Biologia dello sviluppo vegetale

Lezione 1 (28-09)

Riassunto

• La proliferazione cellulare è necessaria per l’aumento di dimensioni.
• Piante e animali si sviluppano da una singola cellula.
• Le cellule che formano un individuo hanno tutte lo stesso genotipo ma fenotipo diverso, differenziamento.
• Organogenesi.
• Crescita determinata vs crescita.

Lo sviluppo inizia con la formazione dello zigote.

I gameti sono aploidi, quindi hanno un unico corredo cromosomico e lo zigote sarà diploide.

Negli animali il differenziamento dei tessuti e degli organi avviene durante lo sviluppo embrionale, mentre nelle piante lo sviluppo dei tessuti avviene nella fase post embrionale.

Le fasi della biologia dello sviluppo

• Aumento del n. di cellule -> tramite successive divisioni mitotiche.
• Differenziamento delle cellule -> pur avendo lo stesso genotipo perché si formano per mitosi, le diverse cellule devono acquisire caratteristiche specifiche. In questo processo si formano i tessuti.
• Organogenesi -> cellule fenotipicamente diverse si devono differenziare a formare gli organi.

Problematiche studiate dalla biologia dello sviluppo

Quali sono le problematiche studiate dalla biologia dello sviluppo?

1. Il differenziamento -> poiché ogni cellula dell’organismo presenta lo stesso genotipo, come può questa serie di istruzioni genetiche produrre differenti tipi di cellule?
2. La morfogenesi e l’organogenesi -> come possono le cellule formare strutture ordinate?
3. L’accrescimento -> come fanno le cellule a sapere quando devono smettere di dividersi?
4. L’interazione con l’ambiente -> come viene regolata l’interazione con fattori ambientali?

L’aumento del n. di cellule si ha anche nei microrganismi, ma a differenza dei pluricellulari, quando si ha un aumento del n. di cellule negli unicellulari si formano colonie di cellule tutte uguali.

Cellule parenchimatiche hanno una funzione molto diversa da quelle epidermiche.

Le cellule devono formare tessuti che a loro volta devono formare organi.

Differenze tra piante e animali

Differenza legata a caratteristiche genetiche delle piante rispetto agli animali:

• Body plan degli animali viene organizzato nella fase embrionale e nella fase successiva c’è solo un aumento delle dimensioni -> crescita determinata.
• Piante hanno un aumento continuo della crescita -> crescita indeterminata.

Come si studia lo sviluppo

Come si studia lo sviluppo?

Scegliendo un sistema modello -> specie di piccole dimensioni con ciclo vitale breve, economico, progenie numerosa, disponibilità di mutanti e facile da manipolare. Ma molto importante che abbia un genoma di piccole dimensioni e un genoma già sequenziato.

Arabidopsis per le monocotiledoni e riso per le dicotiledoni.

Piante hanno n. di geni superiore, anche ridondanti rispetto anche ai vertebrati, ma non correla con la complessità degli organismi.

Lezione 2

Riassunto

• Cosa sono i mutanti e come si possono ottenere.
• Differenza tra forward and reverse genetics.
• Come può essere utilizzata la trasformazione delle cellule vegetali mediante Agrobacterium.
• Come si studia l’espressione di un gene: ibridazione in situ e geni reporter.

I mutanti sono necessari per comprendere i meccanismi genetico-molecolari che regolano lo sviluppo.

Supponiamo che vogliamo studiare meccanismi genetico-molecolari che studiano lo sviluppo del fiore in Arabidopsis.

Confrontiamo il wild type con i mutanti modificati.

In natura il tasso di mutagenesi è basso.

I mutanti sono ottenuti con mutagenesi chimica-fisica.

Mutagenesi chimica usata nelle piante -> agente chimico per mutagenesi indotta è etilmetansulfonato EMS che sostituisce una base.

La mutazione sarà a livello eterozigote. Inserzione di T-DNA.

Altro sistema usato molto è ottenere mutanti attraverso l’inserzione di T-DNA o di elementi trasponibili.

Agrobacterium tumefaciens e plasmide Ti

Quello che viene usato per fare questa mutagenesi indotta è un agrobatterio, batterio del suolo, che è Agrobacterium tumefaciens: in natura entra nelle piante da una ferita e inserisce il DNA del batterio dentro il genoma della pianta, creando un’induzione alla divisione cellulare che sono incontrollate -> si generano tumori.

