Citologia, embriologia e istologia

Lo studio dell'istologia

L'istologia è vita. Perché? L'istologia infatti si occupa dello studio dei tessuti che sono composti da cellule. Per questo possiamo affermare che citologia e istologia sono strettamente correlate.

Studio delle cellule e dei tessuti

L'istologia si occupa dello:

• Studio delle cellule: la più piccola porzione di materia vivente dotata di vita autonoma. Nel nostro organismo le cellule si trovano in tessuti e in fluidi biologici, come il sangue.
• Studio dei tessuti: porzioni di materia vivente formati da cellule e alcuni anche da matrice extracellulare. Più tessuti danno origine a organi, più organi ad apparati, più apparati a un organismo.

Livelli di organizzazione della materia vivente

La materia vivente si caratterizza per tre fondamentali proprietà:

• Organizzazione secondo un piano strutturale: la materia vivente si presenta sotto forma di organismi (unicellulari o non) dotati di caratteristiche specifiche. Gli organismi viventi e le singole cellule sono delle strutture assai complesse, dove ogni parte dell'organismo e della cellula stessa è legata secondo uno schema ben preciso. La capacità della materia vivente di mantenere determinate caratteristiche costanti è chiamata omeostasi.
• Capacità di adattamento all'ambiente: l'adattabilità è la capacità di interagire con l'ambiente, modificando sia questo che la materia vivente, in modo da garantire lo svolgimento dei processi vitali.
• Capacità di riprodursi: indica la possibilità di dare origine a nuova materia vivente con caratteristiche simili a quella che l'ha prodotta.

Strumenti di studio

Le cellule sono troppo piccole per essere viste a occhio nudo (cellula più grande: ovocita). Occorre quindi impiegare microscopi che aumentano il potere di risoluzione, ovvero viene aumentata la minima distanza tra due punti affinché quest'ultimi possano essere percepiti come separati tra di loro. Per esempio, l'occhio umano riesce a percepire una distanza minima tra due oggetti pari a 100 micron. Invece, il microscopio ottico riesce a percepire una distanza minima di 0,2 micron che rappresenterebbero la millesima parte del mm. Infine, abbiamo anche il microscopio elettronico che ha una risoluzione di 1 nm.

Microscopio ottico

Il microscopio ottico è formato da vari pezzi quali:

• Illuminatore: ovvero da una sorgente di luce. Ormai è incorporato in tutti i microscopi moderni, anche nei più semplici, e la lampada a bassa tensione è regolabile tramite un reostato.
• Diaframma dell'illuminatore: modula l'intensità della luce, regolando l'ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore, in modo tale da controllare la qualità dell'immagine.
• Condensatore: ha la funzione di condensare la luce proveniente dall'illuminatore sul piano del campione. Il condensatore è provvisto di un diaframma ad iride per poter regolare la ampiezza di luce che entra nell'obiettivo.
• Porta preparati o stativo.
• Obiettivo: è un sistema di lenti che danno la prima immagine ingrandita del campione. Sono avvitati su una torretta che ne può contenere fino a 6. Un obiettivo è un sistema di lenti che proietta l'immagine ingrandita ed invertita del campione nel piano focale inferiore dell'oculare, in modo tale che questo possa ingrandirla ulteriormente. La distanza di lavoro di un obiettivo, cioè la distanza della lente frontale dal campione è piuttosto ridotta (da 30 micron a 0,1 mm). Inoltre, potere di ingrandimento e distanza di lavoro sono inversamente proporzionali, quindi maggiore è l'ingrandimento minore sarà la distanza di lavoro dell'obiettivo. Le scritte riportate sulla montatura degli obiettivi ne indicano le caratteristiche. Per esempio, possiamo trovare l'APERTURA OTTICA: cioè indica il potere di risoluzione e quindi anche la sua qualità ottica.

(Il fascio luminoso che parte dal campione diretto all'obiettivo è un cono di luce che ha un'ampiezza pari a 2 alfa. Tale ampiezza dipende dall'indice di rifrazione tra campione e obiettivo.)

Espressione del concetto di risoluzione

A × N = n × sen. Questa espressione indica la massima ampiezza del cono di luce che entra nell'obiettivo. Si può notare come l'A x N sia direttamente proporzionale all'indice di rifrazione n del mezzo posto tra campione e lente dell'obiettivo.

