Biologia animale 4

Controllo/regolazione dell’espressione genica

Regolazione genica negli eucarioti

Le cellule di un organismo hanno tutte lo stesso genoma: insieme dei geni che caratterizzano un organismo (equivalenza genomica), ma le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente e sono finemente regolate da meccanismi di controllo.

Tutte le cellule hanno la stessa potenzialità genomica. La regolazione dell’espressione genica è fondamentale sia durante l’embriogenesi, in cui la cellula zigote deve iniziare a proliferare per dare l’embrione ma anche differenziarsi per avere comportamenti diversi e sintetizzare proteine diverse, ma anche nelle cellule adulte già differenziate durante la sua vita non sono prodotte sempre tutte le stesse proteine.

I geni possono essere:

• Geni ad espressione costitutiva (housekeeping): tutte le cellule esprimono questi geni sempre.
• Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili): geni presenti in tutte le cellule ma non sempre trascritti.
• Geni specializzati (espressi solo in cellule di tessuto-specifici, che a loro volta possono essere costitutivi o condizionali).

È evidente dall’analisi del trascrittoma: insieme di mRNA prodotti da una determinata popolazione cellulare; e del proteoma: insieme delle proteine prodotte da una determinata popolazione cellulare. È possibile che le cellule abbiano stesso trascrittoma con la sintesi degli stessi mRNA ma producano proteine diverse in base a se servono o no alla cellula.

Per comprenderla facciamo una parentesi sui procarioti.

Regolazione genica nei procarioti

• Finalità: rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali risparmiando il più possibile energia, quindi niente mRNA o proteine che non servano subito.
• Base fisiologica: la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente; pochi geni sono regolati, ognuno con il proprio meccanismo individuale, di induzione o di repressione; la traduzione è subito successiva alla trascrizione; gli mRNA hanno vita breve.

Due esempi di geni regolati nei procarioti: operone lac - inducibile (induzione della trascrizione dei geni strutturali da substrato) e operone triptofano - reprimibile (repressione della trascrizione dei geni strutturali da prodotto finale).

Operoni: complesso funzionale sul cromosoma batterico, comprende un insieme di geni e cioè più geni strutturali, un promotore, un operatore ed è preceduto da un gene regolatore.

Operone lac - inducibile

Gruppo di geni batterici adiacenti che codificano per gli enzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio (glucosio+galattosio disaccaride) e la cui trascrizione è selettiva inibita dal repressore lac. È una via catabolica (di degradazione) normalmente inattiva (non espressa/silente) che viene attivata (indotta) dalla presenza della molecola da degradare, il lattosio.

Se entra lattosio nella cellula esso dice di attivare la trascrizione di questo operone per il suo metabolismo. Operone policistronico, 3 geni strutturali qui codificano per 3 proteine per il metabolismo del lattosio.

• Lac Z: per la betagalattosilasi: scinde lattosio in glucosio e galattosio 82.
• Lac Y: galattoside permeasi: proteina di membrana che permette il trasporto del lattosio all’interno della cellula.
• Lac A: tiogalattoside acetiltransferasi.

In assenza di lattosio una proteina repressore, codificata da un gene repressore adiacente all’operone, si lega all’operatore (che non c’è negli eucarioti), e siccome essa è ingombrante copre parte del promotore e la RNA polimerasi non può legarsi bloccando la trascrizione di geni strutturali.

A monte di questo c’è la sequenza promotore (uguale negli eucarioti) dove si lega la RNA polimerasi.

Arriva lattosio nella cellula quindi ho bisogno degli enzimi. Un metabolita del lattosio, allolattosio, si lega alla proteina repressore in un sito allosterico allontanandola dall’operatore. A questo punto l’operone e il promotore sono liberi e si lega RNA polimerasi per cominciare trascrizione dell’operone.

Il promotore del gene è debole. Non basta che entri il lattosio nella cellula. È necessario che contemporaneamente anche i livelli di glucosio dentro la cellula siano bassi. Se i livelli di glucosio nella cellula sono bassi si va ad attivare l’enzima adenilato ciclasi che agisce sull’adenosina trifosfato, togliendogli due fosfati. Formazione di adenosinmonofosfato ciclico cAMP.

cAMP si lega con un attivatore, la proteina CAP e stimola il suo legame alle sequenze regolatrici dei vari operoni implicati nel metabolismo degli zuccheri. CAP interagisce con la subunità alfa della RNA polimerasi per facilitare il legame della polimerasi al promotore.

Il promotore debole per essere trascritto richiede il legame di un attivatore CAP che facilita il legame tra promotore e RNA polimerasi. La proteina CAP ha un suo sito di attacco a monte del promotore.

• Lattosio + glucosio -> sì repressore / no CAP.
• Lattosio + glucosio -> no repressore / no CAP.
• Lattosio – glucosio -> sì repressore / sì CAP.
• Lattosio - glucosio -> no repressore / sì CAP.

Operone acceso 83.

