Endocrinologia Granata parte 3

Lezione 7

L’altra volta avevamo parlato degli ormoni che inibiscono il rilascio del GH, ovvero la somatostatina; oggi invece parliamo di un altro ormone, che si chiama ghrelin, che però ha diverse forme che vedremo, e che invece stimola il rilascio del GH, quindi ha un effetto opposto rispetto alla somatostatina.

Vi ricordate l’asse GH-Igf-1, ossia a livello ipotalamico ci sono degli ormoni che vengono rilasciati, ossia la somatostatina che inibisce il rilascio del GH da parte dell’ipofisi, e invece il GHRH, sempre rilasciato dall’ipotalamo, che stimola il rilascio del GH dall’ipofisi.

Il GH che viene rilasciato dall’ipofisi può avere degli effetti diretti e indiretti: gli effetti diretti sono sul fegato, perché il GH legandosi ai R che si trovano a livello del fegato promuove il rilascio di un altro ormone, ovvero l’Igf-1, che promuove la crescita e la proliferazione cellulare, oppure può avere degli effetti indiretti sui tessuti bersaglio, sono prevalentemente effetti metabolici, e sono effetti opposti rispetto all’Igf-1, infatti il GH induce insulino-resistenza, fa aumentare l’adiposità, quindi ha degli effetti sul metabolismo del glucosio che sono essenzialmente negativi.

Igf-1 ha un effetto di inibizione di feedback negativo sul rilascio di GH, quindi è un sistema di controllo, e oltre a questi ormoni che avete visto adesso sono stati individuati negli anni 70 dei peptidi, che casualmente erano stati individuati mentre si stavano studiando degli altri composti a scopo terapeutico, in particolare dei peptidi che derivavano da sostanze oppioidi che avevano azione simile oppioide, come per esempio la metionina encefalina.

Sono tutti di derivazione sintetica, quindi tutti prodotti chimicamente, che avevano la capacità di stimolare il rilascio del GH, e non si sapeva per quale motivo, quindi erano state scoperte tutte queste sostanze che venivano usate a scopo terapeutico, come per esempio in condizioni di deficit di GH o situazioni in cui era necessario avere un aumento del rilascio di GH.

Questi erano detti GH secretagoghi, ovvero che avevano la capacità di stimolare il rilascio di GH, e i più conosciuti e studiati erano il GHRP2 fra quelli peptidici, e fra quelli non peptidici c’era l’MK-0677, studiato a lungo per queste funzioni.

GHS peptidici e non peptidici

GHS peptidici (GHRPs) GHS non peptidici

• (D-Trp2)-MetEnkephalin 1976
• GHRP-6 1984
• GHRP-1 1991
• Hexarelin 1992 - L-629,429
• GHRP-2 1993
• 1994 - L-692,885
• 1995 - MK-0677
• EP-51389 1996
• Ipamorelin 1998

Adapted from Kojima et al., Physiol Rev 2004

Scoperta del recettore “GH secretagogue receptor (GHS-R)”

Però, nonostante ci fossero questi peptidi, non si sapeva ancora quale fosse il R riconosciuto da queste sostanze. Soltanto successivamente, nel 1996, il gruppo di Howard ha scoperto il cosiddetto R di GH secretagoghi, che è un R simile a quello del GHRH, quindi un R accoppiato a proteine G, che una volta legato da questi peptidi GH secretagoghi era capace di far aumentare i livelli del Ca2+ intracellulare a livello delle cellule dell’ipofisi somatotrope (che rilasciano il GH), e in questo modo attraverso l’aumento del Ca2+ facevano aumentare i livelli e la secrezione del GH.

(Howard et al., Science 1996)

Però c’era un problema in più, nel senso che esisteva un R, ma questo R non aveva un ligando perché questi peptidi che avete visto erano tutti sintetici, quindi se esiste un R nel nostro organismo doveva esserci per forza un ligando naturale che lega questo R.

Per questo motivo ci sono diverse strategie per identificare le molecole e sostanze che possono legare i cosiddetti R orfani, ovvero che il quale non è stato identificato un ligando. Per quanto riguarda i GPCR sono moltissimi ancora quelli orfani, ci sono tanti R che non hanno al momento un ligando, ma in questo caso l’importante era identificare il peptide che legasse questo R, e qual è la strategia per fare questo?

Innanzitutto identificare il R e quindi capire quali sono le cellule che esprimono questo R, ed era stato identificato dal gruppo di Howard che ha clonato ed identificato questo GHS-R. Dopodiché bisogna creare un modello che overesprima questo R, perché se noi facciamo overesprimere una cellula questo R e poi trattiamo queste cellule con una serie di estratti di tessuti cellulari possiamo vedere se c’è una risposta sul secondo messaggero per esempio, trattandosi di un R accoppiato a proteine G.

