Biologia molecolare

Biologia molecolare

La struttura e la funzione del DNA

Nella cellula eucariote c'è un nucleo contenente tutte le informazioni per rendere un individuo tale sia come fenotipo che come genotipo e ne determina anche i comportamenti. Nell'uomo abbiamo tre miliardi di nucleotidi nel DNA. Il DNA è costituito da due filamenti legati tra loro da pioli e ogni filamento è una successione di nucleotidi.

I nucleotidi sono costituiti da uno zucchero a 5 atomi di carbonio, da un gruppo fosfato con tre atomi di ossigeno di cui due legati all'idrogeno con carica negativa e da una base azotata con 2/3 atomi di azoto. Le basi azotate hanno concentrazioni di adenina = timina e citosina = guanina. Per questo adenina + timina = citosina + guanina. [Regola di Chargaff → %A=%T / %C=%G]

Questi dati sono stati ottenuti con varie tecniche che hanno evidenziato anche le dimensioni del DNA (20 Armstrong) che risultano costanti lungo tutto il filamento. Nell’appaiamento delle basi ci possono essere degli errori e quindi si potrebbe appaiare una purina con un'altra purina oppure una pirimidina con un'altra pirimidina ma questo viene subito riconosciuto come errore e sistemato.

Esiste un principio chiamato di complementarità delle basi e abbina l’adenina con la timina e la citosina con la guanina. I pioli sono idrofobici, costituiti dalle basi azotate e sono stabili. Qui ci sono le informazioni genetiche che non riescono a uscire dal DNA. La parte esterna di ogni filamento è composta dal gruppo fosfato idrofilo.

Esperimenti e scoperte sul DNA

Griffith fece un esperimento inserendo nei topi uno streptococco “pneumoniae” che è il DNA dell'elemento che viene trasferito da un batterio ad un altro. Con il calore veniva degradata la sacca polisaccaridica e così i batteri venivano inattivati. Ai topi viene somministrato il batterio dei due tipi. Un tipo era del ceppo S e inattivati mentre quelli dell'altro erano del ceppo R.

Altri presero i batteri e ne separarono i componenti e videro che solo il DNA era trasformabile. Si fece anche un esperimento nel quale un virus contagia con il suo DNA una cellula batterica. Entrambi i virus erano marcati con materiali radioattivi. Uno aveva marcato il DNA che, quando il virus è entrato a contatto con il batterio, ha reso radioattivo il batterio. L'altro, che invece aveva una proteina radioattiva, ha solo trasferito il DNA nel batterio senza renderlo radioattivo.

La doppia elica di Watson e Crick

Negli anni ’50, Watson e Crick suppongono la struttura del DNA (quella ora conosciuta come struttura B), cioè a doppia elica destrorsa, in cui abbiamo due filamenti composti da coppie di basi azotate, legate da legami H, dove le purine (Adenina e Guanina) e le pirimidine (Timina e Citosina) non si possono accoppiare mai fra di loro perché creerebbero dei punti più larghi o più stretti nella circonferenza della molecola poiché gli appaiamenti che si formano sono sempre tra una pirimidina ad un anello aromatico e una purina a due anelli aromatici. Le basi azotate si legano tra di loro attraverso legami ad idrogeno.

La complementarità delle basi permette la forma della molecola e dal contenuto nucleotidico dipende anche la stabilità del filamento. Le coppie C-G rendono il filamento più stabile perché hanno 3 legami ad idrogeno rispetto alle coppie A-T che ne hanno 2. Maggiore è la forza dei legami, maggiore è la stabilità della molecola.

Caratteristiche fisiche del DNA

Il DNA non è una struttura statica ma si può attorcigliare e per questo la sua lunghezza può variare. Per compattarsi si deve appaiare con proteine dotate di carica positiva che sono sempre parzialmente legate al DNA per stabilizzarlo. Negli eucarioti era chiuso nel nucleo dalla membrana nucleare ed avendo carica negativa non esce dalla membrana mentre nei procarioti non è compartimentato. Racchiude le informazioni del DNA codificante e non codificante.

Il DNA ha una torsione perché le basi azotate sentono una pressione da parte di H₂O e c'è una repulsione che fa venire la torsione in modo che l'acqua non riesca ad entrare nella porzione compresa tra i due filamenti di DNA. Il DNA è addensato, poiché esteso sarebbe lungo 1m (aploide) o 2m (diploide).

