Appunti Chimica farmaceutica e tossicologica 1

Caratteristiche della meticillina

La meticillina, differentemente dalla penicillina G, possiede un gruppo molto ingombrante direttamente legato all’azoto ammidico, con i due metossili a impedire ulteriormente la libera rotazione dell’interno sostituente attorno al legame tra il carbonio fenilico e quello ammidico; nella benzilpenicillina invece, i legami sono NH-CO-CH-FENILE e qui già notiamo che è presente un CH, fra l’ammide e il fenile, che non porta alcun sostituente.

La differenza fra le due molecole quindi dipende dall’ingombro e dalla flessibilità: il CH, essendo un legame semplice, permette la rotazione attorno a quel legame e quindi anche la flessibilità della benzilpenicillina che riesce ad adattarsi al sito attivo dell’enzima. La meticillina invece non permette questa rotazione poiché risulta essere una molecola rigida, perciò incapace di adattarsi al sito attivo, e perciò non trova la possibilità di essere degradata.

La meticillina, però, è sensibile agli acidi, perciò viene somministrata per via intramuscolare o per via endovenosa; inoltre, è caduta in disuso a causa delle numerose nuove resistenze sviluppate dai batteri. Nulla però ha impedito che divenisse stimolo e modello per nuove e varie molecole, alcune delle quali sono state sopra rappresentate, che conservano sempre il principio del sostituente ingombrante legato direttamente al carbonile e che perciò conferisce rigidezza alla molecola.

Penicilline ad ampio spettro

Un altro problema incontrato nel processo di drug discovery delle penicilline riguardava la differenza tra le membrane dei batteri GRAM + e GRAM -, difatti molte penicilline, tra cui la benzilpenicillina, risultavano attive solo nei confronti dei batteri GRAM +, ma per niente nei confronti di quelli GRAM -, che sono responsabili di importanti infezioni.

Per cui l’ultimo gradino nel miglioramento delle penicilline è stato quello di individuare delle penicilline ad ampio spettro, che ora rappresentano dei farmaci molto importanti. I due lead della classe sono l’ampicillina e la carbenicillina, semplici derivati della benzilpenicillina a cui sono stati aggiunti due gruppi molto molto polari e ionizzabili. Il bersaglio molecolare delle penicilline è nello spazio periplasmico, quindi i farmaci, per riuscire ad inibire la transpeptidasi, devono riuscire ad arrivare proprio in quel distretto.

Per i GRAM + pare che lo strato di peptidoglicano sia abbastanza permeabile alle penicilline, le quali arrivano abbastanza velocemente al loro bersaglio molecolare. Nei batteri GRAM -, oltre al peptidoglicano, c’è anche la membrana lipofila che rappresenta un ostacolo al passaggio delle classiche penicilline. Nonostante sia molto lipofila, la membrana dei GRAM - è attraversata da numerose porine, ovvero proteine che permettono il passaggio di molecole con una certa idrofilia (presenti fisiologicamente per i nutrienti).

Quindi quello che si concluse è che le prime penicilline a spettro limitato sono sì idrofile, ma non sufficientemente da poter sfruttare le porine per attraversare la membrana esterna dei GRAM- e arrivare al peptidoglicano e poi allo spazio periplasmico. Invece le penicilline ad ampio spettro, a seguito dell’aggiunta di quell’ulteriore gruppo ionizzabile (c’è un NH alifatico e un COOH che saranno assolutamente ionizzati: NH₃⁺ e COO^-), diventeranno molecole zwitterioniche, che presentano, perciò, sia una carica negativa che una carica positiva. Saranno per questo molto idrofile e in grado di sfruttare le porine per il passaggio lungo la membrana.

Modifiche e derivati delle penicilline

Entrambi questi lead sono stati ingentemente modificati per avere penicilline sempre più potenti. Alcuni tra i derivati sono semplicemente dei profarmaci, sviluppati per favorire l’assorbimento di queste molecole così altamente polari.

