Biologia dello sviluppo vegetale

Embrione e sviluppo embrionale

Doppia fecondazione

Le due cellule spermatiche portate dal tubetto pollinico attraverso il micropilo vanno a fondersi una con la cellula uovo a dare l'embrione (2n) e una con la cellula centrale (2n) a formare l'endosperma (3n). L'endosperma è molto importante perché è il tessuto nutritivo per l'embrione e permetterà il suo sviluppo all'interno dei tessuti materni (tegumenti materni che permettono di far rimanere il seme in uno stadio quiescente finché non si trova in una condizione favorevole per la germinazione).

Embrione animale vs vegetale

L'embrione animale racchiude già delle caratteristiche basilari del piano del corpo (ben definiti gli assi di polarità) e ci sono già abbozzi della maggior parte degli organi e sistemi. Invece, l'embrione vegetale è decisamente più semplice, con una diversa strategia biologica data dal fatto che le piante sono organismi a crescita continua o indefinita e quindi capaci di dare origine a nuovi organi durante tutta la vita adulta grazie alla presenza di gruppi di cellule staminali residenti nei meristemi, pertanto non hanno bisogno di abbozzare organi necessari alla vita adulta durante lo sviluppo embrionale.

Sviluppo embrionale

• Embrione globulare
• Embrione a cuore
• Embrione a torpedine
• Embrione cotiledonare (maturo)

Lo sviluppo dell'embrione avviene lungo un asse epico-basale (calazzale-micropilare). Il numero di cellule aumenta, quindi abbiamo divisione cellulare continua e complessità crescente del numero di cellule formate dall'embrione, partendo dallo zigote fino all'embrione maturo. Alla fine dello sviluppo osserviamo anche una simmetria bilaterale.

Quando una cellula spermatica si fonde con la cellula uovo, si forma lo zigote e la prima divisione dello zigote è una divisione asimmetrica trasversale che ci dà un pattern longitudinale. Si forma una piccola cellula apicale e una lunga cellula basale. La divisione asimmetrica produce due cellule che adottano destini cellulari diversi.

La parte apicale è con citoplasma denso e sede di un'intensa sintesi proteica, mentre la parte basale contiene il vacuolo centrale che ne permette la distensione. La cellula apicale darà origine all'embrione e la cellula basale darà origine al sospensore (6-9 cellule) e all'ipofisi tramite divisione perpendicolare all'asse dell'embrione. Il sospensore connette l'embrione al sistema vascolare della pianta madre. Dopo lo sviluppo, il sospensore entra in morte programmata e l'unica cellula che rimane in vita è l'ipofisi, la cellula più apicale del sospensore.

La cellula uovo è polarizzata, quindi la divisione è simmetrica per polarità intrinseca, dovuta a ciò che è contenuto nella cellula. All'interno della cellula uovo c'è la segregazione dei determinanti da un lato apicale e basale che permette che il fuso mitotico venga allineato in un determinato modo e porta alla divisione asimmetrica.

Embrione e divisione cellulare

Nella cellula apicale, la prima divisione longitudinale porta a due cellule; a quattro cellule abbiamo la seconda divisione longitudinale, e passando da quattro a otto avviene una divisione trasversale che forma la parte apicale (che origina cotiledoni, meristema apicale del germoglio) dell'embrione e la parte basale (origina meristema apicale della radice e i tessuti della radice). Queste otto cellule subiscono una divisione periclinare e formano un embrione a 16 cellule, una delle fasi più importanti dello sviluppo. Avremo uno strato esterno di otto cellule e otto cellule interne. La parte più esterna è il primo tessuto che si forma nell'embrione, detto protoderma, che è ancora un tessuto meristematico ma con un grado di differenziamento un po' più avanzato rispetto alle altre cellule. Le otto cellule interne vengono dette tessuto interno. Inoltre, la cellula più apicale del sospensore diviene l'ipofisi, importante perché darà origine alla radichetta quando l'embrione germina.

Dopo l'embrione a 16 cellule, si passa all'embrione globulare in cui le divisioni continuano e l'embrione aumenta in numero cellulare sia nella parte interna che esterna. Quindi, nello stadio globulare abbiamo il differenziamento dei primordi dei principali tipi di tessuto, stabilimento dell'asse radiale e acquisizione di simmetria bilaterale.

Abbiamo una fase di transizione tra globulare e cuore e poi formazione del cuore. La fase di transizione è caratterizzata dal fatto che l'ipofisi si differenzia (meristema radicale) e inoltre avviene l'inizio dell'allungamento dell'embrione e si inizia a vedere un abbozzo di cotiledoni.