Quindi noi facciamo overesprimere queste cellule con il R, le trattiamo con degli estratti proteici o tissutali, qualcosa che noi supponiamo che contenga il ligando naturale del R, e vediamo se c’è un aumento del Ca2+ indotto da questi estratti proteici.

In seguito facciamo una purificazione se vediamo che c’è un aumento del secondo messaggero, facciamo una purificazione e da questa, che può essere per cromatografia o utilizzando tecniche più recenti, si può isolare e identificare fra le diverse sostanze quella che lega questo R.

Dopo che è stato isolato si studiano le funzioni del ligando, che cosa fa nelle diverse cellule, l’espressione nei diversi tessuti, e in generale l’approccio quando si individua un nuovo ormone è sempre quello di caratterizzarlo.

Nel caso dei GH secretagoghi si pensava inizialmente che questi estratti o sostanze, che potessero contenere il ligando naturale del GHS-R, si trovassero nell’ipotalamo, perché essendo rilasciato a livello dell’ipotalamo l’ormone e legandosi all’ipofisi per stimolare il GH si era partiti da un estratto ipotalamico.

In realtà facendo tantissimi estratti ipotalamici si era visto che non si otteneva niente, cioè non si riusciva a trovare questo ipotetico ligando.

Successivamente il gruppo giapponese di Kangawa ha pensato poi che questo ipotetico ligando potesse derivare dallo stomaco, perché il R aveva degli effetti simili al R GPR28, e quindi invece di cercare il ligando endogeno nell’ipotalamo l’hanno cercato nello stomaco, ed effettivamente isolando estratti proteici di stomaco e, incubando questi estratti nelle cellule che contenevano questo R, si sono accorti che c’era effettivamente una risposta.

Da qui hanno capito che stranamente questo ormone si trovava nello stomaco, però mancava ancora un pezzo, infatti questo peptide, che loro avevano chiamato ghrelin, da grow crescere, e releasing rilascio, non funzionava sulla stimolazione del GH così com’era, perché mancava ancora un ulteriore pezzo, che era un’addizione del gruppo octanoico di acidi grassi sulla serina 3 di questo peptide.

Questi giapponesi sono invasatissimi, infatti non smettono mai di lavorare, e uno di questi che vedete era il chimico, forse Kojima, che mentre era sul treno ha avuto un’illuminazione, dopo che ci ha pensato non so quanto tempo, ed ha capito c’era questo gruppo octanoico, che ha buttato giù su questo foglietto che vedete, riuscendo quindi ad identificare la forma finale del ligando.

Ghrelin, ligando endogeno naturale del GHS-R

La scoperta di ghrelin è un esempio di farmacologia inversa: identificato prima il recettore (GHS-R), poi il suo ligando (ghrelin).

“ghre,” “grow,”

Ghrelin: da che significa crescere

gh (GH) + relin (releasing) = ghrelin

Good results in research depend partly on luck. Though, it may be hackneyed to profess that good luck in research depends on the researcher's passion, I believe it's true.

Kojima M. The discovery of ghrelin--a personal memory. Regul Pept. 2008 ;145:2-6.

Questo perché soltanto il gruppo octanoico fa in modo che questo peptide possa legarsi al R, senza questo gruppo il peptide non si lega al R e di conseguenza non induce nemmeno la stimolazione del GH.

Quindi è un esempio di farmacologia inversa, perché anziché identificare prima l’ormone e poi il R è stato identificato il R e poi il ligando. Hanno quindi isolato questo ormone ghrelin, ed hanno iniziato a studiare che cosa facesse, e hanno visto che fra le attività principali c’era appunto quella di stimolare la secrezione del GH delle cellule ipofisarie, sia in vitro che in vivo in diversi modelli animali e anche nell’uomo, e si è vista la capacità di grelina di stimolare proprio la sintesi e la secrezione del GH.

Per quanto riguarda l’ACTH e la prolattina, in studi successivi, è stato dimostrato che sono anch’essi stimolati dalla grelina, anche se in quantità inferiori rispetto al GH.

Non è poi finito qui, perché ci si è chiesti successivamente in che modo questo peptide normale venisse attaccato un acido grasso a livello di un aminoacido, e a lungo i chimici hanno studiato come mai c’era questa acidazione. Hanno scoperto solo successivamente, due gruppi di due diverse industrie farmaceutiche, un enzima, che hanno chiamato GOAT (ghrelin O-acyltranferase), che era capace, grazie agli acidi grassi presenti nell’organismo, di promuovere l’acilazione di questo peptide, catalizzando questa reazione per far sì che ci fosse l’acilazione sulla serina 3.