<———— Immagine schema cellula di un batterio con cromosoma circolare, ma ha anche un plasmide, molecola plasmide DNA circolare di dimensioni ridotte chiamato pTi, Ti proprio per tumor inducing. Infatti sono i geni collocati in questo plasmide che, inseriti nel genoma della cellula ospitante, inducono la formazione del tumore.

I geni trasferiti dal plasmide si trovano tra le zone rosse indicate come LB, left border, e RB, right border; normalmente questi geni vengono trasferiti all’interno delle cellule infettate da questo batterio.

Dall’immagine sotto si vede che il plasmide Ti, tramite una serie di proteine accessorie, trasferisce questo DNA dentro la cellula infettata e lo integra direttamente nel DNA genomico.

Questi geni del batterio vengono trascritti e tradotti come fosse genoma della pianta provocando una proliferazione delle cellule vegetali.

Anni fa hanno ingegnerizzato questo batterio, cioè hanno sostituito la regione che sta tra LB a RB con un DNA sintetico. Questo plasmide dell’agrobatterio viene disarmato, cioè non induce più la formazione di un tumore, ma contiene i geni che l’operatore vuole trasferire all’interno del genoma delle cellule vegetali infettate.

Formazione di mutanti con T-DNA

Quindi, per la formazione di mutanti, quello che viene fatto è di inserire in questa regione del DNA, che non ha impatto sullo sviluppo della pianta, in più viene messo anche un gene che facilita il riconoscimento delle piante che contengono questo DNA transgenico.

Si prepara una coltura batterica con questo agrobatterio ingegnerizzato e si mette in contatto questo batterio con la pianta che si vuole trasformare.

Questo plasmide non è in grado di formare un tumore ma di dare il DNA alla pianta ospite.

Nel caso di Arabidopsis -> si mettono in contatto i fiori che contengono i gameti con questa cultura di agrobatterio con plasmide disarmato e infetterà tutte le cellule di Arabidopsis che riuscirà a penetrare.

Ciclo vitale si conclude con la formazione semi -> saranno semi transgenici perché avremo il DNA del plasmide Ti inserito all’interno del proprio genoma.

Come si riconoscono i semi transgenici?

Nel pezzetto di DNA tra LB e RB viene inserito anche un gene che aiuta il riconoscimento delle piante transgeniche o un gene che dà resistenza ad un antibiotico. Si fanno germinare semi in presenza di un antibiotico e solo quelli che contengono DNA transgenico, avendo resistenza, germinano e danno origine ad una pianta transgenica. Oppure geni che conferiscono fluorescenza visibile al binoculare con UV.

Questo T-DNA come riesce a fare mutazioni?

Il T-DNA si inserisce casualmente nel genoma, quindi si può inserire anche in una regione codificante determinando una mutazione che può essere davvero seria, inseriamo proprio un pezzo di DNA all’interno di un gene. Quindi queste mutazioni sono stabili che vengono poi ereditate e, per riuscire a identificare individui che hanno del T-DNA inserito in una regione codificante che crea un fenotipo mutato, è necessario andare nella generazione successiva.

Riassunto -> inserzione T-DNA a livello genomico è random -> quindi quando l’inserzione del T-DNA a livello cromosomico privilegia le regioni trascritte -> inserzione del T-DNA a livello del gene è random.

La trasformazione fa sì che ci sia inserzione del T-DNA in uno dei due alleli, quindi per avere fenotipo mutato è necessario andare alla generazione successiva, cioè ottenere degli omozigoti per l’inserzione.

L’inserzione del T-DNA in generale è una mutazione knock out, KO, poiché inattiva la proteina codificata da questo gene perché interrompe la sequenza dei nucleotidi, quindi inattiva la proteina.

Quando si fa la trasformazione, usando l’agrobatterio, nel genoma entrano 1-2 copie al massimo di T-DNA -> questo facilita poi l’isolamento del gene che viene modificato con mutagenesi indotta.

Mentre le mutagenesi chimiche determinano la mutazione di una singola base e queste mutazioni sono frequenti nel genoma per cui, se consideriamo i 5 cromosomi di Arabidopsis, mediante mutagenesi indotta con T-DNA abbiamo 2-3 copie al massimo, quindi poi è facile capire il gene responsabile di questo tipo perché targettato con T-DNA inserito dentro.

Mentre per mutagenesi chimica si hanno più eventi, anche alcune decine, a livello di ciascun singolo genoma, quindi è difficile capire quale mutazione ha dato origine a un determinato fenotipo e molto spesso non sono mutanti KO, perché sono sostituzione di base, quindi a volte sono conservative, quindi bisogna analizzare molti individui per trovare l’individuo con il gene d’interesse completamente silenziato.