Nello stadio di cuore, l'embrione si allunga a causa della distensione cellulare, l'asse longitudinale e radiale è ben definito e la bilateralità è ben visibile. Nello stadio torpedine intermedio, lo stadio maturo vede la formazione in mezzo ai cotiledoni dell'apice vegetativo (meristema apicale del germoglio), ulteriore allungamento dell'asse embrionale e dei cotiledoni dovuto sia a divisione che a distensione cellulare. Abbiamo anche la formazione del centro quiescente e delle cellule della columella (meristema della radice). L'embrione occupa tutto lo spazio disponibile del seme. Abbiamo la presenza di piccole bozze fogliari.

Studio dell'embriogenesi

L'embriogenesi deve essere studiata sia attraverso lo sviluppo lungo l'asse longitudinale sia lungo l'asse radiale. Lungo l'asse longitudinale abbiamo cotiledoni e asse embrionale, meristema del germoglio al centro dei cotiledoni e in posizione più basale il meristema radicale. Lungo l'asse radiale abbiamo più esternamente il protoderma, il meristema fondamentale e il procambio.

Meccanismi coinvolti nello sviluppo

Uso di mutanti per trovare problemi di sviluppo, confrontare il mutante con una pianta wt e comprendere i meccanismi che stanno alla base dello sviluppo compromessi dalla mutazione.

Mutante Yoda: lo sviluppo embrionale è compromesso con mancanza di bilateralità, non si distingue bene né il sospensore né l'embrione stesso, ma solo un accumulo di cellule. Yoda è un gene che codifica per una proteina simile alla proteina Ste11p, questa è una MAPKK chinasi necessaria per la divisione asimmetrica. Es. a partire da una collezione di 13000 piante mutagenizzate tramite metodo chimico, vennero isolate 13 linee indipendenti che segregavano embrioni senza un sospensorio ben formato. (Genetica diretta). Yoda è implicato nello sviluppo embrionale. Si sono andate a guardare le varie fasi di sviluppo, si nota che in una pianta mutante Yoda non abbiamo la prima divisione asimmetrica trasversale ma la divisione è simmetrica. Quindi si è capito che Yoda era coinvolto nelle prime fasi dello sviluppo embrionale e più specificatamente nella prima divisione dello zigote. A sviluppo più avanzato vediamo che Yoda ha accrescimento cellulare della parte embrionale ma il sospensore non si divide. Divisione wt: 13 micron cellula apicale, 61 micron quella del sospensore, invece in Yoda l'apicale era 14 micron e quella del sospensore 16 micron. Quindi divisione simmetrica nel mutante. In assenza di Yoda non avviene la divisione asimmetrica.

Si possono utilizzare dei marcatori specifici per caratterizzare l'identità cellulare, quindi identificare un tipo di cellula. Inserendo nelle piante un marcatore specifico per il sospensore ptrak276s (promotore specifico con gene reporter GUS) si vede che nella pianta wt questo è espresso, invece nella pianta Yoda non esprimeva il promotore e quindi non presentava cellule identificate come sospensore. Nel mutante Yoda non avviene divisione asimmetrica e questo porta alla perdita del destino cellulare della cellula basale che avrebbe dato il sospensorio. 89% mancata espressione.

Un'altra mutazione del gene SSP portava a divisione simmetrica ma era leggermente diversa la divisione della cellula basale che è leggermente più lunga dell'apicale. Abbiamo però mutanti diversi, in alcuni c'è mancanza di differenziamento del sospensore, in altri ci sono piani errati di divisione ma che non portano a perdita di differenziamento. Si hanno diversi fenotipi perché le mutazioni chimiche su SSP portano a produrre proteine con mutazioni puntiformi e che quindi possono essere più o meno funzionali (es. se avvenivano in domini funzionali si osservava totale assenza di simmetria). Utilizzando un marcatore per il sospensore SUC3 in piante wt si osserva un segnale dal sospensore, invece in pianta mutante SSP non visualizziamo il marcatore per mancata espressione del marcatore nel sospensore.

