Biologia molecolare

Biologia molecolare

Introduzione al mondo biologico

Martina Scianna

Il mondo biologico è un intreccio di connessioni a diversi livelli di organizzazione:

• Gli atomi si uniscono a formare le molecole.
• Le molecole si raggruppano a formare le cellule.
• Le cellule interagiscono per formare i tessuti.
• I tessuti si intrecciano per formare un organismo.
• Gli organismi cooperano formando le popolazioni.
• Le popolazioni fanno parte di ecosistemi e gli ecosistemi formano il mondo che ci circonda.

(Interazioni possibili grazie ad apporti energetici)

Comunicazione e informazione nel genoma

Un tema comune attraversa tutti i livelli di organizzazione: comunicazione e continuo passaggio di informazione da cellula a cellula, da organismo a organismo, da generazione a generazione.

Ma in che modo l'informazione contenuta nel genoma di ogni cellula organizza e dirige la vita degli esseri viventi?

Temi comuni della vita

La diversità della vita è unificata da alcuni temi comuni:

• Ogni organismo vivente deve essere separato dall'ambiente che lo circonda.
• Ogni organismo deve essere in grado di mantenere l'informazione biologica in forma stabile e di utilizzarla per determinare le proprie caratteristiche di composizione, struttura e funzionamento (l'organismo deve saper leggere l'informazione).
• Ogni organismo vivente deve essere in grado di replicare e trasmettere accuratamente l'informazione da una generazione a quella successiva.
• Ogni organismo vivente richiede una fonte di energia dall'ambiente circostante per crescere e riprodursi (energia solare).

Composizione degli esseri viventi

Gli esseri viventi sono costituiti da componenti molecolari comuni: acidi nucleici (5%), ioni inorganici (3%), zuccheri (6%), lipidi (16%), proteine (60%) e metaboliti misti (10%) - macromolecole costruite a partire da unità più piccole ripetute.

Flusso dell'informazione biologica

Il flusso dell'informazione biologica consente il mantenimento della vita poiché garantisce che la progenie di un organismo rimanga fedele ai propri genitori nelle caratteristiche da questi manifestate. A questo punto si parlerà inevitabilmente di ereditarietà dei caratteri trasmessi di generazione in generazione. Le informazioni genetiche sono contenute nel DNA, un polimero esistente in innumerevoli forme per poter garantire la variabilità necessaria a determinare i caratteri di cui i geni sono responsabili ed è formato da unità monomeriche dette nucleotidi.

Struttura e funzione del DNA

La duplicazione dell'informazione contenuta nel DNA è resa possibile da una semplice corrispondenza di forma. Il DNA è costituito da due filamenti che formano una struttura definita "a doppia elica", il cui scheletro comprende zuccheri e fosfati tenuti insieme da legami fosfodiesterici, e all'interno ci sono le quattro basi azotate: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G).

Proprietà chimico-fisiche del DNA

Il DNA, per esteso acido desossiribonucleico, è appunto un acido, quindi dona ioni H+. Questa caratteristica è dovuta al fatto che il gruppo fosfato è sempre in forma deprotonata a pH=7 e cede protoni, ma la carica negativa è stabilizzata dalla risonanza dell'altro ossigeno e per protonarlo c'è bisogno di abbassare il pH. Abbiamo così una carica negativa per ogni coppia di nucleotidi, ciò vuol dire che il DNA è un polianione (cariche negative messe in successione). Entrambi i filamenti del DNA sono polianioni che tendono a respingersi poiché hanno cariche negative.

Genoma e patrimonio genetico

L'intera sequenza di nucleotidi del DNA costituisce il patrimonio genetico di un organismo, ovvero il suo genoma, organizzato in cromosomi, le cui dimensioni variano dalla specie, e composto da geni e regioni intergeniche il cui numero e la disposizione variano a seconda della specie. Il sequenziamento dei genomi dei diversi organismi rivela che i temi comuni che unificano la diversità della vita sono conservati a livello molecolare.

Espressione genica

Espressione genica: processo grazie al quale la cellula trasforma le informazioni contenute nel proprio DNA in molecole (proteine o RNA) che svolgono le funzioni necessarie alle attività metaboliche e strutturali. In altre parole, l'informazione genetica viene convertita in attività biologica.