Operone triptofano - reprimibile

Gruppo di geni batterici adiacenti che codificano per gli enzimi per la sintesi dell’amminoacido triptofano. È una via anabolica normalmente attiva (espressa) che viene inattivata/repressa dalla presenza del prodotto degli enzimi codificati.

Operone è policistronico, 5 enzimi.

È attivo quando la cellula batterica deve sintetizzare triptofano perché i livelli sono bassi. La proteina repressore è inattiva ed è quindi incapace di impedire la trascrizione, non può legarsi all’operatore. L’RNA polimerasi si lega al promotore e si ha la trascrizione.

Quando i livelli intracellulari di triptofano sono elevati la trascrizione degli enzimi viene repressa. Il prodotto finale dell’azione degli enzimi, l’amminoacido triptofano, si lega ad un sito allosterico della proteina repressore che si attiva e si può legare all’operatore coprendo parzialmente anche il promotore che non viene riconosciuto dalla RNA polimerasi. Vi rimane legato finché il triptofano non sia di nuovo richiesto dalla cellula.

Promotore forte, quando la RNA polimerasi si lega al suo promotore funziona senza bisogno di altre proteine come l’esempio di prima.

Concetto: l’espressione di un gene è regolata da sequenze di DNA che stanno a monte di quel gene. Nel caso degli operoni dei procarioti ci sono due sequenze regolatrici a monte rispetto al sito di inizio della trascrizione: promotore e operatore. Sul promotore va la RNA polimerasi.

Capire questo ha reso possibile la comprensione di quello che avviene negli eucarioti dove il gene a monte ha solo promotore senza operatore.

Differenze:

• Eucarioti hanno genoma più vasto e complesso.
• Compartimentazione del genoma che nei procarioti non è compartimentato.
• Organizzazione strutturale del genoma.
• Modificazione post-traduzionale delle proteine (due cellule in cui ho stesso gene trascritto in RNA con stessa proteina ma in due cellule diverse una subisce trasformazione chimica e viene attivata mentre un’altra no).
• Stabilità dell’mRNA.

Regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Discorso più complesso. I meccanismi avvengono a livelli diversi nella via che va dal DNA alle proteine.

Finalità:

• Permettere il differenziamento cellulare.
• Risposta a messaggi che arrivano da altre cellule.
• Risposta a cambiamenti ambientali (molte sostanze chimiche nell’ambiente sono in grado una volta entrati nelle cellule di regolarne l’espressione genica). 84

Per passare da un gene a proteina funzionale passo attraverso tutti i meccanismi che sono i principali livelli di regolazione/espressione genica:

Nel nucleo

• Controllo genomico (meccanismi epigenetici): a livello della cromatina come la decondensazione della cromatina, la metilazione del DNA, l’acetilazione degli istoni. (Ora il gene è utilizzabile per l’espressione).
• Trascrizione: che è controllata da fattori di trascrizione (si forma il pre-mRNA) (da qui in poi si chiamano meccanismi post-trascrizionali). Importante perché i controlli operano per determinare quali geni vengono trascritti e per quanto tempo.
• Maturazione dell’mRNA (con lo splicing e altri eventi di maturazione). Importanti perché determinano quali parti dei trascritti primari entrano a far parte degli mRNA.
• Esportazione dal nucleo.

Nel citoplasma

• Traduzione dell’mRNA controllata da fattori di inizio e repressori della traduzione oppure degradazione dell’mRNA. (I polipeptidi sono sintetizzati) importanti perché determinano se un mRNA deve essere tradotto e per quanto tempo e quanto frequentemente.
• Post-traduzione: ci sono vari eventi come il ripiegamento e l’assemblaggio della proteina, il dislocamento in organelli o la degradazione.

1° livello - Controllo trascrizionale

RNA polimerasi II si deve legare alla TATA BOX (promotore costitutivo che si trova circa 25 nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) e intervengono fattori di trascrizione detti TFIID (TBP) e a seguire TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIIH (fosforila la RNA polimerasi II). Si forma il complesso basale di inizio trascrizione che si deve per forza formare se no la trascrizione non inizia.

A monte, a distanza variabile del promotore costitutivo (TATA BOX) possono essere presenti siti regolativi/altre sequenze regolatrici dette enhancer (intensificatori) o silencer (silenziatori).

I siti regolativi vengono riconosciuti da proteine che sono anch’esse fattori di trascrizione e vi si legano. Dal momento che enhancer e silencer possono essere lontani dal gene che regolano, la proteina insieme a coattivatori proteici induce un cambiamento conformazionale del DNA che forma un’ansa in modo che la proteina che ha attivato l’enhancer si trova a contatto con il complesso basale.

Se questo era enhancer la trascrizione inizia o aumenta velocità, se era silencer la trascrizione viene silenziata. In genere coinvolto anche un mediatore ovvero un altro coattivatore che facilita il corretto posizionamento dei fattori trascrizionali generali e la RNA polimerasi II a livello del promotore. Alcuni geni a monte della TATA BOX non hanno una sola sequenza regolatrice ma molte, a cui si legano proteine diverse fattori di trascrizione. 85

Un esempio di fattori di trascrizione sono i recettori degli ormoni steroidei.

