Bioingegneria chimica

Definizioni

• Biomateriale: sostanza non vivente utilizzata nella fabbricazione di un dispositivo medico che ha in qualche punto un'interfaccia con un tessuto vivente.
• Biocompatibilità: capacità di un biomateriale di determinare da una parte di un essere vivente una favorevole reazione alla sua presenza in una specifica applicazione.
• Biocompatibilità dei dispositivi a lungo termine: abilità del dispositivo di svolgere la sua specifica funzione, con il desiderato grado di incorporazione nel tessuto ospite, senza provocare alcun effetto locale o sistemico indesiderato.
• Biosicurezza: esclusione di possibili danni seri causati dal materiale a carico dell’ospite.
• Biofunzionalità: capacità del materiale di stimolare nell’ospite la risposta desiderata per la sua specifica applicazione.
• Biodegradazione: progressiva disgregazione di un materiale mediata da attività biologiche.
• Bioriassorbimento: processo di dissoluzione o di rimozione dovuto ad attività cellulare di un materiale inserito in ambiente biologico.
• Citotossicità: capacità di un materiale di provocare un effetto tossico a carico delle cellule che comporta una variazione della loro normale morfologia e fisiologia.
• Trombogenicità: proprietà di un materiale che induce la formazione di un trombo.
• Mutagenicità/carcinogenicità: capacità di una sostanza di causare anomalie geniche.
• Dispositivo medico: strumento, apparato, arnese, macchina, invenzione, reagente in vitro o un altro oggetto similare compreso ciascun componente, parte o accessorio per il quale è previsto l'uso in medicina.
• Organo artificiale: dispositivo medico che sostituisce in parte o completamente le funzioni di uno degli organi.
• Protesi: dispositivo medico che sostituisce un arto, un organo o un tessuto.
• Bioprotesi: protesi impiantabile costituita totalmente o sostanzialmente da un tessuto biologico trattato non vivente.
• Dispositivo percutaneo: dispositivo medico che passa attraverso la cute rimanendo in tale posizione per un significativo lasso di tempo.
• Impianto: dispositivo medico fabbricato con uno o più biomateriali posto intenzionalmente all'interno del corpo e totalmente o parzialmente inglobato al di sotto di una superficie epiteliale cutanea o mucosa.
• Graft: pezzo di tessuto vivente trasferito da una zona di un donatore ad una zona di un ricevente con lo scopo di ricostruire quest'ultima.
• Trapianto: struttura completa trasferita da una zona di un donatore ad una zona di un ricevente con lo scopo di ricostruire quest'ultima.

Interazione tra corpo umano e dispositivo medico

Il problema è l’interazione tra corpo umano e dispositivo medico, innanzitutto un dispositivo può essere totalmente impiantato, protesi d’anca, oppure percutaneo, protesi dentaria. Importante in questo ambito è quindi l’uso dei corretti biomateriali.

Biomateriali artificiali sintetici

• Metalli: + ottime prestazioni meccaniche; + buone tecnologie; - reazioni con l’ambiente circostante, liberano ioni.
• Polimeri: + estremamente biocompatibili; - perdita di massa molecolare.
• Ceramici: + estremamente duri; + inerti; + buona tecnologia; - molto fragili.

Rigetto: fenomeno che porta l’organismo ospite a chiudere i capillari che irrorano il nuovo organo.

Biomateriali naturali

• Viventi: trapianti, organo proveniente da un donatore umano, possibile rigetto; trapianti ingegnerizzati, organi cresciuti artificialmente, possibile rigetto; autocraft, cellule cutanee del paziente re-impiantate nello stesso, cellule autologhe.
• Non viventi: homograft, cellule prelevate da un donatore ma rese non viventi; eterograft, cellule prelevate da un animale ma rese non viventi.

Cellule trattate mediante tecniche che permettono di eliminare la parte vivente delle stesse mantenendo forma e struttura.

Sia homograft che eterograft presentano reazioni compatibili con quelle dei materiali polimerici.

Biocompatibilità

Capacità di un materiale di generare una risposta appropriata in un sistema ospitante data una particolare applicazione.

La ricerca del migliore dispositivo deve tener conto di alcuni fattori come:

• Destinazione e durata d’uso: se temporaneo, es. lenti a contatto giornaliere, periodico, es. lente a contatto mensile, o permanente, es. protesi d’anca.
• Risposta dell’organismo: se si verifica infiammazione, se il corpo cerca di rigettare il dispositivo, infezione, può verificarsi per i dispositivi percutanei, coagulazione, sangue coagula a contatto con qualsiasi materiale che non sia endotelio, o emolisi, rottura dei globuli rossi a causa di urti e variazioni di temperatura.
• Dispositivo: se la geometria è identica a quella della parte da sostituire.

L’interazione tra biomateriale e ambiente vivente avviene all’interfaccia tra i due, questo ci permette anche di avere una parte interna non biocompatibile, l’importante che tutto sia rivestito da un materiale biocompatibile.