L'espressione genica è spazialmente e temporalmente regolata. Es: Gene even-skipped espresso nello stadio precoce dello sviluppo embrionale di Drosophila che contribuisce a definire lo schema di segmentazione del moscerino. Il colore azzurro è un marker che fa vedere che questa espressione avviene in punti diversi a seconda dello sviluppo dell'organismo.

Trascrizione e traduzione

Trascrizione e traduzione consentono la sintesi di proteine. Ricorrerà spesso la complementarietà di forma e di carica dei nucleotidi. La traduzione (sintesi proteica) è un processo biologico che permette di tradurre l'RNA messaggero (mRNA), prodotto durante la trascrizione, in catene polipeptidiche (proteine). Questo avviene grazie all'intervento di diverse molecole, le più importanti delle quali sono: enzimi, tRNA, mRNA, fattori, ATP e amminoacidi. La traduzione avviene all'interno di particolari organuli cellulari, i ribosomi, che sono costituiti da due subunità: la maggiore (60 S) e la minore (40 S).

Durante la traduzione, l'informazione genetica passa dall'RNA alle proteine. Questo avviene grazie a legami specifici tra codoni e anticodoni, che permettono di aggiungere amminoacidi alla catena polipeptidica in formazione. Ogni tRNA, infatti, carico del suo corrispondente amminoacido, appaia il proprio anticodone al codone presente sull'mRNA e permette la formazione dei legami peptidici tra amminoacidi. La sintesi proteica termina quando il ribosoma incontra un codone di stop.

Codice genetico

Il codice genetico è il sistema per cui le informazioni genetiche codificate nel DNA arrivano a operare la sintesi di tutte le proteine necessarie alla vita degli organismi. Il suo linguaggio si basa su un "alfabeto" molecolare rappresentato dalla sequenza dei nucleotidi del DNA, che viene tradotto nella sequenza degli amminoacidi di una proteina. Il codice genetico dispone di 4 "lettere" (le 4 diverse basi azotate) per specificare i 20 amminoacidi. Utilizzando gruppi di 3 nucleotidi (triplette, o codoni) si ottengono 4³ = 64 combinazioni diverse. Tre di queste triplette (triplette non senso) non corrispondono a nessun amminoacido: esse servono per segnalare la fine della catena proteica. La tripletta AUG indica l'inizio della catena proteica (serve anche per inserire la metionina).

Si definisce gene la sequenza di triplette che codifica una proteina. Il codice genetico è ridondante, poiché uno stesso amminoacido è codificato da più di una tripletta. Le triplette che codificano lo stesso amminoacido sono molto simili e generalmente differiscono solo per l'ultima delle tre basi. Ciò ha suggerito l'ipotesi che l'informazione fondamentale sia contenuta nelle prime due basi e che la terza serva a garantire una maggiore precisione. Il codice genetico è universale, dal momento che è identico in tutti gli esseri viventi.

Modificazioni del genotipo

La modificazione del genotipo consiste nel cambiare una lettera, un piccolo punto dell'informazione (un nucleotide), cambiando anche l'amminoacido. Oppure ci possono essere delle mutazioni più drastiche con il cambiamento di una sola base che può introdurre un codone di stop e la proteina che prima aveva una certa lunghezza viene bruscamente interrotta e non viene più codificata quella parte (mutazione contro selezionata ma a volte ha dei vantaggi perché si libera un dominio che può avere delle funzioni). Cambiamenti nel genotipo hanno conseguenze sul fenotipo. Ciò consente agli organismi di adattarsi alle condizioni ambientali - evoluzione per mutazione.

Evoluzione e genoma

Ciò accade perché il genoma è un'entità dinamica che nel corso del tempo va incontro a cambiamenti graduali, cumulativi, che si riflettono in progressivi cambiamenti degli organismi di cui dirigono lo sviluppo e il funzionamento. Il cambiamento progressivo del fenotipo di un organismo nel corso delle generazioni è rappresentato dall'evoluzione. Le mutazioni possono essere assorbite in modo graduale, ciò permetterà che si adattino alla vita.

Allineamento delle sequenze e antenato comune

Allineamento di sequenze dell'RNA ribosomiale di diversi organismi (trovare dei punti di sovrapposizione). Ormai è tutto computerizzato, con strumenti bioinformatici. Esistono regioni conservate che determinano un antenato comune a tutte le specie viventi: LUCA (last universal common ancestor). L'albero della vita mostra la relazione evolutiva tra gli organismi.

Biologia molecolare

La biologia molecolare si occupa di tutti quei processi richiesti per il mantenimento e il passaggio dell'informazione al fine di garantire la vita.