Isolando SSP e facendo analisi di espressione a livello di mRNA si è visto che era espresso nel polline a livello delle cellule spermatiche, quindi espresso solo nella parte riproduttiva maschile. mRNA di SSP è localizzato a livello delle cellule spermatiche, studi di proteina hanno identificato SSP a livello dell'embrione. Durante la fecondazione e quindi la fusione di una cellula spermatica e la cellula uovo l'mRNA di SSP presente nel gamete maschile viene rilasciato all'interno della cellula uovo e così abbiamo traduzione della proteina nell'embrione. Quindi si può parlare di un controllo paterno sulla prima divisione dello zigote. Se SSP non c'è, non abbiamo mRNA e quindi non abbiamo proteina necessaria alla prima divisione nell'embrione.

Gametogenesi e fecondazione

Modello di studio: Arabidopsis thaliana

La fecondazione avviene tramite un'interazione tra una parte maschile e quella femminile.

Ciclo vitale delle angiosperme

Abbiamo un ciclo vitale aplodiplonte, cioè il ciclo è costituito da due fasi o generazioni differenti. La generazione sporofitica e quella gametofitica, queste due sono differenti perché lo sporofito è diploide e produce le spore aploidi per meiosi, invece il gametofito è apolide e deriva dalle spore per mitosi, esso produce i gameti per mitosi. Due gameti si fondono (fecondazione) e poi daranno lo zigote e poi lo sporofito per mitosi.

Strutture riproduttive

• Parte maschile (androceo):
  • Stame
  • Filamento
  • Antera
  • Granuli pollinici
• Parte femminile (gineceo):
  • Carpello
  • Stigma
  • Stilo
  • Ovario
  • Ovuli

Sviluppo dell'ovulo

Lo sviluppo dell'ovulo, che porterà allo sviluppo dei gameti femminili, viene suddiviso in due fasi:

1. Megasporogenesi
2. Megagametogenesi con formazione di gametofito e di conseguenza gameti

1. Gli ovuli si trovano all'interno del carpello; in Arabidopsis abbiamo due carpelli fusi che danno origine al pistillo. All'interno del carpello abbiamo la placenta nel centro e gli ovuli protrudono da essa come strutture finger-like (strutture 2n). Questi ovuli sono distinti in tre regioni: nucella, calazza e funicolo. All'interno della nucella una cellula diploide si differenzia e dà origine alla cellula madre della megaspora (questa diventa più lunga tramite distensione, il nucleo è più voluminoso). Questa andrà incontro a meiosi e si formeranno quattro spore. Solo una di queste quattro spore, quella più calazzare (più interna), sopravviverà mentre le altre tre degenerano.

2. Quella che sopravvive entra nella megagametogenesi. Questo processo è caratterizzato da diversi step, la spora sopravvissuta è detta megaspora funzionale e va incontro a tre cicli di mitosi, formando il gametofito femminile (otto nuclei ma sette cellule). Nella parte micropilare ci sono due cellule sinergidi, una cellula uovo, poi abbiamo una cellula centrale diploide costituita da due nuclei polari che si fondono, nel lato calazzare abbiamo tre cellule antipodali. Il vero e proprio gamete è la cellula uovo e le altre cellule sono cellule accessorie che hanno un ruolo nei processi di fecondazione. Il gamete è contenuto dal sacco embrionale e quest'ultimo è avvolto dai tegumenti. Il funicolo connette l'ovulo alla pianta madre, servendo al passaggio di nutrienti dalla pianta madre al gametofito. Fin da quando inizia la differenziazione e determinazione della cellula madre della megaspora c'è anche lo sviluppo dei tegumenti che nell'ovulo maturo saranno due esterni e due interni, e un endotelio che delinea il sacco embrionale.

Sviluppo dei granuli pollinici

I granuli pollinici sono formati da una cellula vegetativa e una generativa e avremo due processi:

1. Microsporogenesi
2. Microgametogenesi

1. All'interno delle antere ci sono quattro sacchi formati da una parte più esterna detta epidermide, poi l'endotessio, il middle layer e il tappetum che serve per dare nutrimento al sacchetto pollinico in cui si sviluppano i granuli pollinici. Nella prima fase, all'interno dell'antera, abbiamo la formazione della cellula madre delle microspore (2n). Questa tramite meiosi forma quattro spore, a questo punto nel tappetum viene prodotto un enzima capace di degradare il callosio e quindi degrada il callosio intorno alle microspore, liberandole. (Vs gameti femminili, qui non degenera nessuna spora).

2. Una volta liberate, le microspore vanno incontro a due mitosi e formano il gametofito, formato da una cellula vegetativa che darà origine al tubetto pollinico e una generativa che darà origine alle cellule spermatiche (2). Alcune specie come Arabidopsis saranno in questo stato già nelle antere, altre piante invece lo diventeranno con la formazione del tubetto pollinico.

