Chimica tossicologica parte 1

Laboratorio di analisi chimico-tossicologica

Laboratorio di analisi chimico-tossicologica = laboratorio con sistema digestione qualità UNI EN 9001:2008 certificato da Certiquality. SOP qualità = procedure operative standard per avere un processo generale di qualità.

La qualità a volte significa burocrazia, ma anche un controllo maggiore del laboratorio. Per ottenere la certificazione serve una preparazione con i collaboratori interni, poi serve un'analisi con esperti di certificazione interna e poi si viene sottoposti a un sistema digestione qualità => ispettore che evidenzia come si lavora in lab.

Laboratori che lavorano in GLP (devono essere certificati dal ministero). È una chimica tossicologica di tipo forense.

Materiali analizzati in laboratorio

In laboratorio si lavora su due tipi di materiale:

Materiale biologico: analisi di

• Reperti da vivente: sangue (plasma-siero), urina, capelli, peli, saliva → tossicologia analitica comportamentale.
• Reperti autoptici: sangue, urina e tessuti → tossicologia analitica post-mortem: se si ha un caso di morte senza giustificazione, bisogna capire post-mortem la causa e interviene la polizia giudiziaria (PG)/carabinieri, che avvisano il sostituto di turno del procuratore capo (in televisione di solito parlano i procuratori).

In tribunale, per legge, si deve sempre agire con un procedimento penale quando ci sono i fatti che lo reclamano. Il magistrato decide se trasferire il cadavere in sala anatomica (negli ospedali attrezzati o in obitorio, autopsia giudiziaria, che lavora con la medicina legale) = Si può decidere di fare anche diagnostica, l'autopsia di solito in ospedale per capire come mai una terapia non ha avuto il suo esito etc => non interviene il magistrato, né la giustizia.

Quando si fa l'autopsia il medico guarda se ci sono fori da proiettili, buchi da ago etc; quando poi si apre il cadavere (es. si apre la calotta cranica e si vede che c'è un'intensa emorragia, per cui si può dire che c'è stato un ictus) si può risolvere più velocemente la diagnosi di causa di morte, che è quella che interessa al magistrato: i mezzi che l'hanno prodotta e il tempo (quando è morto); interessano al magistrato anche l'anamnesi e le analisi di tipo istologico: si preparano i tessuti, che saranno poi analizzati al microscopio per capire la causa della morte.

Ci può essere però il caso in cui il magistrato vuole sapere se il corpo è entrato in contatto con il p.a. (= farmaco, che insieme agli eccipienti dà il medicinale, che è quello che viene assunto); le sostanze assunte possono essere state assunte a dosi terapeutiche, oppure in dosi massicce per cui si ha intossicazione acuta letale (= avvelenamento), che fa parte di una criteriologia importante per il medico legale per capire la causa di morte; è sempre il medico però che stabilisce la causa di morte! Il chimico tossicologo può intervenire in tutti i casi per capire che situazione si è creata e se non si fa nell'immediatezza del fatto non ha ragione di esistere.

Materiale non biologico: analisi di farmaci, medicinali, preparazioni galeniche, nutraceutiche, integratori alimentari e droghe da strada.

Analisi post-mortem

Nel caso del post-mortem i tessuti che possono essere analizzati sono tutti, basta avere un campione omogeneo; di solito però si prende nel tronco encefalico perché si ha una maggior conc. delle sostanze, si prende il fegato perché è il centro di metabolismo e quindi qui si ha una conc. maggiore delle sostanze, il rene (che dice se una sostanza è in fase di eliminazione), urina che, se è presente nella vescica del cadavere, avvantaggia ed è importante perché si possono fare degli screening di tipo selettivo con tecniche immuno-enzimatiche, per andare a vedere una categoria di sostanze (cocaina + impurezze, oppioidi, THC).

Successivamente si fa un'analisi di tipo specifico = determinare una sola sostanza (morfina, cocaina etc.) => servono strumenti per fare un'analisi accurata e specifica sulla sostanza. NB: per selettivo e specifico può bocciare!

Anche il polmone può essere importante ma solo quando si sospetta che il cadavere abbia assunto sostanze volatili; stessa cosa per la milza, che si prende quando non si ha il sangue (cadavere bruciato). Lo stomaco non significa nulla perché quando viene prelevato è un sacchetto di 10 cm => viene prelevato solo se serve sapere il contenuto (ad es. alcol etilico: 1,5 è il limite massimo!; a volte si può trovare qualche compressa e quindi può essere vantaggioso). Dallo stomaco si può vedere se la sostanza è in fase di assorbimento.