Alcuni sono riportati di seguito: essi sono tutti resistenti agli acidi, esempi di derivati dell’ampicillina ma labili alle β-lattamasi:

• Sono più che altro dei profarmaci, ovvero farmaci temporaneamente modificati in maniera da favorire la farmacocinetica.
• Ci sono svariati farmaci dell’ampicillina, ma noi ne guardiamo uno solo, ovvero la bacampicillina, che non è altro che l’ampicillina nella quale il carbossile in 3 è stato esterificato con un frammento particolare che lo rende più lipofilo in modo da favorire l’assorbimento.
• Il problema è che in vivo l’organismo deve essere in grado di liberare quella funzione carbossilica in modo tale che il farmaco vero e proprio sia in grado di agire: viene prima idrolizzato l’estere terminale e si forma un COOH, poi decarbossila perdendo CO₂ e libera l’alcol primario dopodiché, per una sorta di dealchilazione ossidativa, va via CCO in forma di acetaldeide lasciando libero l’OH del COOH. Per cui sono tre step degradativi che liberano quel complicato frammento che esterifica il carbossile in 3.

Derivati della carbenicillina

Ci sono altre due molecole importanti che sono piperacillina, aziocillina e mezlocillina che sono tre molecole funzionalizzate sull’azoto presente in posizione 2 dell’ampicillina, ma anche sul fenile poiché sparisce l’OH. Nel caso della piperacillina l’NH è funzionalizzato con una piperazina con due carbolini, quindi con una diisso-piperazina (o piperazin-di-one), mentre nelle altre due siamo di fronte di nuovo ad un anello con due atomi di azoto, ma in questo caso si tratta di una imidazolidina (completamente saturata) con un carbonile, perciò un imidazolidione (oppure oxo-imidazolidina). Sono molecole molto simili che hanno una caratteristica strutturale che a volte viene esaltata nel nome, vengono infatti chiamate ureidopenicilline perché hanno il frammento ureidico.

Un’altra cosa importante che accomuna queste tre molecole, e che concorre ad un’altra definizione ancora, è il fatto che queste, come pochi altri antibiotici anche efficaci nei confronti dei batteri GRAM -, sono efficaci nei confronti di un particolare batterio la Pseudomonas aeruginosa e in virtù di questo vengono chiamate penicilline anti-pseudomonasiche. Nella loro SAR si evidenzia facilmente la particolarità dell’avere in catena laterale sostituenti ingombranti, ma idrofili, cosa molto rara perché di norma i gruppi grossi sono lipofili. Non è comunque ancora chiaro come agiscano.

Amoxicillina e la formulazione Augmentin

Infine, merita una nota a sé l’amoxicillina, farmaco molto potente, gastro-resistente e ad ampio spettro, ma sensibile alle β-lattamasi; la formulazione nota come Augmentin non è altro che amoxicillina accompagnata da acido clavulanico, composto appartenente al gruppo degli inibitori suicida delle β-lattamasi, alle quali si lega covalentemente inattivandole in maniera irreversibile.

Derivati della carbenicillina

I derivati della carbenicillina (anche lei è attiva contro pseudomonas), al contrario sono sensibili agli acidi, ma resistenti alle β-lattamasi. Essa, infatti, contiene un frammento che, in catalisi acida, si decarbossila facilmente, liberando nient’altro che la benzilpenicillina, quindi un farmaco non più ad ampio spettro. Le modificazioni a partire da questo lead hanno provveduto proprio a proteggere tale gruppo carbossilico; fra i derivati della carbenicillina ritroviamo la carindacillina, essa è un profarmaco il cui carbossile è stato esterificato per neutralizzare l’idrofilia del COOH al momento farmacocinetico dell’assorbimento (favorisce l’assorbimento) e per aumentare la lipofilia della molecola. Inoltre l’esterificazione del carbossile, come abbiamo appena detto, ha una funzione di protezione dall’azione dell’ambiente acido dello stomaco e quindi risulta irrinunciabile ai fini del mantenimento dell’integrità della molecola (carbossile esterificato con un frammento 2,3-diidroindenilico, da cui prende il nome la molecola).

Altri derivati: Suncillina e Ticarcillina

Gli altri due derivati, suncillina e ticarcillina, sono dei bioisosteri e sono stati progettati sostituendo, rispettivamente, il carbossile (COOH) con SO₃H e il fenile con un tiofene.

I bioisosteri

Parliamo dell’inizio del ‘900 quando i chimici si interessavano di cose come punto di fusione, punto di ebollizione, indice di rifrazione, densità ecc. Qualcuno si accorse che certe piccole molecole, certi atomi, che contenevano particolari gruppi, avevano delle proprietà simili e guardando queste molecole con attenzione qualcuno provò a trovare una regola in questa somiglianza di proprietà. Grimm propose che si potesse dire che hanno proprietà chimico-fisiche simili gruppi di molecole/funzioni che hanno lo stesso numero di elettroni di valenza.