Grazie a DAPI (4,6-diamidin-2-fenilindolo), colorante organico fluorescente che lega fortemente regioni del DNA ricche in sequenze A-T, è possibile seguire le diverse fasi di sviluppo del polline. Oppure possiamo utilizzare geni marcatori.

Nel caso dell'ovulo si possono utilizzare marcatori specifici per i diversi tipi di cellule che ci fanno differenziare i diversi tipi cellulari del gametofito.

Geni reporter

I geni reporter permettono di analizzare l'espressione di un gene di interesse. Il gene reporter ci permette anche di seguire una fase di sviluppo specifica. Il gene reporter più utilizzato per le piante è il gene reporter GUS, usato sempre per l'analisi del promotore, per vedere se il promotore è attivo o meno. Il gene viene evidenziato da una colorazione blu perché questo gene codifica per un enzima (beta-glucuronidasi) che a contatto con un substrato specifico riesce a metabolizzarlo e a darci questa colorazione. Viene trasferito nel genoma della pianta tramite un plasmide Ti nel cui Tdna abbiamo un promoter X che vogliamo studiare con a valle un gene GUS che ci permette di verificare quando il promoter sarà attivo perché trascriverà GUS. (Es. promotore attivo nell'ovulo + GUS, studio sviluppo ovulo).

Un altro gene reporter è GFP, proteina identificata nella medusa, che se eccitata da una radiazione nel campo dell'ultravioletto, ma anche nel visibile, emette una radiazione di colore verde. Attraverso l'inserimento di piccole mutazioni nella proteina, si sono ottenute proteine fluorescenti di colori diversi. Permette di fare imaging in vivo. La proteina GFP può essere usata per studiare espressione promotore (promotore del gene X - gene reporter GFP) oppure per sapere la localizzazione specifica delle proteine (promotore del gene X- sequenza codificante del gene X + gene reporter GFP).

Fecondazione

I granuli pollinici dell'antera vengono rilasciati e cadono sopra lo stigma, formando un tubetto pollinico (generato dalla cellula vegetativa) che si approfondisce nello stilo e poi nell'ovario. Il tubetto, raggiunto l'ovulo, entra e rilascia le due cellule spermatiche, di cui una si fonde con la cellula uovo formando lo zigote e l'altra si fonde con la cellula centrale formando l'endosperma (3n). Quindi si forma il seme, in cui abbiamo parte esterna di tegumenti di origine materna, endosperma (formato sia da madre che padre) e zigote.

1° esperimento su Torenia: spostando l'ovulo, il tubetto lo segue. Quindi qualcosa prodotto dall'ovulo serve da segnale per il tubetto pollinico per guidarlo verso l'ovulo.

2° esperimento: tramite ablazione con laser, che permette di eliminare in modo specifico un tipo di cellula, eliminarono una per una le cellule nel sacco embrionale e videro come questo influiva sul tubetto pollinico. Senza cellula uovo e cellula centrale, il tubetto pollinico arriva all'ovulo. Se si eliminano le sinergidi, il tubetto pollinico non viene più attratto. Se si elimina solo una sinergide, il tubetto viene attratto. Quindi sono le sinergidi che attraggono e guidano il tubetto. Quando avviene il rilascio delle cellule spermatiche, si ha la morte di una delle due cellule sinergidi per scoppio del tubetto, e la sinergide rimasta non attrae più altri tubetti per evitare la polispermia.

Il segnale che emettono le sinergidi è dato da un gruppo di geni altamente espressi nelle cellule sinergidi. Es. si sono isolate le cellule sinergidi e si è sequenziato il genoma per vedere quali geni erano espressi in queste cellule, e hanno visto che c'era una famiglia genica rappresentativa, ossia molto espressa: CRP- cysteine-rich polypeptides, in particolare LURE1 e LURE2. Per dimostrare che questi fossero i responsabili del direzionamento del tubetto, si sono sintetizzati questi peptidi segnale e si sono rilasciati in una piastra di Petri in cui c'erano granuli pollinici e si notava che essi producevano tubetto anche in assenza di ovuli.

Es. si sono isolati diversi mutanti per DIF1 che quindi non producono gametofito femminile. Ci sono cinque mutanti diversi in cui abbiamo lo stesso fenotipo. Questo ha reso possibile la comprensione e individuazione dei geni che permettono la formazione del gametofito femminile.