Biologia molecolare

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Biologia molecolare: studia gli acidi nucleici e le interazioni che questi hanno con le macromolecole biologiche.

La più importante è acido nucleico-proteina, sta alla base della capacità cellulare di svolgere una determinata funzione.

Esperimento di Frederick Griffith

Medico e microbiologo inglese, stava speculando la possibilità di realizzare un vaccino per polmonite e per i suoi studi utilizzava 2 ceppi di Streptococcus pneumoniae.

Isola 2 ceppi batterici:

• Colonia rugosa. 1. R: benigni, costituita da batteri con superficie rugosa per la mancanza di capsula esterna.
• Non avendo la capsula protettiva, viene riconosciuto e distrutto dal sistema immunitario.
• Colonia liscia. 2. S: virulento, costituita da batteri rivestiti da una capsula di natura polisaccaridica che previene il riconoscimento da parte del sistema immunitario.

Li inocula in topi:

• 1. R → nessun cambiamento, preservava il topo dalla morte.
• 2. S → porta alla morte.
• 3. Ceppi S trattati al calore → inattivazione batterio visibile poiché il successivo inoculo non portava alla morte.
• 4. Miscela di batteri del ceppo R (vivi) e S inattivato dal calore (morti) → topo muore.

Ciò significa che il calore uccideva ma evidentemente non degradava il principio responsabile della virulenza.

Esisteva all’interno dei batteri S un principio trasformante → A livello molecolare questo principio non era stato annientato e poteva essere trasmesso ai batteri del ceppo R.

Principio trasformante (converte il batterio da innocuo a virulento) .. in termini odierni parleremo del gene o dei geni per la produzione della capsula polisaccaridica.

Probabilmente il processo di degradazione al calore pur avendo compromesso l’integrità molecolare ha risparmiato il principio trasformante (gene caps) passato da una cellula morta a una cellula viva del ceppo R che ricevendo il gene venne convertito da innocuo a virulento poiché iniziò a produrre la capsula polisaccaridica.

Griffith identifica per la prima volta gli alleli R e S.

Ma non poté dire altro in aggiunta su ciò che è la natura biochimica del materiale genetico.

Esperimento di Oswald T. Avery

Oswald T. Avery fece un esperimento che fu definito la bomba di Avery poiché sconvolse i canoni biochimici classici in cui le proteine erano le protagoniste.

L’esperimento fu intrapreso al fine di identificare la natura chimica del principio trasformante presente nel ceppo S.

Tale studio fu effettuato utilizzando estratti cellulari di pneumococchi del ceppo S. La patogenicità non veniva saggiata in vivo nei topi, bensì mediante semplice osservazione delle colonie batteriche (ceppi R e S) cresciute su piastra agar.

Quale delle macromolecole presenti nell’estratto da batteri del ceppo S è l’effettivo responsabile della trasformazione (proteine, lipidi, polisaccaridi, DNA o RNA)? 2 tecniche.

Partendo da culture S si frazionano tutte le componenti macromolecolari.

Scaricato da Mery emme (liveweareyoung@live.it).

• 1. Aliquote di estratto da batteri patogeni sono state suddivise in provette e trattate ciascuna con un reagente specifico per la degradazione di un componente macromolecolare.
• 2. Partendo da estratti di batteri patogeni sono state allestite differenti aliquote contenenti ciascuna una preparazione purificata relativa ad una componente macromolecolare.

Le preparazioni vengono poste a contatto con batteri R.

Solo la piastra nella quale era stato versato il contenuto relativo al DNA subiva una sorta di trasformazione.

I risultati ottenuti dai 2 esperimenti, se pur differenti, portano alla medesima conclusione, la natura biochimica del principio trasformante è la molecola di DNA.

I° prova che la natura biochimica del materiale genetico è il DNA → scardinando le proteine dal podio.

Max Delbrück e Salvador Luria

Max Delbrück e Salvador Luria: negli anni ’40 fondatori del <gruppo del fago> → utilizzo di batteriofagi o fagi (virus che parassitano cellule batteriche) per lo studio della struttura e della funzione dei geni; per studiare un sistema complesso era necessario partire da un sistema più semplice.

Fago: costituito da 1 molecola di DNA ricoperta da un involucro di natura proteica in cui si estende un collo che termina con delle gambe che hanno la funzione di aderire alla superficie del batterio.

Una volta aderito, il collo si contrae e inietta il contenuto genetico all’interno del batterio.

Ciclo litico → il destino della cellula infettata è la LISI.