Prendiamo la prima riga, spostiamola di sotto di un passo a destra poi a ciascun atomo aggiungiamo un H, ripetiamo con questa riga quindi la prendiamo, la spostiamo di sotto di un altro passo a destra e aggiungiamo di nuovo un H ottenendo, quindi CH₂, NH₂ e OH, e così via, seguendo quella che è chiamata regola dello spostamento dello ione idruro, fino ad arrivare a CH₄. Grimm disse che molecole che hanno questi gruppi hanno qualche proprietà simile e si chiamano isosteri.

Il punto è che i gruppi isosteri sono gruppi che, pur nella loro differenza formale, se sono presenti nelle molecole è facile che donino ad esse caratteristiche simili. Più avanti qualcuno si accorse che fra le proprietà simili degli isosteri ci poteva anche essere l’attività biologica. Questa idea, che i gruppi simili in molecole diverse mantenessero lo stesso tipo di attività biologica, fu proposta come modo per modificare molecole di farmaci o per trovarne di nuovi e quindi fu coniato il termine di bioisosteri, ovverosia funzioni/molecole che sono isosteri (quindi che sono simili) e hanno anche la stessa/simile attività biologica.

Più avanti si cercò di raffinare questa definizione, fino ad arrivare ad oggi dove i bioisosteri sono identificati come gruppi o molecole che hanno analogie chimiche e fisiche e che producono effetti biologici simili (es. le penicilline viste prime hanno due gruppi acidi, benzene e tiofene sono entrambe aromatici/planari/hanno la stessa area ecc), ovverosia sono bioisosteri quando due molecole che li contengono hanno lo stesso tipo di attività, anche se oggi, con più precisione, diremmo che sono riconosciuti dallo stesso bersaglio molecolare poiché in grado di orientare nello stesso modo due frammenti della molecola, stessa cosa per bioisosteri come NH₃ e CH₃ che sono due gruppi sp³ che orientano tre frammenti a loro legati nella stessa zona dello spazio. Più sottile può essere il ragionamento con gruppi come COOH, SO₂NH₂ e tetrazolo che sono tre gruppi acidi e quindi, se noi abbiamo una molecola tipo la carbenicillina e, al posto del COOH, mettiamo uno di questi due gruppi rimane comunque un frammento acido e se quello che serve alla molecola è un aumento di idrofilia, che questo sia dato dal COOH o uno di questi altri gruppi, è uguale perché le molecole sono simili e sono bioisostere.

Moltissimi derivati di farmaci sono bioisosteri fra di loro e molto spesso sono i cosiddetti farmaci “MeToo” ovvero un termine che connota quelle molecole che sono formalmente diverse, ma che in realtà non sono altro che delle copie di altre molecole. Per esempio, i primi due farmaci della slide sono due farmaci antidepressivi triciclici, forse non più in uso, che differiscono solo per l’atomo all’interno del ciclo centrale: la desipramina ha un N, la protriptilina ha un CH per cui sono la stessa molecola, ma sono stati brevettati da due aziende farmaceutiche differenti. Di sulfamidici ne sono stati fatti decine e decine, in cui varia solo l’eterociclo a 5 o 6 attaccato alla solfonammide che è la parte importante per l’attività. Stesso discorso vale per l’indometacina e il sulindac, che sono due antinfiammatori non steroidei nei quali la bioisosteria è dovuta in uno per un legame ammidico, nell’altro per un doppio legame in questo caso è stata scoperta prima l’indometacina poi, quando si pensò di capire che la conformazione di questa ammide era «cis» con i due fenili dalla stessa parte, allora si progettò il sulindac con un doppio legame a bloccare l’orientazione dei due fenili; queste due molecole, considerando la conformazione Z e la conformazione cis dell’altra, sono due bioisosteri che mantengono la forma complessiva della molecola.

Infine, gli esempi da cui siamo partiti per cui carbenecillina a cui è stato inserito un tiofene al posto del fenile, per formare la ticarcillina, oppure un SO₃H al posto di COOH per ottenere la suncillina (SO₃H simile al COOH perché entrambe sono acidi abbastanza forti – il tiofene è simile al benzene poiché entrambe sono aromatici/più o meno grandi uguali/planari/elettroni p).

Processi sintetici

Abbiamo già detto che le penicilline si possono produrre per via biotecnologica nei fermentatori con il mezzo di coltura, l’inoculo del microrganismo produttore con i controlli su pH, agitazione, temperatura e tempo di fermentazione, il microorganismo produce e secernere il metabolita nel mezzo di cultura; si estrae il metabolita ed ecco che in questa maniera possiamo ottenere le penicilline naturali, di cui si utilizza, in ambito clinico, solo la benzilpenicillina.