Studio dei mutanti

Una volta ottenuti questi mutanti bisogna utilizzarli per capire i meccanismi alla base dello sviluppo -> si selezionano i mutanti d’interesse.

Se dobbiamo studiare lo sviluppo del fiore bisogna identificare tra popolazioni di Arabidopsis i mutanti che hanno la morfologia florale alterata.

1) Analisi morfologica: quindi si va a vedere confrontando tra il fiore wt e il mutante.

Ci sono molte tecniche di microscopia con il SEM per vedere le variazioni di sviluppo e si fa una descrizione dettagliata.

Capire i meccanismi, cioè cos’è successo a livello genetico per capire come avere questo fenotipo mutato.

Mutante agamous —> questo mutante è mutante in un singolo gene. Ci sono dei mutanti in cui si formano gli organi correttamente ma sono al posto sbagliato. Questo fiore forma i petali anche molto belli ma si formano non all’interno del fiore in un verticillo solo, ma ovunque anche al posto dei sepali e carpelli. Questo mutante è detto omeotico, in cui gli organi si formano correttamente ma al posto sbagliato. Un mutante dovuto alla mutazione di un singolo gene, in grado di determinare un difetto molto grave, ovviamente in natura sarebbe letale: non fa gameti e non avrà progenie.

2) Analisi genetica, cioè vedere se la mutazione è recessiva o dominante, quindi se bisogna avere entrambi gli alleli mutati o uno solo. Capire per cosa codifica e cosa fa la proteina codificata dal gene in questione.

Caratterizzare un gene vuol dire vedere dove il gene viene espresso, quindi il gene viene isolato e si va a vedere dove il gene viene trascritto -> quando si isola un gene che mutato dà origine al fenotipo d’interesse si parla di forward genetics, quando si passa da un mutante al gene.

Isolato questo gene si fa una predizione per capire quale tipo di proteina viene codificata da questo gene e si vede dove viene espresso.

Mutante nella morfologia florale è dovuto alla mutazione del gene Agamous, senza gameti. Ipotizziamo che venga trascritto a livello del fiore, quindi uno degli esperimenti più importanti per la caratterizzazione del gene è vedere dove viene trascritto e le tecniche sono:

Ibridazione in situ

Ibridazione in situ -> si basa sull’utilizzo di sonde a RNA antisenso.

Si vuole studiare se un determinato gene, Agamous, è espresso nel fiore ma in quali tessuti. Si fissa la struttura dove si vuole studiare di un determinato gene, si include in paraffina, poi vengono fatte delle fette sottili di 7 micron e poi si fa ibridazione con una sonda a RNA marcata. Questo RNA antisenso andrà a ibridare con l’RNA senso che è quello trascritto dall’RNA polimerasi, che dà un’indicazione di dove il gene è trascritto.

La sonda viene fatta con nucleotidi modificati che hanno attaccati la diossigenina. Si può visualizzare dov’è avvenuta l’ibridazione tra il RNA senso e antisenso proprio perché nell’antisenso ci sono residui di ossigenica che sono facilmente visibili tramite l’utilizzo di un anticorpo coniugato con l’enzima fosfatasi alcalina, FA, a sua volta catalizza la trasformazione di un substrato incolore in uno colorato, quindi laddove avviene l’ibridazione in seguito al trattamento con anticorpi e substrato si possono vedere delle pigmentazioni dove l’RNA antisenso si è appaiato con un RNA senso e era presente l’RNA complementare a quello usato come sonda. Questo sistema può essere usato per capire in quale cellule il gene che vogliamo studiare è espresso.

Uso di geni reporter

Uso di geni reporter per visualizzare l’attività del promotore -> si clona il promotore a monte di un gene reporter, utilizzati geni reporter GUS e GFP. In laboratorio si producono questi DNA ricombinanti che poi dovranno essere inseriti in pianta.

Quando il gene reporter è il GUS, gene che codifica per l’enzima beta-gluconidasi, questo enzima viene utilizzato perché nelle piante non esiste, non c’è background; interessante perché è in grado di trasformare un composto invisibile in un composto blu e maggiormente visibile anche con un binoculare.

Il saggio GUS è stato ideato e sviluppato da Richard Anthony Jefferson e la tecnica è basata sull’enzima beta-gluconidasi, che è un enzima di E. coli.

Si clona il gene codificante questo enzima a valle del gene che si vuole studiare l’attività.

L’altro reporter è la GFP, che è di origine animale: una proteina codificata da un gene presente nel genoma delle meduse. La GFP è la prima proteina utilizzata, ora ce ne sono decine con fluorescenza con lunghezze d’onda differenti.