Il fago inietta il materiale genetico nel batterio di cui sfrutta il sistema di sintesi per la costituzione di nuove cellule fagiche che mandano in lisi la cellula batterica e vengono rilasciate.

Esperimento del frullatore di Alfred Hershey e Martha Chase

Alfred Hershey e Martha Chase (1952) misero in atto <<l’esperimento del frullatore>>.

Scopo finale: la componente depositaria del materiale genetico sono le proteine o acidi nucleici?

Esperimento che prevedeva la manipolazione dei fagi in particolare fago T2.

Come tutti i fagi ha una doppia componente: acidi nucleici e proteine.

Isotopi radioattivi per marcare le componenti.

S e P marcano in maniera selettiva e differente proteine e DNA.

A seconda di come si trasferiva la radioattività riuscirono a capire cosa si trasferiva.

• ³⁵S → proteine (metionina e cisteina hanno atomi di S).
• ³²P → acidi nucleici polimero di nucleotidi (contiene P).

Lo scopo di tale procedura era quello di identificare quale componente del fago parentale, contenente gli isotopi radioattivi, entrasse nella cellula ospite e quindi ricomparisse nella cellula fagica successiva.

Le 2 popolazioni fagiche marcate separatamente furono usate per infettare batteri.

Il frullatore stacca il fago dal batterio (poiché moltiplica il campo gravitazionale fisiologico).

Cellule e fagi vengono separati per centrifugazione.

• Pellet: componente depositata sul fondo → batteri.
• Surnatante: componente sopra il pellet → fagi.

I virus rispetto ai batteri sono molto più piccoli, i batteri precipitarono mentre i virus nuotavano nel surnatante.

• ³⁵S stava nel surnatante → la radioattività era rimasta nei virus.
• ³²P stava nel pellet → quindi si trovava all’interno dei batteri.

Il risultato dell’esperimento decretò che la natura macromolecolare del principio trasformante sosta nel DNA.

Erwin Chargaff e la regola di Chargaff

Erwin Chargaff (1950) regola di Chargaff: c’è una sorta di costanza tra il rapporto delle basi dei differenti organismi.

DNA isolato subiva un trattamento acido per idrolizzare i legami fosfodiesterici, con conseguente rilascio dei singoli nucleotidi, i quali venivano analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

Rilasciando i singoli nucleotidi:

• Osservazione 1: organismi di specie differenti hanno una concentrazione di basi differente.
• Osservazione 2: indipendentemente dalla fonte di DNA l’appaiamento delle basi è altamente specifico (purina-pirimidina), ed è costante il rapporto.
• A-T → il n° (o %) di A è uguale a quello di T.
• G-C → il n° (o %) di G è uguale a quello di C.

Struttura tridimensionale del DNA e diffrazione a raggi X

Dopo l’identificazione della natura chimica (DNA) del materiale genetico, molti studi furono intrapresi al fine di determinare la struttura tridimensionale DNA utilizzando tecniche che erano state applicate con successo per l’analisi della struttura delle proteine: diffrazione a raggi X.

Una sorgente di radiazioni ionizzanti genera raggi X che vengono collimate in un fascio da strutture che lo concentrano nella direzione in cui si trova il campione in analisi.

I raggi X sono adatti per campioni in forma cristallina (solida).

Un campione biologico viene cristallizzato (soluzione con componente salina e successiva evaporazione) e diventa idonea per un’analisi a raggi X utile per poterne determinare la struttura 3-D.

La tecnica venne traslata per gli acidi-nucleici.

Il primo che sviluppò questo interesse fu Pauling, che si dedicò alla struttura secondaria ad α-elica di proteine; sulla base di questi risultati propose il modello per il DNA a 3 eliche.

Da questo trassero spunto Maurice Wilkins e Rosalind Franklin che effettuarono altre indagini strutturali DNA.

Raggi X collimati verso il punto in cui si trovava il campione di DNA che in seguito al fenomeno di diffrazione impressionava una lastra.

Nel momento in cui il raggio collide con il campione incontra le sue particelle che fanno cambiare la direzione del raggio.

Al di là del campione in virtù della diffrazione il raggio cambia direzione.

La lastra funge da nastro assorbente in grado di captare la variazione di direzione (spettro derivante dal raggio uscente).

Non dà origine a un disegno casuale ma si osserva una certa regolarità che rivela la regolarità del DNA.

Nel 1953 proposero il modello che ambiva a descrivere la struttura a doppia elica del DNA (rappresentò un’importante tappa per la biologia molecolare).

Molecola di DNA costituita da 2 filamenti che si avvolgono uno intorno all’altro interagendo a formare una doppia elica.