Formula di Abbe

In conclusione, l'AN è un valore che descrive la qualità della lente. Oltre a questo, l'AN ci indica anche qual è l'ingrandimento massimo al quale l'obiettivo può essere usato. Infine, possiamo affermare che l'AN determina il potere di risoluzione secondo la formula di Abbe: R = 0,5 (lunghezza d'onda: AN) Dove R è la risoluzione, ovvero la distanza minima che il sistema ottico riesce a percepire tra due oggetti. E AN indica l'apertura numerica dell'obiettivo.

Gli oculari

L'oculare non solo ingrandisce l'immagine formata dall'obiettivo, ma è in grado di correggere anche alcuni errori (aberrazioni). L'oculare porta inciso un numero sulla montatura che va ad indicare il suo potere di ingrandimento. Questo vale moltiplicato al valore dell'ingrandimento dell'obiettivo dà l'ingrandimento totale. Come si formano le immagini dell'oggetto attraverso le lenti del microscopio ottico? L'oggetto è posto oltre il fuoco della lente dell'obiettivo. Questa forma un'immagine reale ingrandita e capovolta che è situata tra la lente dell'oculare ed il suo fuoco. Dall'immagine capovolta si forma un'altra immagine ingrandita e diritta. Come risultato finale avremmo un'immagine capovolta, virtuale e ingrandita.

Risoluzione definizione

Quando aumento l'ingrandimento, aumento anche la risoluzione e anche la definizione dei particolari.

Differenza tra ingrandimento e potere di risoluzione

La risoluzione determina il livello di dettaglio contenuto nell'immagine. L'ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini.

Altri tipi di microscopi

Microscopio invertito

Chiamato così perché sono stati invertiti i vari pezzi: in alto troviamo la sorgente di luce ed il condensatore. Invece al di sotto del tavolino portaoggetti troviamo gli obiettivi e la torretta. Viene utilizzato principalmente per osservare cellule viventi o organismi al fondo di un grande contenitore. È il microscopio più utilizzato nelle tecniche di micromanipolazione.

Il contrasto di fase

Alcuni microscopi tra cui quello invertito sono dotati del contrasto di fase. Il contrasto di fase è un diaframma scuro posto nel condensatore che lascia passare la luce solo attraverso una corona circolare in modo tale che arriverà un fascio di luce conico vuoto al centro. Quindi il percorso del fascio di luce viene deviato e per questo motivo l'immagine sarà bianco e nera.

Microscopio polarizzatore

Sono presenti 2 prismi: uno detto polarizzatore (posto sotto il condensatore) e l'altro analizzatore (posto tra l'obiettivo e l'oculare). Se i reticoli cristallini dei 2 prismi vengono incrociati, si otterrà un'immagine buia. A questo punto viene fuori il concetto di isotropia e misotropia. L'isotropia rappresenta una zona scura. Invece la misotropia rappresenta una zona chiara. Sono isotrope le sostanze composte da molecole disordinate. Mentre anisotrope quelle sostanze che presentano una struttura ordinata.

Microscopio a fluorescenza

Il campione da analizzare contiene una sostanza che si chiama fluoroforo, la quale può essere già presente nel campione oppure può essere immessa dall'esterno. Tale sostanza viene colpita da un fascio di luce ultravioletta o laser, e di conseguenza emette luce per fluorescenza. La luce ultravioletta viene fermata prima di arrivare all'oculare, da un apposito filtro di sbarramento, così che all'occhio arrivano solo i raggi luminosi emessi per fluorescenza.

Microscopio confocale

Si differenzia da quello a fluorescenza per:

• La presenza di una sorgente luminosa laser che aiuta a migliorare la qualità delle immagini.
• La presenza di un sistema ottico ed elettronico che permette di scandire l'intera superficie, aumentando così la risoluzione. Per fare questo si utilizzano due pinhole ovvero due piccoli fori focalizzati sullo stesso piano, cioè confocali tra loro.

Metodi alternativi alla microscopia focale:

• Tecnica di convoluzione: trattamento dell'immagine di fluorescenza attraverso metodi matematici di convoluzione.
• Tecnica del multiphoton: simile a quello a fluorescenza solo che il laser eccita il fluorocromo solo nel punto di fuoco.

Microscopio a 2 fotoni

Utilizza un laser per eccitare molecole fluorescenti in un campione e opportuni rilevatori per misurare la luce emessa. I laser utilizzati in questo tipo di microscopio sfruttano l'assorbimento simultaneo di due fotoni nell'infrarosso.