Per inserirli in pianta si usa sempre l’Agrobacterium, si inserisce tra LB e RB il promotore di cui si vuole studiare l’attività seguito dal gene reporter.

Il plasmide, una volta che è stato ricostruito, verrà utilizzato per trasformare prima agrobatterio poi le piante, trasferendo il DNA presente nel pTi. Quindi saranno piante transgeniche in cui il promotore che vogliamo studiare sarà a monte del gene reporter. Si ottengono piante in cui il promotore trascrive il gene GUS che a sua volta verrà tradotto; si immette un saggio istochimico e si vedrà dove il gene è attivo perché le colorazioni saranno blu.

In modo simile succede con la GFP, in cui il promotore è a monte del gene reporter e si usa il DNA ricombinante per trasformare Arabidopsis.

Il gene reporter YFP fluorescente nel giallo si vede la localizzazione anche all’interno della cellula, ad esempio nel nucleo. Avere informazioni non solo tessuto-specificità del gene ma anche dov’è localizzata la proteina codificata da quel gene.

Infine si può confrontare l’attività del promotore, cioè dove il promotore regola la trascrizione del gene, e dove poi si trova la proteina. Molto spesso il trascritto di un gene e la proteina sono presenti nella stessa cellula. In alcuni casi la proteina può migrare in cellule adiacenti, come si vede nell’immagine: la prima dà idea del promotore mentre nella seconda dà l’idea della localizzazione della proteina ricombinante, c’è uno strato di cellule che presenta questa proteina ricombinante ben visibile che non corrisponde a dove il gene viene trascritto, quindi la proteina si muove nello strato adiacente.

Approcci genetici

In campo scientifico molti ricercatori condividono i mutanti che hanno ottenuto.

Si possono usare quindi facilmente approcci:

• Forward genetics -> dal mutante al gene.
• Reverse genetics -> partendo da un gene si studia la mutazione del gene e il fenotipo dello sviluppo.

Modello principale: Arabidopsis thaliana

Modello principale che utilizzeremo: Arabidopsis thaliana.

Essa ha una fase vegetativa di qualche settimana. Passa da una fase vegetativa a una produttiva formando un’infiorescenza, fiori ermafroditi perfetti, ha i 4 organi fondamentali: sepali, petali, stami, pistillo; continua a crescere durante tutto il suo ciclo vitale che è un ciclo annuale, ha una crescita indeterminata. Dopo che avviene fecondazione la piantina muore.

Tutto comincia con la formazione dello zigote. Tutte le piante terrestri sono briofite, fecondazione interna, e prima della fase adulta c’è sempre una fase embrionale. Organo riproduttore maschile: stame con l’antera; organo riproduttore femminile: pistillo per il contatto con i granuli pollinici all’apice, che contengono i gameti maschili, ovario in cui c’è un certo numero di ovuli. I gameti negli animali si formano per meiosi. Nelle piante i gameti vengono reiterati nel tempo e si formano solo in alcune condizioni ambientali: gametogenesi. Processo che si basa su mitosi, gameti aploidi, ma ci deve comunque essere un fase di meiosi. Nelle piante superiori c’è alternanza di generazione. La gametogenesi avviene per formare strutture pluricellulari aploidi: polline. La meiosi è necessaria per il dimezzamento del corredo cromosomico da diploidi ad aploidi. Il gametofito maschile contiene due cellule spermatiche nella parte apicale dell’organo riproduttore maschile, antera; c’è un’altra struttura che dà il tubetto pollinico che servirà a portare i gameti nell’organo riproduttore femminile. Per quanto riguarda la parte femminile nell’ovulo c’è una struttura pluricellulare aploide costituita da un certo numero di cellule aploidi e 2 cellule, cellula uovo aploide e cellula centrale diploide: gametofito femminile o sacco embrionale. La fecondazione conta sull’unione di 2 cellule femminili e 2 maschili.

• Primo evento di fecondazione: unione gamete maschile e gamete femminile aploide a zigote.
• Secondo evento di fecondazione: unione di gamete maschile e cellula centrale, si forma la prima cellula triploide del tessuto di riserva chiamato endosperma.

Il tutto è avvolto dai tegumenti dell’ovulo. Lo sviluppo dell’embrione deve avvenire in contemporanea allo sviluppo dell’endosperma e dei tegumenti. Se manca qualche evento tra questi non avviene la formazione del seme, che contiene l’embrione e rappresenta la progenie.