Regolazione del metabolismo energetico

Questa è stata una scoperta importante che poi ha portato a studi successivi per vedere cosa succedeva se si inibiva l’acilazione della grelina, vedendo le conseguenze sulla mancata acilazione.

Adesso vi parlerò della regolazione della fame, perché? Perché la grelina, oltre a stimolare la secrezione del GH, una delle sue principali azioni è quella di stimolare l’assunzione del cibo, cioè è un peptide che induce il senso di fame.

Fa questo sempre attraverso il R dei GH secretagoghi e sempre grazie a questa acilazione che ha sulla serina 3. Esistono delle forme diverse che non hanno l’acilazione, ma che fanno cose diverse, quindi soltanto la grelina acilata è in grado si stimolare la produzione del GH e l’assunzione del cibo.

Qui vedete uno schema sulla regolazione dell’assunzione del cibo: ci sono innanzitutto diversi ormoni rilasciati sia dal tratto gastrointestinale, sia dagli adipociti.

Ghrelin

Come ad esempio la leptina rilasciata dal grasso o l’insulina rilasciata dal pancreas, che inibiscono l’assunzione del cibo.

Colecistochinina

Glucagon-like peptide 1

Morton CJ et al., Nat Rev Neurosc 2014

L’omeostasi energetica è un processo mediante il quale l’organismo mantiene le riserve di grasso regolando l’equilibrio tra l’assunzione ed il consumo dell’energia.

Quindi la leptina per definizione è uno degli ormoni più importanti nella regolazione del cibo perché inibisce la fame. Tutti questi ormoni hanno delle funzioni importanti dipendentemente da quando voi mangiate, perché vengono rilasciate in seguito all’assunzione del cibo, oppure nel caso di ghrelin vengono indotti dalla mancanza del cibo e quindi stimolano la fame.

Ovviamente l’assunzione del cibo induce un senso di sazietà che va ad inibire l’ulteriore assunzione del cibo, e la sazietà andrà anche ad inibire il cosiddetto reward, ossia il senso di appagamento che si ha dal cibo, e quindi vi mancherà la voglia di mangiare ulteriormente se avete appena mangiato.

Ci sono sei segnali a lungo e breve termine che arrivano al SNC da parte del tratto gastrointestinale per dire mangia o non mangiare, e questi sono, per quanto riguarda il segnale a lungo termine, quelli rilasciato dal tessuto adiposo, quindi dalle riserve di grasso, come la leptina, mentre quelli a breve termine possono essere la grelina o altri peptidi come GLP1, che è quell’ormone che a livello del pancreas ha degli effetti positivi sulla secrezione insulinica e regola anche l’assunzione del cibo in senso negativo, quindi la inibisce, e si comporta come la leptina sostanzialmente.

Peptidi gastrointestinali

I peptidi gastrointestinali sono molto importanti per la regolazione dell’assunzione del cibo e per tutta l’omeostasi di tutto l’organismo, agiscono attraverso delle afferenze vagali che arrivano al cervello e trasmettono degli impulsi a livello del cervello.

Questi sono i principali ormoni che vedete nel tratto gastrointestinali, come il GLP1 nel colon, la grelina nello stomaco, il pancreas è uno dei principali organi che produce questi peptidi come l’insulina e il glucagone, e poi il GLP1 è prodotto da diverse componenti del tratto gastrointestinale.

GLP-1, glucagon-like peptide 1

CCK, colecistochininca

GRP, gastrin-releasing peptide

PP, polipeptide pancreatico

NMB, neuromedina B

Cummings DE & Overduin J, J Clin Invest 2007

La cosa interessante è che tutti i peptidi hanno un effetto di inibizione sull’assunzione del cibo e grelina è l’unico che stimola l’assunzione del cibo, quindi è stata una scoperta importante perché nessuno si aspettava di individuare qualcosa che avesse questo ruolo, infatti sul momento quando era stato scoperto questo ormone c’è stato un grandissimo interesse perché poteva essere implicato nello studio dell’obesità e nello studio del comportamento alimentare.