Gli acidi nucleici

Inizialmente si pensava che l'informazione genetica fosse contenuta nelle proteine poiché sono molecole più complesse rispetto agli acidi nucleici. Questi ultimi sono formati da 4 nucleotidi differenti per le 4 basi, mentre le proteine sono costituite da 20 amminoacidi essenziali che potendo assumere tante combinazioni possono permettere la diversificazione. In un secondo momento, ci si accorge che il DNA in realtà è un lungo polimero che può assumere tantissime forme ed in particolare furono condotti tre esperimenti che dimostrarono la natura del materiale genetico.

Esperimento di Griffith

Griffith cercava di spiegare alcuni fenomeni legati al cambiamento di ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae. Quest'ultimo si presentava in due ceppi; 2R e 3S. Il ceppo 3S era quello virulento caratterizzato da capsule che li proteggevano dal sistema immunitario e dalla fagocitosi. Il ceppo 2R era quello avirulento non provvisto di capsula e proprio per questo è meno dannoso. Griffith nota che dai pazienti che superano la polmonite si recuperano i batteri del ceppo R e viceversa. Quindi procede in questo modo:

• Inietta cellule vive di streptococco virulento nel topo → il topo muore.
• Inietta cellule avirulente → il topo sopravvive.
• Inietta cellule virulente morte (uccise col calore) → il topo non subisce alcun effetto.
• Inietta delle cellule R mischiate con cellule S morte → il topo muore.

In un secondo momento, facendo l'autopsia, trova cellule S vive nel topo infetto, quando lui aveva in realtà iniettato cellule R vive e cellule S morte. Inoltre, il genotipo delle cellule R è 2 e delle cellule S è 3, invece lui trova cellule 2S e cellule 3R, quindi si sono proprio trasformati, altrimenti si sarebbe potuto pensare ad una mutazione. Conclusione: Nei batteri è presente un principio trasformante in grado di trasformare i ceppi R in S → poi si scopre che questo principio è proprio il DNA.

La bomba di Avery

Avery, Mcleod e Mccarty: i tre scienziati prendono di nuovo il batterio con cui lavorò Griffith e riconducono lo stesso esperimento ottenendo il medesimo risultato. In seguito preparano 3 fialette di una soluzione:

• In una aggiungono Proteasi in grado di digerire le proteine.
• In un'altra aggiungono RNasi in grado di digerire RNA.
• Nell'ultima aggiungono DNasi in grado di digerire DNA.

Osservarono che solo nell'ultima fialetta (contenente DNasi) i batteri non crescevano e che quindi il DNA doveva essere per forza il principio trasformante che una volta distrutto non può più trasformare le cellule R che non riescono a proliferare e vengono distrutte a loro volta.

Esperimenti di Hershey e Chase

Volevano capire cosa fosse responsabile della riproduzione del batteriofago e notano che proteine e acidi nucleici differiscono per un elemento, fosforo e zolfo (quelli uguali sono carbonio, azoto, ossigeno, idrogeno). Per l'esperimento hanno utilizzato un fago, un batterio Escherichia coli e degli isotopi radioattivi del fosforo 32 per il DNA e dello zolfo 35 per le proteine (se viene assunto del fosforo, esso va nel DNA, se viene assunto lo zolfo va nelle proteine).

Quando un batteriofago T2 attacca un batterio, una parte del virus penetra nella cellula batterica. Circa 20 minuti dopo l'infezione, la cellula va incontro a lisi e libera decine di particelle virali. Evidentemente il virus è in qualche modo capace di riprodursi all'interno del batterio. Hershey e Chase ne dedussero che l'ingresso di una qualche componente virale agisse sul programma genetico della cellula batterica ospite, trasformandola in una fabbrica di batteriofagi. Si accinsero quindi a stabilire quale parte del virus, la proteina o il DNA, penetra nella cellula batterica. Per rintracciare le due componenti del virus lungo il suo ciclo vitale, i due ricercatori le marcarono con isotopi radioattivi selettivi: zolfo presenta un isotopo radioattivo, 35S. Hershey e Chase fecero sviluppare il batteriofago T2 in una coltura batterica contenente 35S, in modo da marcare con questo isotopo radioattivo le proteine delle particelle virali risultanti. Il DNA è ricco di fosforo (nell'ossatura desossiribosio-fosfato), un elemento normalmente assente nelle proteine. Anche il fosforo presenta un isotopo radioattivo, 32P. Così i ricercatori fecero sviluppare un altro lotto di T2 in una coltura batterica contenente 32P, in modo da marcare con questo isotopo radioattivo il DNA virale.