Al mezzo di coltura può anche essere aggiunto un precursore della catena laterale, cioè un acido che permette di introdurre un frammento acilico che va ad acilare l’NH del 6-APA e che porti determinate caratteristiche alla molecola (es. acido fenossiacetico otteniamo la fenossimetilpenicillina).

Tutte le altre penicilline possono essere facilmente preparate a partire dal lead sintetico 6-APA, il quale è reperibile mediante processi fermentativi o anche di sintesi organica, ad esempio, andando a ritroso dalla penicillina G. Tutte le modificazioni a partire da questo nucleo “naturale” hanno fatto sì che, per la maggior parte dei farmaci prima descritti, non sia più corretta la definizione di “antibiotico”, quanto più quella di “chemioantibiotico”, ad indicare la loro origine semi-sintetica.

Tutte le altre importanti penicilline utilizzate vengono fatte tramite semisintesi ovverosia non si fa altro che reacilare il 6-APA: si acila il gruppo amminico in 6 dell’acido 6-amminopenicillanico con opportuni precursori della catena laterale. Per fare questo si prende l’ammina e la si fa reagire con un derivato attivato dell’acido (R = frammento che voglio introdurre in catena laterale, es. dimetossifenile della meticillina, X = potrebbe essere un cloruro, ma molto spesso vengono utilizzate le anidridi perché sono le più reattive) quindi in genere viene preparata un’anidride RCOX, quindi un’anidride precursore dell’acido della catena laterale, e poi farla reagire con il 6-APA; ovviamente tutto questo viene fatto con gli opportuni accorgimenti, protezioni, ambiente di reazione ecc.

Sintesi di 6-APA da penicilline

L’acido 6-ammino penicillanico si ottiene per demolizione della catena laterale di una qualche penicillina ottenuta per fermentazione, ed ecco a cosa serve, ancora oggi, produrre la benzilpenicillina o la fenossimetilpenicillina per via fermentativa, serve per ottenere un precursore da cui ricaverò il 6-APA che è la molecola importante per fare le penicilline. Questo rappresenta il modo più facile ed economico, e può essere applicato anche per ricavare il 7-APA.

Tramite questa reazione devo riuscire ad eliminare l’acile presente sull’NH in posizione 6; la prima cosa che verrebbe in mente di fare è quella di idrolizzare l’ammide, peccato che l’anello β-lattamico sia sensibile agli acidi e che quindi questa strada non sia percorribile. È necessario passare attraverso una serie di modifiche per consentono la stabilizzazione dell’immina per fare in modo che si possa facilmente idrolizzare:

1. Questo passaggio provvede a proteggere il carbossile in 3 con il trimetilsilanolo dalla successiva reazione. Si sceglie questo gruppo, che è un analogo dell’alcol terzbutilico, poiché è necessario avere un gruppo ingombrato che vada a fare l’estere con l’acido carbossilico e che poi venga facilmente idrolizzato. L’estere che si viene a formare, oltre a proteggere il COOH, va anche a neutralizzare la sua acidità.
2. Il secondo step prevede una clorurazione sostitutiva, realizzata con l’impiego del pentacloruro, del carbonile ammidico che porta alla formazione di un’immina e nello specifico di una cloroimmina.
3. Si esterifica, con una sostituzione nucleofila realizzata con l’impiego di metanolo, il legame C-Cl, attivando l’immina alla successiva idrolisi, bloccando così la tautomeria.
4. Aggiungendo acqua alla miscela contemporaneamente si rimuove la protezione del carbossile in 3 e si idrolizza l’immina liberando l’amminogruppo in 6 dalla catena laterale: abbiamo la metossi-immina, l’acqua attacca il C che porta il metossile, avviene un’idrolisi che fa sì che il doppio legame sposti i suoi elettroni sull’azoto che poi va a prendere l’H che si è liberato dall’acqua. In questo modo formiamo l’NH dell’azoto in 6 e il legame singolo con l’intermedio quaternario; a questo punto abbiamo un’α-idrossilammina che riarrangia rompendo il legame e formando il carbonile RCO-OMe e i due elettroni del doppio legame che si rompe vanno a prendere l’H che si libera dall’acqua dando l’NH₂.

Con questo processo si evita l’uso di acidi o basi forti, a cui il nucleo β-lattamico è sensibile, e di contro si impiegano reagenti relativamente poco costosi.