La torsione del DNA è dovuta alla repulsione tra le basi azotate e l’acqua della soluzione acquosa che contiene la molecola. C’è un legame ad idrogeno tra le basi della coppia, ma c’è anche un’interazione idrofobica tra le coppie di basi vicine (sopra-sotto) per impedire l’ingresso di molecole di H₂O nel doppio filamento. Questa caratteristica aumenta la stabilità.

Un’altra caratteristica del DNA sono i solchi: uno più stretto e l’altro più largo, poiché i 2 filamenti si appaiano in maniera antiparallela. Le diverse distanze fra gli zuccheri, che si notano guardando il filamento dall’alto, comportano le diverse larghezze dei solchi.

La scanalatura (o solco) maggiore ha dimensioni di 22A e la minore di 12A. Nel solco maggiore si associano soprattutto proteine (spesso regolatorie) in modo specifico, poiché le α-eliche si appoggiano comodamente nel solco maggiore e interagiscono con gli atomi e i gruppi sporgenti, mentre nel solco minore normalmente le proteine interagiscono con meno gruppi o atomi liberi, quindi c’è una minore interazione. I solchi sono i bersagli delle proteine, il migliore è il solco maggiore.

Funzioni e interazioni del DNA

Il DNA può avere anche funzioni catalitiche perché può innescare delle reazioni. Ci sono dei frammenti di DNA mobili che si spostano utilizzando la trascrittasi inversa. Il principio di complementarità delle basi consente di mantenere costante il diametro. Tra A-T ci sono 2 legami H. Tra C-G ci sono 3 legami H. Il principio di complementarità delle basi permette di mantenere costante il diametro dell’elica.

Forme alternative del DNA

Un’altra forma del DNA è la forma A, struttura più allargata ma sempre destrorsa, presente principalmente negli ibridi DNA-RNA o caratteristica dell’RNA se si ripiega a doppio filamento, con diametro maggiore. Riproducibile quando il DNA viene disidratato in condizioni non fisiologiche.

C’è la struttura Z assunta dal DNA in maniera transitoria. Z perché a zig-zag, poiché delle regioni del DNA diventano sinistrorse in seguito a metilazione della citosina e rotazione della base azotata rispetto allo zucchero. È più allungata e con diametro minore (18 A). La struttura Z compensa forti torsioni e facilita l’apertura del doppio filamento. Si trova spesso in regioni ricche di C metilate. Rotea il legame glicosidico.

Ci sono oltre ai “classici” appaiamenti, altri appaiamenti molto rari (in condizioni saline e di pH particolari) come quelli di Hoogsteen, dove sono coinvolti atomi diversi dal solito. Si formano in caso in cui si forma una tripla elica.

Misura e organizzazione del DNA

BP è una forma di misura che indica la lunghezza dei filamenti che si calcolano in basi, quindi la lunghezza dipende dai nucleotidi. Genoma: tutto il DNA presente in una cellula/organismo, cromosomico (nucleo) + extracromosomico (mitocondri) (DNA di nucleo + mitocondri + cloroplasti ecc.).

Gene: porzione di DNA che viene trascritta in RNA messaggero che poi diventa una proteina. È la minima parte del genoma (nell’uomo i geni sono circa il 1,5% del DNA). Gene strutturale: gene trascritto in RNA funzionale o che verrà tradotto in proteine.

• DNA cromosomico → nucleo eucarioti
• DNA extra cromosomico → mitocondri
• DNA extra cromosomico → plasmidi procarioti

RNA e differenze con il DNA

RNA a singolo filamento, lo zucchero è il ribosio. A differenza dello zucchero del DNA ha due gruppi OH in posizione 2 e 3. Questo gruppo OH in più conferisce instabilità alla molecola. Al posto della timina c'è l’uracile, base azotata simile alla timina. Anche dopo la sua sintesi ci sono tante basi modificate che facilitano le interazioni sia inter che intramolecolari.

Struttura degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono composti da nucleotidi. I nucleotidi sono composti da:

• Zucchero a 5 atomi di Carbonio
• Base azotata
• Gruppo fosfato

Il nucleoside è formato solo dalla base azotata e dallo zucchero a 5 atomi di C. Lo zucchero può essere il ribosio (RNA) o il desossiribosio (DNA).

Basi azotate

Basi contenenti azoto che in soluzione accettano uno ione H o un protone (si comportano come una base). Sono idrofobiche e hanno varie varianti nell’RNA poiché alla loro struttura si possono aggiungere molecole più complesse come, per esempio, un gruppo metile oppure si possono inserire diversi tipi di legame. Le basi sono legate alla posizione 1’ di uno zucchero da un legame glicosidico.