Farmacocinetica e matrici biologiche

La farmacocinetica si fa solo sul sangue! L'urina dice solo se la sostanza è stata assunta e quindi vale per coloro che ad esempio fanno i piloti, che non devono assumere sostanze); è però il sangue che dà idea se il soggetto era sotto l'effetto di una sostanza (si guardano i livelli nel sangue); poi ci si confronta con la letteratura per capire la PK di una certa sostanza: se si fa la via endovenosa il p.a. deve essere solubile in acqua, ma non tutti i p.a. possono essere solubili in acqua e iniettati; per essere solubilizzati spesso si fanno i sali cloridrati. Se la via endovena non si può fare si usano le compresse, ma si usano anche le supposte, le pomate.

Per studiare una PK e lo si fa su un farmaco iniettato e.v., si deve fare uno studio a breve tempo dalla somministrazione perché il picco max si ha subito, si devono fare più prelievi nel tempo. L'eroina ad esempio sparisce subito dal circolo.

Se il farmaco è somministrato per o.s. la cinetica è più lenta; la parete dello stomaco è utile perché fa una selezione delle sostanze e il pH è acido. Se non si ha lo stomaco (gastro-resecati) la sostanza passa subito in circolo perché l'intestino (che ha pH basico > 7) è molto meno selettivo e fa passare tutto.

Altro liquido che si può prelevare è la bile (è sempre un'analisi post-mortem): qui si accumulano le sostanze che vengono assunte nel tempo: si capisce se il soggetto assume costantemente la sostanza (non serve quindi in acuto) perché si ritrovano i metaboliti.

Sangue, plasma e siero

Sangue: nelle provette dei prelievi ci può essere un anticoagulante (EDTA, citrato, eparina) e si capisce in base ai colori. In questa maniera è più facile fare le analisi perché se si ha un anticoagulante, quando si centrifuga si ha una separazione della parte corpuscolata (sottostante) e si lavora solo sul plasma (sovrastante). Si fanno poi analisi immuno-chimiche ed immuno-enzimatiche.

Il siero ha un colore diverso perché ha un contenuto corpuscolare minore ed è più trasparente, per cui si possono applicare le tecniche immuno-enzimatiche.

NB: nel post-mortem il sangue è emolisato (la parte corpuscolata) e quindi è già in parte coagulato ed è più difficoltoso da analizzare (non si possono mettere anticoagulanti) e non si possono usare metodi immuno-chimici ed enzimatici.

Tra sangue, plasma e siero si ha una diversità enorme perché il farmaco che si va a studiare può essere legato alla parte corpuscolata in maniera maggiore rispetto a quella liquida => quando si studia un farmaco nuovo, si centrifuga il sangue e si va a vedere come si distribuisce il farmaco (se ha legami con la parte corpuscolare, si sottrae una quantità al plasma). Il plasma è quello che di solito contiene la maggior parte della sostanza. Plasma e siero sono più facili da analizzare perché più trasparenti.

Altra cosa importante sono i volumi: se si hanno 10 mL di sangue, quelli di plasma sono 5 mL (di solito è la metà). In genere si prelevano 4 mL di sangue, in cui è contenuto 1 mL di siero. Con le tecniche di oggi non servono grossi volumi, ma quando le tecniche non erano selettive e sensibili come oggi, si aumentava la matrice biologica per aumentare la conc. di sostanza da analizzare, ma aumentano in questo modo anche gli interferenti, che possono incidere sulla qualità dell'analisi.

Di solito come base in lab si analizzano sangue, urina e bile.

Tossicologia comportamentale

Nel comportamentale è importante un po' tutto e le analisi che sono condotte oggi sono spesso in medicina del lavoro sono innanzitutto l'urina, per capire se il soggetto ha assunto sostanze stupefacenti.

Anche persone sottoposte ad un SERT (piani per chi viene beccato con stupefacenti/sostanze o per chi deve fare la terapia della dissuasione) vengono periodicamente monitorate con esame delle urine.

Quando si assume un medicinale, nelle 24 h la conc. si azzera, se si fanno somministrazioni ripetute, la conc. raggiunge uno steady-state. È importante controllare anche il livello 0 per capire quanto ci mette una sostanza ad essere eliminata.