Impalcatura zucchero fosfato: lo scheletro della struttura è l’alternanza di zuccheri – fosfato rivolti verso l’esterno e le basi azotate rivolte verso l’interno.

In realtà i campioni di DNA che furono analizzati per diffrazione non erano proprio cristalli poiché è quasi impossibile ottenere dei campioni di DNA in forma cristallina, ma si possono ottenere filamenti di DNA (forma semisolida non totalmente disidratata).

Ciò aiutò la sua comprensione poiché il campione non essendo completamente disidratato mimava le condizioni naturali all’interno della cellula.

Lo scheletro zucchero-fosfato è la componente ragionevolmente idrofilica → è la componente rivolta verso l’esterno (ambiente acquoso).

Le basi azotate sono idrofobiche → vengono rivolte verso l’interno per minimizzare i contatti con ambiente acquoso.

Catene polinucleotidiche e nucleotide

2 catene polinucleotidiche (polimero di nucleotidi).

L’unità monomerica è il nucleotide.

Ciascun nucleotide protrude verso l’interno dalla colonna portante, dal p.v chimico è costituito da 3 componenti:

Zucchero pentoso

1. Uno zucchero pentoso (5 atomi di C) che in condizioni prossime a quelle che sussistono nella cellula ciclizza, l’ossigeno funge da ponte tra il C1 e il C4 (parti integranti dell’anello), il C5 non fa parte dell’anello.

β-D-2-deossiribosio ha la caratteristica di avere 2 H legati al C2 (il C1, C3, C4, C5 legati ad 1 H e un altro sostituente).

Ribosio: la struttura subisce una piccola variazione nel C2 abbiamo un gruppo OH con una serie di ripercussioni.

Base azotata

2. Una base azotata: composti che riassumono contemporaneamente nella loro struttura:

• Composti aromatici.
• Composti eterociclici.
• Molecole planari.

Si dividono in:

• Purine: composti costituite da 2 anelli aromatici condensati.
• Adenina.
• Guanina.
• Pirimidine: singolo anello aromatico.
• Cistosina.
• Timina.

La differenza tra queste 2 categorie è la modalità con cui si legano al ribosio nell’assemblaggio del nucleotide.

Le basi azotate sono 4, ma esistono variazioni sul tema (enzimi possono modificare a livello strutturale i 4 nucleotidi classici dando origine a nucleotidi modificati).

Gruppo fosfato e formazione del nucleotide

3. Un gruppo fosfato.

(Ciascuna componente si lega in modo specifiche all’altra).

Formazione nucleotide, le 3 componenti si assemblano.

Il fulcro è il ribosio:

• C1 lega la base azotata (N in posizione 1 pirimidine // N posizione 9 purine) con un legame C-N chiamato β-N-glicosidico in seguito ad una reazione di disidratazione formando una struttura che prende il nome di NUCLEOSIDE.
• Quando il nucleoside si lega all’acido fosforico si forma in nucleotide.
• C5 lega gruppo fosfato (residuo di acido fosforico) con un legame fosfoesterico (tra un gruppo alcolico e un gruppo acido).

Il nucleoside così composto può essere definito nucleoside monofosfato.

A questo livello il grado di fosforilazione può essere incrementato.

I nucleosidi esistono in diverse forme. I nucleosidi 5’-trifosfati sono precursori nella sintesi degli acidi nucleici.

I legami tra il primo (α) e il secondo (β) fosfato, e tra il secondo (β) e il terzo (γ) fosfato, sono diversi, sono legami fosfoanidridici, ad alta energia. Il legame tra il primo (α) fosfato e C5’ è un legame a bassa energia (fosfoesterico).

Ciascun nucleotide ha un’estremità:

• 3’ ossidrilica.
• 5’ fosforilata.

Ciascuno dei 2 filamenti termina alle estremità con una differente polarità.

Allungamento della catena e legami fosfodiesterici

Modalità con cui ciascun nucleotide si lega agli altri nell’allungamento della catena.

La DNA polimerasi allestisce la catena utilizzando come precursori i nucleotidi 5’-trifosfati e necessita di un filamento di DNA che funge da stampo (enzima coinvolto nella duplicazione del DNA).

Il nucleotide incorporato nella catena è monofosfato.

All’interno di ciascuna catena polinucleotidica, i nucleotidi sono uniti tra loro mediante un legame fosfodiesterico che si instaura sempre tra l’ossidrile in posizione 3’ del 2’-deossiribosio e il fosfato in 5’ di un nucleotide adiacente.

