Concetti Chiave
- Il processo di clonazione del DNA inizia con l'estrazione e il taglio del DNA e dei plasmidi usando enzimi di restrizione, creando frammenti con estremità appiccicose identiche.
- Le cellule batteriche devono essere trattate per raggiungere lo stato di competenza, facilitando l'assorbimento dei plasmidi e inattivando i marcatori selezionabili interni.
- Le cellule che assorbono il plasmide vengono cresciute su un mezzo di coltura solido, formando colonie di batteri con plasmidi vuoti, plasmidi ricombinanti e senza plasmidi.
- I batteri utili con plasmidi ricombinanti vengono distinti mediante l'aggiunta di un antibiotico al terreno di coltura, permettendo solo a quelli con il plasmide di sopravvivere.
- Il gene LacZ può essere utilizzato come marcatore per identificare i batteri utili; la colorazione blu indica l'assenza di plasmidi ricombinanti dopo il taglio del gene.
Qual è il processo di clonazione del DNA?
-DNA ricombinante: Il DNA da clonare viene estratto. Poi si tagliano sia il DNA che i plasmidi con gli stessi enzimi di restrizione. I frammenti di DNA avranno quindi le stremità appiccicose identiche.I frammenti di DNA e i plasmidi vengono miscelati, e le DNA ligasi catalizzeranno la formazione dei legami. Ora avremo sia plasmidi ricombinanti che plasmidi vuoti.
-Preparazione cellule ospitiLe cellule batteriche vengono trattate per facilitare l’entrata nello stato di competenza e quindi l’assorbimento dei plasmidi e per inattivare i marcatori selezionabili normalmente presenti dentro di esse (che altrimenti renderebbero inefficaci quelli plasmidici).
Inserzione e selezione dei plasmidi
-Inserzione dei plasmidi: quando hanno assorbito il plasmide le cellule vengono messe a crescere su un mezzo di coltura solido, formando delle colonie. Avremo batteri che non hanno captato il plasmide, batteri col plasmide vuoto, batteri con plasmidi ricombinanti.
-Distinzione delle cellule utili: I batteri utili sono quelli con i plasmidi ricombinanti, che quindi devono essere distinti grazie ai marcatori selezionabili, questo avviene aggiungendo un antibiotico al terreno di coltura e solo i batteri con il plasmide possono resistergli. Inoltre può essere utilizzato il gene LacZ, che contiene al suo interno un gene per la pigmentazione blu con dentro il sito di taglio. Se quindi il plasmide viene tagliato e il gene inserito il gene non si esprime più e non vi sarà colorazione blu.
Domande da interrogazione
- Qual è il processo fondamentale per la creazione di DNA ricombinante?
- Come vengono preparate le cellule ospiti per l'assorbimento dei plasmidi?
- Quali metodi vengono utilizzati per distinguere i batteri utili durante la selezione dei plasmidi?
Il processo di creazione di DNA ricombinante prevede l'estrazione del DNA da clonare, il taglio del DNA e dei plasmidi con enzimi di restrizione, e la miscelazione dei frammenti per formare plasmidi ricombinanti grazie all'azione delle DNA ligasi.
Le cellule batteriche vengono trattate per entrare in uno stato di competenza, facilitando così l'assorbimento dei plasmidi e inattivando i marcatori selezionabili presenti in esse, che altrimenti renderebbero inefficaci i plasmidi.
I batteri utili, quelli con plasmidi ricombinanti, vengono distinti attraverso l'aggiunta di un antibiotico al terreno di coltura e utilizzando il gene LacZ, che permette di identificare la presenza del plasmide in base alla colorazione blu, che non si manifesta se il plasmide è stato correttamente inserito.
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