L'effetto di una sostanza dipende dalla sostanza, dalla dose assunta e dalla persona: se una persona assume una sostanza costantemente, si può trovare nelle urine anche 24 giorni dopo! La sostanza diffonde infatti in tutti i tessuti dell'organismo e quindi ci vuole molto tempo per eliminarla (la coca per uno che la assume costantemente si può trovare anche 6 mesi dopo!)

I fluidi corporei, che sono il 98% del corpo, partecipano all'assorbimento.

Il prelievo del sangue in Italia viene considerato un atto invasivo e serve il consenso della persona, per cui non viene prelevata quasi mai. Per l'esame delle urine serve comunque un medico/infermiere che controlla il soggetto mentre urina. I volumi di urina non sono per forza elevati, ma dipendono dall'acqua che si assume, dal tipo di alimentazione e anche da come funzionano i reni.

Però si usa il sangue per la PK perché ha un volume costante di 5 L. (NB: dire "millilitri" scrivere mL). Per poter partecipare alle autopsie giudiziarie serve un'autorizzazione del giudice; ce ne sono alcune in cui è il giudice a decidere il medico legale che effettua l'autopsia, in altri casi invece diagnostiche la fa un medico legale qualsiasi. Per quelle invece ci si riferisce all'anatomopatologo.

Il siero si ottiene dal sangue che non è stato trattato.

Diversità tra sangue e urina per capire lo stato del soggetto

• Urina serve per capire se il sogg. ha assunto una sostanza nei giorni precedenti. Per il prelievo serve un addetto qualificato e i volumi variano in base al soggetto.
• Sangue serve per capire la PK ed è importante perché ha un volume abbastanza costante. Per capire come la sostanza viene assorbita, si devono fare più prelievi nel tempo. L'effetto delle sostanze si va a vedere nel sangue. Si deve però fare un prelievo al tempo 0, tempo in cui la sostanza non è ancora stata somministrata.

Non è semplice però generalizzare, ogni soggetto è a sé.

Nelle autopsie lo scopo principale è capire la causa e i tempi di morte. Su questo interviene il medico, ma sul comportamentale interviene qualcos'altro (ognuno può assumere la sostanza in modo diverso, i tempi di sopravvivenza sono diversi e non si può mai sapere quale sia la quantità assunta).

NB: una maggior quantità di materiale aumenta la sensibilità del metodo, ma con le metodiche odierne convengono volumi minori perché le matrici complesse sono e quindi contengono anche sostanze interferenti di tipo generale (esteri, lipidi) che possono interferire con la sensibilità dell'analisi. Si deve però adottare sempre un metodo sensibile per quella sostanza.

Esempio di Cocaina e Mepivacaina (anestetico locale): l'ultima può dare interferenza se si usano i metodi di screening iniziali, soprattutto quelli colorimetrici; andando avanti però si devono usare metodi specifici per quella sostanza.

L'urina è una matrice più semplice del sangue perché più facilmente trattabile dal punto di vista chimico, si possono applicare tecniche immuno-complesse (chimiche ed enzimatiche), ma è comunque una matrice complessa. Il doping ad esempio si fa sempre sull'urina. Possono passare anche 3-4 settimane, dipende dalle dosi: ognuno è diverso!

Metodi analitici e standard interno

Su queste matrici (campioni) si applica un metodo, di solito estrattivo, che si rivela poi con metodi analitici: sul sangue, chiamato "bianco" si controlla che non ci siano p.a., e si faranno aggiunte di p.a. graduali.

Nei metodi attuali si aggiunge l'IS (standard interno) => per calcolare la conc. si deve avere una matrice confrontabile e su questa una conc. di p.a. che si va a ricercare è un IS => si fa un rapporto tra le 2 conc. => serve un CSR altrimenti non si può calcolare la conc., in base a cosa si calcola?

Come IS si prende una sostanza strutturalmente simile alla sostanza che si deve cercare (es. Nalorfina per la Morfina; la Codeina già non va bene perché il soggetto potrebbe aver assunto un po' sciroppo per la tosse), non utile a scopo terapeutico e quindi non utilizzata normalmente; facendo i rapporti tra le 2 conc. si possono controllare sia la tecnica analitica che quella strumentale. Quando si fa la retta di calibrazione non si segue quindi l'area della sostanza, ma il rapporto tra le 2 conc. e i picchi che si ottengono hanno 1 area, proporzionale alla quantità di sostanza analizzata.