Microscopio elettronico a trasmissione

Intorno agli anni '50 la scienza avvertì la necessità di migliorare la risoluzione. Perché ciò permetteva lo studio di malattie diverse, ancora non identificate. Aumentando la risoluzione si è arrivati a vedere il particolare di una singola cellula. Ciò comporta una nuova comprensione di un meccanismo antico. Ha un'organizzazione diversa: i protagonisti della sorgente luminosa sono gli elettroni. Gli elettroni a questo punto vengono inviati a una grande velocità in un tubo sottovuoto alle cui estremità ci sono un anodo e un catodo.

Microscopio elettronico a scansione

Ricorda quello confocale perché scandisce l'intera superficie della cellula invece di entrare nella struttura interna.

Differenze tra microscopi

Risoluzione:

• Microscopio ottico: 0,1 micron.
• Microscopio elettronico a scansione: 1 nm.
• Microscopio elettronico a trasmissione: 0,2 nm.

Microscopia a forza atomica

Riproducono la topografia superficiale del campione sotto esame con una risoluzione sub-nanometrica.

Microscopia ad alta risoluzione

Con questo tipo di microscopia è possibile vedere microrganismi con dimensioni microscopiche. Infatti, questo microscopio ha una risoluzione di 100 nm.

Studio della materia vivente

Le tappe principali dell'allestimento di un preparato microscopico sono la fissazione, la sezione e la colorazione.

• Fissazione: consiste in un trattamento che va a stabilizzare la sostanza vivente in condizioni più simili possibile a quelle dello stato vivente, in modo da bloccare le alterazioni post-mortali. Il fissativo più utilizzato è la formalina, ovvero formaldeide in soluzione acquosa del 40%.
• Sezione: permette di rendere il preparato attraversabile dalla luce.
• Colorazione: consiste nella preparazione del preparato con sostanze colorate o opache per il micro elettronico.

I coloranti si dividono in acidi e basici. Gli acidi sono quei coloranti in cui la parte che si attacca al tessuto conferendogli colore è un anione (carica elettrica negativa). Invece, basici sono quei coloranti in cui la parte responsabile della colorazione è un catione (carica positiva). Si parla di basofilia per indicare l'affinità di un tessuto per i coloranti basici. Si parla di acidofilia per indicare l'affinità di un tessuto verso un colorante acido. Per definizione si definisce il nucleo di una cellula basofilo, invece il citoplasma viene definito acidofilo.

L'azione dei coloranti dipende da:

• L'affinità chimica tra i vari costituenti del tessuto e dei coloranti.
• La concentrazione di tali costituenti.
• La loro permeabilità.

I coloranti più usati sono:

• Ematossilina: è una sostanza estratta dal legno di per sé incolore. Colora quando si è ossidata ad emateina con l'aggiunta di un mordenzante. Viene anche chiamata lacca metallica o ferrica a seconda del mordenzante usato.
• Eosina: è un colorante basico.

Altre tecniche di colorazione utilizzate

Impregnazione argentica: il preparato viene trattato con dei sali metallici, che precipitano in alcune aree e non in altre. Le tecniche che si basano su questo principio si chiamano precipitazioni. Se il substrato organico è affine ai sali di argento, questi si legano con il substrato. Se in seguito a tale legame, il preparato viene trattato con una sostanza riducente, dal sale si libera argento metallico. Camillo Golgi ideò un metodo che consente l'identificazione del neurone.

Cajal: Frammenti di un tessuto dopo fissazione vengono trattati con una soluzione di nitrato di argento e poi trattati con un agente riducente. Questo metodo rende visibile anche parti molto piccole.

Reazione per lipidi

I lipidi possono essere sezionati attraverso tecniche come il criostato o con il microtomo. In tali sezioni, i lipidi vengono evidenziati mediante coloranti liposolubili come il rosso Congo o il Sudan III.

Reazione per i polisaccaridi

Gli zuccheri possono essere identificati attraverso la reazione di PAS: i gruppi ossidrili sono ossidati dall'acido periodico con la formazione di gruppi aldeidici. Il reattivo di Schiff, che è incolore, reagisce con questi ultimi cambiando il suo colore in rosso-magenta.