Usando questi virus marcati con isotopi radioattivi, Hershey e Chase eseguirono i loro esperimenti. In un primo esperimento, i ricercatori lasciarono che i batteri venissero infettati da un batteriofago marcato con 32P e in un secondo esperimento da un batteriofago marcato con 35S. Dopo pochi minuti dall'infezione, le soluzioni contenenti i batteri infettati furono prima agitate in un frullatore, in modo abbastanza energico da staccare dalla superficie batterica le parti del virus che non erano penetrate nel batterio (ma non così tanto da provocare la lisi del batterio), poi furono sottoposte a centrifugazione per separare i batteri. Se si centrifuga ad alta velocità una soluzione o una sospensione, i soluti o le particelle sospese si separano secondo un gradiente di densità: i residui del virus (cioè le parti che non sono penetrate nel batterio), che sono più leggeri, rimangono nel liquido surnatante; le cellule batteriche, che sono più pesanti, si addensano in un sedimento che si deposita sul fondo della provetta.

Hershey e Chase scoprirono così che la maggior parte di 35S (e quindi della proteina virale) era contenuta nel liquido surnatante, mentre la maggior parte di 32P (e quindi del DNA virale) rimaneva all'interno dei batteri. Questi risultati suggerivano che a trasferirsi nei batteri era stato il DNA: quindi era proprio questa la sostanza capace di modificare il programma genetico della cellula batterica.

Proprietà generali del materiale genetico

Proprietà generali attese del materiale genetico:

• Capacità di immagazzinare informazione genetica e di trasmetterla alla cellula portatrice al momento opportuno.
• Informazione = sequenza di amminoacidi di ogni proteina.
• Segnali di inizio e terminazione per ogni proteina.
• Segnali regolativi: quando e quanto sintetizzare ogni proteina.
• Trasmissione di informazione alla progenie.
• Stabilità chimica del contenuto informativo (stabilità non assoluta perché il DNA deve avere la capacità di mutare subendo alterazioni chimiche anche in fase di duplicazione).
• Capacità di variare: mutabilità.
• Alterazione chimica.
• Errore replicativo.

Proprietà chimico-fisiche del DNA

Proprietà chimico-fisiche del DNA già note prima della formulazione della struttura della doppia elica da parte di Watson e Crick:

• Il DNA contiene nucleotidi legati tra di loro da ponti fosfodiestere.
• Campioni di DNA da specie diverse contengono le stesse basi eterocicliche ma in quantità tra loro differenti e caratteristiche della specie.
• In tutte le specie di DNA, la stechiometria delle diverse basi eterocicliche è correlata: A+G = C+T; A = T; G = C (regola di Chargaff).
• Il DNA delle varie specie ha una certa viscosità e viene convertito in una forma a più bassa viscosità ad una temperatura (Tm = temperatura di melting, temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate) caratteristica della specie.
• Più elevato è il contenuto in GC maggiore la Tm (si prende CG come riferimento perché fa più interazioni di un contenuto AT) → ciò provoca la separazione dei due filamenti e l'aumento dell'assorbimento spettroscopico di fotoni, questo perché le basi dei nucleotidi vengono esposte in modo maggiore quando sono separate dalla temperatura (ipocromismo e ipercromismo).
• La fusione della doppia elica (melting) determina un aumento dell'assorbimento spettroscopico a λ = 260 nm.
• Alcune proprietà biologiche:
• DNA/RNA.
• Ereditabilità.
• Cromosomi.

Esperimento di Chargaff

Esperimento di Chargaff: Erwin Chargaff analizzò il DNA di diverse specie, spezzò le molecole di acido desossiribonucleico nelle sue basi costitutive e le separò mediante cromatografia su carta. Da questo esperimento Chargaff raggiunse due conclusioni fondamentali. In primo luogo, egli osservò che la composizione dei nucleotidi del DNA varia tra una specie e l'altra. In altre parole, gli stessi nucleotidi non si ripetono nello stesso ordine, così come proposto da Levene. Secondo, Chargaff concluse che quasi tutto il DNA — non importa da che tipo di tessuto o di organismo provenga — mantiene una certa regolarità nella composizione delle basi.