Nel modello che descrive il DNA è implicito l’ambiente in cui si trova.

Le catene polinucleotidiche costituenti la molecola di DNA sono costituite da una parte idrofilica (scheletro zucchero-fosfato) e da una parte idrofobica (basi azotate).

Nella struttura a doppia elica i 2 scheletri si dispongono all’esterno a contatto con l’H2O, mentre le basi si dispongono all’interno.

Forze che stabilizzano la doppia elica

Esistono forze che si controbilanciano nel modello del DNA.

I 2 scheletri, che contengono i gruppi fosfato carichi negativamente, tendono a respingersi.

Gli scheletri di zucchero-fosfato generano tra loro forze di tipo repulsivo generate da cariche negative vicine, tendenzialmente le eliche si respingono, in virtù di ciò in linea teorica le catene si repellono.

Ciò viene bilanciato da 2 tipi forze, che tendono invece a mantenere uniti i filamenti e stabilizzano la doppia elica:

• Appaiamento: legami H tra le basi complementari.
• Impilamento, staking: interazioni idrofobiche dovute all’impilamento delle basi adiacenti.

Le basi azotate sono composti aromatici, si caratterizzano per un elevato grado di idrofobicità; nel momento in cui queste si impilano gli anelli aromatici intraprendono relazioni di natura idrofobica che tendono ad avvicinare le basi (le tengono unite).

Queste forze tendono ad avvicinare 2 basi contigue tuttavia se queste forze avvenissero in senso unicamente verticale tenderebbe ad appiattirsi, ma nel dipanarsi, la struttura del DNA è un’unica macromolecola e le forze di staking si ripercuotono su tutta la struttura portando la doppia elica proprio all’avvolgimento.

I vincoli sono i legami fosfodiesterici → il reale avvicinamento può esserci solo se c’è anche una torsione → la torsione è il frutto dell’avvicinamento.

Le forze di staking derivano dalla caratteristica delle basi e dal fatto che la molecola è immersa in acqua.

Riducendo lo spazio che c’è tra le 2 basi impedisce all’acqua di entrare al suo interno ottemperando.

L’avvolgimento è il frutto del soddisfacimento strutturale legato all’ambiente in cui le molecole si trovano.

Rotazione delle basi e base flipping

Esistono circostanze in cui le basi si trovano orientate all’esterno.

Le singole basi a volte possono protrudere dalla doppia elica → rotazione della base all’esterno (base flipping).

Gli enzimi che metilano le basi e quelli che rimuovono le basi danneggiate inducono questo fenomeno di rotazione.

Se la base rimanesse nella sua posizione (rivolta all’interno della doppia elica) per questioni steriche l’enzima non avrebbe la possibilità di alloggiare il substrato (la base stessa) nel proprio sito catalitico.

Altri enzimi coinvolti nella ricombinazione omologa e nella riparazione del DNA, <<scandagliano>> la molecola di DNA rotando le basi all’esterno ad una ad una.

Parametri della doppia elica

I filamenti complementari decorrono nella medesima direzione (destrorsa) con polarità opposta.

Diametro costante dell’elica di 20 Å (2 nm).

Esistono delle ripetitività che decorrono in maniera periodica.

La struttura del DNA fa sì che l’avvolgimento intorno all’asse principale avviene con una periodicità da cui si ricava il parametro dimensionale.

Giro dell’elica: distanza percorsa dalla doppia elica per compiere un giro completo intorno all’asse.

In questa distanza sono compresi 10-11 nucleotidi, tra un nucleotide e l’altro vi è una distanza pari a 3,4 Å.

1 giro d’elica = 34 Å.

A livello di struttura del DNA ritroviamo soddisfatta la regola di Chargaff (appaiamento regolare delle basi): i 2 filamenti oltre ad essere avvolti sono appaiati tenuti uniti a seguito di legami H tra le basi azotate dei filamenti.

• T-A = 2 legami H (sono più facili da separare, la sommatoria delle F che tengono uniti i filamenti è minore).
• C-G = 3 legami H.

Ciascuno dei 2 filamenti è avvolto ad attorno ad un asse centrale in modo antiparallelo.

α-elica orientate tra loro in maniera antiparallela.

La doppia elica del DNA ruota in senso destrorso.

La presenza dei solchi (soprattutto maggiore) genera la capacità dal DNA di interagire con le proteine (il DNA svolge le sue funzioni in maniera correlata alle proteine → le proteine regolano l’espressione dei geni).

I 2 filamenti si avvolgono in maniera tale da formare 2 solchi (c’è una ragione chimica) di