Istochimica: metacromasia

È il fenomeno per cui alcuni tessuti assumono una colorazione diversa da quella dei coloranti. Per esempio, il blu di toluidina da blu passa ad essere violetto. Ciò è in relazione alla disposizione e al numero di radicali anionici che sporgono sul contorno delle molecole degli stessi (in virtù del fatto che la carica anionica presente nel tessuto è estremamente elevata).

DNA

Franklin aveva partecipato attivamente agli studi di Watson e Crick. Anche se il suo contributo non venne mai riconosciuto. Nel 1953 si ha il modello ad elica del DNA.

Reazione FOILLEN: Il DNA è in grado di legare il reattivo Schiff formando un composto colorato dopo una leggera idrolisi ottenuta con HCL. Questa idrolisi separa le basi azotate dallo zucchero il cui gruppo aldeidico può reagire con il reattivo di Schiff.

Istochimica degli acidi nucleici

Alcune sostanze fluorescenti colorano il DNA legandosi alle coppie di basi A, T; G, C. Tra i fluorocromi A, T specifici più utilizzati sono la quinacrina e il DAPI. Invece, la Cromomicina per la G e C.

Citochimica

È l'insieme di tecniche che sfruttano il legame specifico tra ligando e un sito di legame per dimostrare quest'ultimo.

Ligando: molecola estranea ad un compartimento della materia vivente, è capace di legarsi ad una molecola di tale comportamento.

Sito di legame: molecola di un compartimento della materia vivente capace di legarsi specificamente a un ligando.

Sito di legame e ligando sono legati da una serie di legami deboli, efficaci poiché sono numerosi e avvengono tra due superfici congruenti.

Citochimica di affinità

Tale metodica fa utilizzo di specifiche lectine coniugate con un opportuno marcatore consentendo così la localizzazione delle glicoproteine.

Immunoistochimica

È quella branca dell'istochimica che si avvale delle reazioni tra antigene e un anticorpo. L'anticorpo è una sostanza secreta da vari tipi cellulari in grado di legarsi con una sostanza estranea chiamata antigene. Questo legame può essere visibile attraverso le tecniche della citochimica. Ogni antigene possiede più siti specifici chiamati epitopi. Un anticorpo invece è dotato di un sito modificabile ovvero una porzione capace di legarsi all'antigene e da una porzione costante. La reazione di un antigene e di un anticorpo avviene grazie a legami deboli ma efficaci perché sono numerosi.

Immunofluorescenza

Mediante l'uso di anticorpi marcati con sostanze fluo è possibile mettere in evidenza gli antigeni. Esistono 2 metodi:

• Metodo diretto che usa soltanto l'anticorpo primario marcato con una sostanza fluorescente.
• Metodo indiretto lega all'anticorpo primario una o più molecole di anticorpo secondario marcato da una sostanza fluo.

Analisi di immagine

Consente di calcolare partendo da un'immagine simile a quella del nostro sistema visivo, parametri come forma, taglia, numero e densità ottica. Consiste nella manipolazione ed analisi di info scientifiche rappresentate come immagini.

L'ibridazione in situ

Consente la localizzazione di sequenze di DNA o RNA nei tessuti o nelle cellule. L'ibridazione in situ si basa sul principio di complementarietà tra le basi azotate che sono in grado di appaiarsi tra loro in condizioni particolari. La marcatura di una delle due sequenze permette la localizzazione della sequenza bersaglio a cui essa si appaia.

La cellula

La sostanza vivente costitutiva delle cellule prende il nome di protoplasma. La cellula è circoscritta in superficie dalla membrana plasmatica la quale regola gli scambi con l'ambiente esterno separa la cellula dall'ambiente esterno. Inoltre, la cellula risulta essere formata anche da un citoplasma e da un nucleo.

Il citoplasma si presenta costituito da una fase otticamente omogenea, lo ialoplasma e da alcune strutture visibili al microscopio chiamate differenziazioni citoplasmatiche a loro volta suddivise in organuli e inclusi. Il citoplasma contiene anche il citoscheletro, ovvero un sistema di strutture filamentose che regola la forma e permette la mobilità della cellula.

Gli organuli (apparato del Golgi, lisosomi, mitocondri, reticolo endoplasmatico, ribosomi) sono componenti presenti in ogni cellula e svolgono specifiche funzioni essenziali per tutte le cellule. Gli inclusi invece sono accumuli di prodotti cellulari metabolicamente inerti e caratteristici solo di alcune cellule.