• Purine: adenina e guanina, formate da due anelli aromatici.
• Pirimidine: nel DNA sono timina e citosina mentre nell’RNA sono uracile e citosina, formate da un anello aromatico.

Gli accoppiamenti tra le basi avvengono solo tra una purina e una pirimidina. Questo permette anche al DNA di mantenere un diametro costante.

Zucchero

Gli zuccheri sono il ribosio nell’RNA e il desossiribosio nel DNA. I vari Carboni presenti vengono numerati da 1 a 5 partendo dal carbonio più a destra. Il carbonio 5 non fa parte dell'anello fuori poiché nella struttura c'è un ossigeno (O). Il ribosio ha il gruppo OH legato al carbonio 2 e 3 mentre il desossiribosio ha il gruppo OH legato solo al carbonio 3. Questo fa sì che gli zuccheri possano essere diversi tra loro.

Fosfato

Il gruppo P (fosfato) può essere attaccato sia al carbonio 5 che al carbonio 3 e questo fa sì che si riescano a legare i vari nucleotidi tra loro.

Ha una carica negativa che conferisce al DNA e all’RNA proprietà acide. Una catena ha estremità 5’ e l’altra 3’, le basi azotate si aggiungono a quest’ultima. Formano legami esteri stabili, sono scissi da idrolisi enzimatica (rimozione del nucleotide senza distruzione). Sono coinvolti nel legame fosfodiesterico, dove permane la carica negativa in quanto l’atomo di ossigeno del gruppo fosfato è ancora ionizzato negativamente. I fosfati carichi negativamente sono estremamente insolubili nei lipidi, questo assicura la ritenzione degli acidi nucleici all’interno della membrana cellulare o nucleare.

Alcuni nucleotidi hanno tre gruppi fosfato legati in serie sulla posizione 5’ dello zucchero attraverso un legame estere. In questo caso i fosfati vengono indicati, a partire da quello legato direttamente allo zucchero, con α, β e γ.

Nucleosidi e nucleotidi

Una catena di DNA o di RNA si forma in una serie di passaggi:

1. Una base è unita chimicamente a uno zucchero a livello del carbonio 1’ dello zucchero, da un legame glicosidico, all’N1 della pirimidina o N9 della purina, formando il nucleoside.
2. Uno o più gruppi fosfato si legano al carbonio 5’ dello zucchero, formando il nucleotide.

Una catena polinucleotidica ha una struttura ripetitiva. Essa consiste di uno scheletro (o impalcatura) in cui si alternano zuccheri e gruppi fosfato, legati tra loro da legami 5' - 3' fosfodiesterici. Lateralmente a questa impalcatura ci sono le basi azotate.

Nucleoside: zucchero pentoso + base azotata.

Nucleotide: base azotata + zucchero pentoso + gruppo fosfato.

Il DNA ha una struttura a doppia elica e la densità suggerisce che l’elica contiene 2 catene polinucleotidiche. Il diametro costante rivela che le basi sono rivolte all’interno e che una purina è sempre appaiata con una pirimidina per questioni di spazio. Le basi azotate sono accoppiate secondo il principio di complementarità delle basi. La stabilità della doppia elica è data anche dalla forza di repulsione dell’acqua. Le basi sono legate tra loro con legami diesterici. La struttura dello scheletro della catena polinucleotidica è diversa se vista da un estremo o dall'altro. In genere i processi molecolari della cellula avvengono in soluzione acquosa.

Le basi azotate sono idrofobiche perché non polari e, quindi, insolubili. Legate a zucchero e fosfato in un nucleotide diventano solubili in acqua ma determinando delle limitazioni conformazionali del DNA in soluzione. Date le dimensioni dei legami fosfato, una scala di zucchero e fosfati con le basi poste al centro lascerebbe ampi buchi tra le coppie di basi unite da ponti idrogeno. Questi buchi in soluzioni acquose verrebbero riempiti da molecole di acqua.

Svolgimento e separazione dei filamenti di DNA

I due filamenti vengono tenuti uniti da legami ad idrogeno che in laboratorio vengono rotti con l’aumento della temperatura. In vivo avviene attraverso l'impiego di proteine ed enzimi. Questo processo viene chiamato denaturazione. Quando la denaturazione coinvolge delle proteine è irreversibile perché il triplo legame non si riesce a riformare. La denaturazione coinvolge la T_m, cioè la temperatura di fusione (Temperatura di melting). Con l’aumento dell’agitazione termica, si supera la forza dei legami idrogeno, delle interazioni idrofobiche e delle altre forze che stabilizzano il dsDNA. Questo è il valore al quale il 50% delle molecole di DNA è denaturato.