Diluizione isotopica: quando si cerca la morfina, invece di aggiungere Nalorfina, si aggiunge Morfina deuterata (atomi di H sostituiti da atomi di Deuterio) => cambiano i PM. Si fa lo stesso procedimento, ma il metodo è perfetto, perché le sostanze si comportano esattamente allo stesso modo. Il problema è che si deve usare un detector che distingua le masse => detector di massa (distingue gli ioni delle 2 molecole), perché i picchi altrimenti escono insieme e non si possono distinguere. Nei laboratori della regione si usano tutti i deuterati.

Se si studia la PK si sa già quale sostanza è stata somministrata! Quando invece si deve fare un'analisi qualitativa serve uno standard interno perché l'IS accompagna la sostanza che si va a determinare. Il bianco è una matrice in cui ho verificato che non ci sia p.a. e bisogna controllare anche che lo IS non interferisca => si fa un bianco, una matrice + IS + sostanza nota e si confronta con la nostra incognita.

Analisi generica e mirata

Generica = analisi in cui non si sa che sostanza sia stata assunta ad es. dal cadavere => si deve analizzare tutto => si va a cercare un po' di tutto. I composti che si vanno a cercare sono:

• VOC = composti organici volatili, che non sono i gas (metano, CO²); il metanolo invece è un composto volatile perché a T ambiente è liquido. I VOC si vanno a cercare sul sangue, anche sull'urina, sull'eroina e cocaina sequestrata.
• Sostanze organiche non volatili che possono essere acide/basiche e questo interessa per l'estrazione. I tipi che si usano sono solo la L-L (liquido-liquido: ad una matrice organica liquida ne viene aggiunta un'altra non miscibile, per cui serve sapere se la sostanza è acida o basica, per scegliere il solvente da usare: la base o l'acido devono essere libere per essere estratte); questa si può applicare a tutti i tessuti.
• Estrazione su fase solida: quella con le colonnine (SPE = estrazione su fase solida, la fase solida è la parte in fondo alla colonnina. Può essere una fase inversa -lipofila-, ma può essere anche a scambio ionico). Le colonnine però non possono essere sempre applicate: se si ha un pezzetto di fegato non passa, così come anche il sangue di un cadavere, che è più denso => si può applicare il vuoto sotto, si mette il liquido sopra e il campione passa. Nel caso della L-L il pH è importante, mentre nel caso della fase solida dipende dalla ditta che le ha prodotte e quindi è più semplice e più facilitato. Le colonnine vanno bene per un siero, sangue scoagulato, urina.

Quando si applica la generica si possono analizzare più sostanze, e quindi poi si applica la mirata.

Convalida dei metodi quantitativi

NB: i metodi quantitativi devono essere convalidati e la convalida è un processo molto specifico, lungo: il metodo applicato deve essere specifico e deve avere una retta di calibrazione (confronta le conc. in ascisse con il segnale in ordinate), che serve per vedere anche se la curva va a saturazione quindi non si può più dare calibrazione perché, anche aumentando la conc., il segnale rimane costante.

Il metodo deve essere anche specifico (LOQ = limite di determinazione quantitativo) e si deve avere anche il LOD (= limite di determinazione qualitativa). LOD < LOQ.

Ci possono essere variazioni nei limiti soprattutto quantitativo e si valutano in accuratezza e precisione: l'accuratezza è l'errore che si verifica sempre, la si valuta con la deviazione standard e con il coefficiente di variazione (rapporto tra deviazione standard e valore medio %). Il recupero percentuale è un rapporto tra la quantità di sostanza che trovo e quella che ho aggiunto x 100: se si aggiunge una sostanza alla matrice non si può recuperare il 100%, ma ci sono sempre imprecisioni e quindi bisogna vedere se l'errore è costante; maggiore è il recupero e maggiore è la sensibilità (interessa recuperare sempre di più); importante è che il recupero % sia costante!

NB: in queste analisi vale tanto analisi qualitativa ed è importante saper distinguere un falso positivo da uno negativo. I falsi negativi sono meglio perché se si trova la cocaina in un soggetto e non era vero, questo viene condannato per niente! Per questo servono selettività e specificità nello screening.

Cut-off = livelli di soglia, stabiliti per tutti i laboratori che si sono certificati e per non far