, la 3 e la 5 sono quelle più rappresentate nelle diverse patologie.

I geni che codificano per i R della SST sono normalmente senza introni, tranne per il R di tipo 2 che invece ha una variante di splicing 2A e 2B nel ratto, nel topo e nell’uomo. La SST naturale, cioè la 14 e la 28, lega tutti i R con uguale affinità perché è la forma naturale quindi