• Contenuto di GC (numero di legami guanina-citosina. Maggiore è il numero dei legami e maggiore sarà la temperatura).
• Concentrazione salina (la presenza di cationi scherma le cariche negative di un filamento e così prevalgono le forze repulsive dei gruppi fosforici).
• pH (più è alto, meglio si scindono i due filamenti).

I legami fosfodiesterici invece riescono a rimanere intatti. Si può analizzare il DNA attraverso la luce ultravioletta poiché è in grado di assorbirla ed emetterla con un'altra lunghezza d'onda. Quando viene assorbita, il doppio filamento riesce ad emetterla ad una certa lunghezza d'onda che dipende dagli anelli aromatici delle basi, cioè se questi sono ben esposti o no. 260 nm è l'unità di misura base con il quale il DNA viene letto.

Con questo processo posso utilizzare un filamento singolo per cercare quel medesimo tratto in un altro pezzo di DNA, quindi, vedere se è presente in un'altra matrice. Il filamento viene utilizzato come se fosse una sonda. Se la temperatura dopo viene abbassata, il DNA si rinatura. La rinaturazione è specifica e avviene in due fasi.

1. I filamenti si incontrano per caso e se trovano le basi complementari si formano gli appaiamenti.
2. Si chiude il filamento come una zip.

Ci possono essere dei Missmatch, cioè degli accoppiamenti non precisi. Questo processo viene detto ibridazione (sonde) o annealing (PCR) e corrisponde alla capacità di due molecole (RNA/DNA) di ibridare tra loro. Costituisce un test preciso della loro complementarità. I processi di ibridazione possono essere realizzati dal substrato per legare il DNA d'interesse e per analizzare le diverse sequenze.

• Una preparazione di DNA viene denaturata caricata su un filtro.
• Un DNA sonda è aggiunto in soluzione. In genere viene marcato radioattivamente per seguire la reazione di ibridazione dosando l’isotopo.
• In alternativa si dosa agli UV a 260 nm.
• Due sequenze possono ibridarsi anche se simili e non identiche, formando duplex imperfetto con interruzioni dove i nucleotidi sono diversi.

Gli esperimenti di ibridazione possono esser fatti su un substrato, essenziale per poter legare il DNA d’interesse. Su questo substrato ci si pone la quantità desiderata di DNA da studiare. Contemporaneamente si utilizzano altri DNA che fungono da sonda. In una opportuna soluzione avverrà l’ibridazione che poi si potrà osservare. Questa osservazione potrà esser fatta se si è utilizzato un qualcosa per evidenziare l’ibridazione, esempio è il caso di utilizzo di un nucleotide radioattivo.

Strutture secondarie insolite

Esistono delle particolari strutture secondarie che può assumere il DNA. Sono sequenze specifiche che dipendono dal contenuto nucleotidico. Il DNA cambia la sua struttura secondaria e terziaria, regolando l’espressione genica. Possono dipendere dal superavvolgimento, positivo o negativo, del DNA. All’interno della struttura ci possono essere molte sequenze ripetute in tandem, che consentono la formazione di piccole anse, oppure ci possono essere sequenze ripetute invertite che fanno formare una struttura cruciforme. Altra struttura che ha la possibilità di formarsi è la tripla elica.

Struttura scivolata. La ripetizione in tandem è una ripetizione di pochi nucleotidi adiacenti, ovvero delle ripetizioni testa-coda. Ex. 5’TAGCTAGCTACH. Quindi in certe zone del DNA, specialmente nella replicazione del DNA, si ha una sorta di scivolamento dove si possono formare queste anse (anse di compensazione). Questo è un ripiegamento del DNA che rimane a singolo filamento.

Queste particolarità possono fungere da segnale (punto di riconoscimento) per alcune categorie di proteine per effettuare dei legami in punti precisi della struttura del DNA. Queste interazioni transienti possono essere cruciali per i meccanismi di divisione e trascrizione. Esempio: il legame di una proteina in un punto specifico del DNA può segnare il punto preciso del taglio della sequenza. Altre ripetizioni possono essere:

• Ripetizione palindrome: queste sequenze sono ripetute invertite, ma si leggono sempre da 5’ a 3’.