Meccanismi centrali di regolazione dell’appetito

Qua vedete diversi ormoni che possono o stimolare o inibire l’assunzione del cibo: per esempio, la grelina che stimola l’assunzione del cibo viene prodotta dalla stomaco, arriva ai nuclei arcuati dell’ipotalamo nel SNC, agisce attraverso il proprio R su questi neuroni che si chiamano NPY e, stimolando questi neuroni particolari, stimola il rilascio di proteine che agiscono nei nuclei arcuati nell’ipotalamo su altri neuroni per promuovere l’assunzione del cibo, quindi per spostare il bilancio sul food intake.

Invece altri ormoni come la leptina, rilasciata dal tessuto adiposo, il GLP1 rilasciato dal tratto gastrointestinale, o altri come PYY rilasciato dal colon, che agisce inibendo questi nuclei che stimolano la fame bloccando gli effetti dei neuroni che stimolano la fame, e come l’insulina che agiscono stimolando invece quei neuroni che bloccano la fame, quindi hanno un effetto opposto rispetto alla grelina.

Schwartz MW & Morton GJ, Nature 2002

Questi sono i cosiddetti neuroni propiomelanocortinici che fanno sì che vi sia il rilascio dell’ormone melanocortina, che agisce sugli stessi neuroni su cui agiscono quelli stimolati da grelina, inibendo la fame.

Come spesso succede, i neuroni NPY possono a loro volta inibire quelli che bloccano la fame, così come quelli che bloccano la fame possono invece inibire quelli che stimolano la fame, quindi ci sono sempre dei meccanismi di regolazione sullo stimolo della fame.

Quindi, come vi ho detto prima, grelina è stata scoperta per il fatto di avere questa capacità di stimolare l’appetito e l’assunzione del cibo, quindi ci sono diversi peptidi, che sono la grelina rilasciata dalla stomaco, che stimola a livello ipotalamico l’assunzione del cibo e altri come molti ormoni del tessuto adiposo, fra cui la leptina, che invece hanno un effetto opposto.

Fra questi c’è anche l’insulina, che è invece un ormone pancreatico, che ha effetti anch’essa sulla inibizione dell’assunzione del cibo. Ricordiamo anche l’azione incretinica del GLP1, che a livello pancreatico è capace anche, oltre ad avere effetti sulla fame, di promuovere il rilascio dell’insulina e promuovere la sopravvivenza della beta cellula.

Meccanismi di ghrelin nella regolazione ipotalamica dell’appetito

Qui vedete le afferenze vagali, ossia la grelina è in grado si stimolare a livello centrale l’assunzione del cibo, quindi la fame, grazie anche a queste che arrivano al cervello, e quindi comunicano con il SNC dal tratto gastrointestinale.

Quest’ultimo è una zona del nostro corpo interessantissima, perché a suo interno vengono rilasciate tantissime sostanze ed è molto innervata, tant’è che era stato considerato come un secondo sistema nervoso. Ovviamente non lo è perché ha funzioni diverse, però avendo questa innervazione così importante è considerato una zona cruciale del nostro organismo.

α MSH

(melanocortina)

Leptin

(adipocytes)

La grelina è rilasciata dallo stomaco, attraversa la barriera ematoencefalica, entra nell’ipotalamo e stimola i neuroni NPY/AgRP attraverso il legame con il R in; ARC, arcuate nucleus of GHS.

Questi neuroni stimolati, una volta gamma-aminobutyric acid; sferase; MC4R, melanocortin attivati, rilasciano questi peptidi che sono melanocyte-stimulating le NPY/AgRP nei nuclei paraventricolari ide Y; POMC, pro-araventricular nucleus.

Dell’ipotalamo, quindi una zona diversa dell’ipotalamo. Qui di nuovo si legheranno ad un R Briggs and Andrews, Neuroendocrinol 2011 specifico per promuovere il comportamento alimentare, quindi in questo caso l’assunzione del cibo.

Una cosa in più che hanno questi neuroni è la capacità di inibire quelli che invece bloccano l’assunzione del cibo, che si chiamano POMC proopiomelanocortinici, quindi non soltanto la grelina stimola l’assunzione del cibo, ma a bloccare anche l’effetto di altri ormoni come la leptina che invece inibisce l’assunzione del cibo, e lo fa anche attraverso il rilascio del neurotrasmettitore GABA, che legandosi al R blocca l’effetto di questi altri ormoni e quindi è inibito il rilascio della melanocortina e l’effetto sul blocco dell’assunzione del cibo, quindi sul senso di sazietà.

Ghrelin e obesità

Oltre a questi effetti la grelina può anche direttamente arrivare ai nuclei paraventricolari dell’ipotalamo per stimolare i neuroni, quindi può anche bypassare la prima parte, ma questo ulteriore meccanismo in realtà non è stato ancora ben