In questo esempio, un ormone (un glucocorticoide) si lega a un recettore citoplasmatico, che migra nel nucleo e funge da attivatore della trascrizione. L’ormone entra nella cellula dal fluido extracellulare, diffonde attraverso il doppio strato fosfolipidico, entra nel citoplasma dove si lega a un recettore per glucocorticoidi.

Il legame dell’ormone cambia la conformazione del recettore e ne determina la traslocazione nel nucleo, dove agisce da fattore di trascrizione legandosi ad un elemento di risposta ai glucocorticoidi (GRE) del DNA. Il legame di due molecole adiacenti di recettore porta alla formazione di un dimero che attiva la trascrizione del DNA, portando alla sintesi di specifiche proteine nel citoplasma.

2° livello - Controllo post-trascrizionale

Controllo dello splicing alternativo.

Due cellule che esprimono lo stesso gene danno lo stesso pre-mRNA ma in esse questo può andare incontro a un processo di splicing diverso -> alternativo. Una sequenza di RNA che in una cellula è esone quindi mantenuta nell’mRNA maturo, in un’altra è considerata introne e viene tagliata. Ho isoforme proteiche, due proteine diverse.

3° livello - Controllo traduzionale

Controlla il grado e l’efficienza con cui gli mRNA sono utilizzati come stampo nella sintesi delle proteine.

In due cellule diverse è stato trascritto lo stesso gene, l’mRNA è maturato in modo uguale. Non è detto che venga tradotto nello stesso modo.

Esempio: ferritina (elementi IRE di risposta al ferro), proteina che ha il compito di legare il ferro nelle cellule.

Quando la concentrazione di ferro è bassa, una proteina repressore IRP (proteina regolatrice del ferro repressore), si lega ad una sequenza specifica nel 5’-UTR dell’mRNA per la ferritina, chiamata IRE, che è ripiegata a formare un’ansa a forcina situata a monte del codone di inizio.

Con questa proteina ingombrante i ribosomi non possono scorrere lungo l’mRNA che non può essere tradotto. Quando il ferro è disponibile, esso si lega a IRP modificandone la conformazione e causando la sua dissociazione dall’IRE; in tal modo, l’mRNA può essere tradotto in ferritina.

La lunghezza della coda di poli-A regolano la stabilità dell’mRNA e quindi ne regolano la traduzione. 86

MicroRNA

Meccanismo dei microRNA, miRNA ovvero piccole sequenze di RNA, 21-22 nucleotidi, che la cellula è in grado di attivare quando vuole attivare la traduzione di mRNA già presente e maturo nella cellula.

I geni che producono i microRNA sono inizialmente trascritti in molecole di RNA più lunghe dette, i pri-miRNA ovvero microRNA primari, che si ripiegano in forcine. Nel nucleo c’è un enzima detto DROSHA taglia i pri-miRNA in RNA a forcina più piccoli detti precursori dei microRNA, i pre-miRNA lunghi circa 70 nucleotidi.

I pre-miRNA sono esportati nel citoplasma dove DICER li taglia in microRNA maturi a singolo filamento rompendo i legami a idrogeno della lunghezza di 21-22 nucleotidi. Essi vengono associati a un complesso proteico RISC formando miRISC.

Ogni miRISC silenzia l’espressione degli mRNA contenenti sequenze complementari a quella del microRNA contenuto nel miRNA. Se i miRISC sono parzialmente complementari all’mRNA bersaglio si ha l’inibizione della traduzione, se invece sono completamente complementari si ha la degradazione dell’mRNA.

La presenza dei primi miRNA risale al 1993 nel C. elegans. 1998 Premio Nobel Fire e Mello che li descrivono. Solo nel 2001 se ne è compresa la funzione.

Fire e Mello mostrarono il meccanismo che permette all’RNA a doppio filamento di silenziare l’espressione di alcuni geni target specifici, meccanismo seguito dai virus che producono RNA a doppio filamento.

Loro creano delle sequenze di RNA a doppio filamento dsRNA - Double-stranded RNA (Il dsRNA costituisce il materiale genetico di alcuni virus (virus RNA a doppio filamento)). Nella cellula una ribonucleasi DICER taglia il dsRNA in tanti siRNA small-interfering RNA, corti frammenti a doppio filamento di 21-22 nucleotidi.

Meglio detti exo-siRNA in quanto sono introdotti in modo esogeno. Essi si combinano con un complesso proteico detto RISC (RNA-induced silencing complex, complesso di silenziamento indotto dall’RNA) che determina il degrado di uno dei due siRNA. Si forma un siRISC a singolo filamento.

Allo stesso modo di miRISC quando siRISC si lega al gene target per l’appaiamento delle basi complementari e ne determina l’inibizione o il degrado per opera di una ribonucleasi SLICER facente parte del RISC.

4° livello - Controllo post-traduzionale

La quantità di proteina dipende dalla stabilità dell’mRNA o della proteina stessa. Quando l’mRNA esce dal nucleo può essere degradato o tradotto. Qua