Tipi di biocompatibilità

• Funzionale: adeguatezza alle specifiche di progetto.
• Biologica: interfaccia tra dispositivo e tessuto.
• Anatomica: forma, peso e ingombro.

Importante è quindi interazione tra il biomateriale e il corpo umano ed in particolare possiamo notare:

• Effetti impianto sull’ospite: abbiamo effetti locali come la carcinogenesi, le infezioni, le infiammazioni, la citotossicità, l’emotossicità e l’interazione con il sangue. Abbiamo però anche effetti sistemici come la formazione di emboli, le reazioni immunitarie, la sensibilizzazione allergica e la tossicità sistemica.
• Effetti ospite sull’impianto: abbiamo effetti fisico-meccanici come l’usura del materiale più morbido, la fatica, la corrosione e l’ossidazione. Abbiamo anche effetti biologici come l’adsorbimento di sostanze dai tessuti, la degradazione enzimatica e la calcificazione.
• Fenomeni alla superficie: adsorbimento superficiale di proteine, dispositivo coperto da uno strato proteico, il tipo di proteine adsorbite. È determinato dalle proprietà delle proteine presenti nei fluidi circostanti, adesione e attivazione cellulare, dipendono dal tipo di proteine adsorbite, dalla loro conformazione e dal riarrangiamento.

Valutazione della biocompatibilità

Per valutare la biocompatibilità si possono seguire due differenti procedimenti detti in vitro, test cellulari, e in vivo, impianti in modello animale. Generalmente quando si sviluppa un materiale i primi test vengono fatti in vitro e conseguentemente si passa ai test in vivo sugli animali anche se ancora non si avrà una corretta simulazione della reazione del corpo umano.

In vitro posso fare esperimenti senza cellule, cioè prendo il materiale, lo pongo in ambiente simile a quello biologico e controllo gli effetti, verifico la corrosione o la degradazione. Per capire però la biocompatibilità del materiale effettuo i test cellulari che sono regolati sia in vivo che in vitro dalla normativa ISO 10993.

Quando studio la risposta del materiale in vitro faccio test di:

• Citotossicità: il materiale non deve essere tossico per le cellule e il contatto cellule materiale non deve essere tossico.
• Mutagenicità o carcinogenicità: se il materiale fa mutare le cellule facendole diventare carcinomi.
• Emocompatibilità: sangue è il tessuto più critico, quindi effettuo test per verificare la citocompatibilità con il sangue. Devo evitare la morte cellulare, emolisi e coaguli.
• Biofunzionalità: valuto l’attacco cellulare, l’adesione cellulare, la proliferazione e le funzioni biosintetiche. Questo lavoro avviene grazie a tecniche di microscopia come la microscopia elettronica, studio la morfologia e l’adesione cellulare, o quella a fluorescenza, formazione di miotubi.

Quindi se le cellule reagiscono bene il materiale è biocompatibile se invece muoiono il materiale è tossico. Inoltre, se le cellule mantengono stessa forma e funzione vuol dire che il materiale non è citotossico. Le cellule che vengono utilizzate per questi test possono essere di due tipologie:

• Cellule primarie: cellule isolate da un materiale vivo tramite prelievo o biopsia. Hanno come vantaggio il fornire dei parametri biologici realistici mentre gli svantaggi sono la bassa riproducibilità e reperibilità.
• Cellule di linea o immortalizzate: derivate da culture primarie o manipolazioni genetiche come vantaggio hanno la riproducibilità, la reperibilità e la standardizzazione mentre come svantaggio hanno la risposta fornita che non è fisiologica.

Procedura per un nuovo materiale

Quando mi trovo davanti ad un nuovo materiale ho quindi una procedura da seguire che è la seguente:

• Lo pongo in ambienti con diverse t e diversi pH.
• Faccio test funzionali come i cicli di fatica e verifico se e cosa rilascia.
• Lo metto a contatto con cellule immortalizzate e valuto cosa succede.
• Testo il materiale in un piccolo animale con i test in vivo analizzando i tessuti biologici per comprenderne la biocompatibilità.

Una volta ottenuto il materiale devo crearne un oggetto e quindi assicurarmi che le tecnologie di lavorazione non alterino le proprietà del materiale. Se il materiale non viene modificato chimicamente passo a studiare la biocompatibilità funzionale e anatomica impiantando ad esempio la protesi nell’animale e controllando se riprendono le funzionalità. Se avviene questo si fa domanda all’FDA per l’utilizzo del materiale ed infine sperimento sull’uomo. Superata la sperimentazione che dura circa 10 anni per protesi e di più per i farmaci si può commercializzare il prodotto.

Test cellulari di citotossicità

I test cellulari possono essere chiamati di citotossicità diretta o indiretta.

• La citocompatibilità indiretta: è il primo test che viene effettuato, si prendono un po' di campioni del materiale e si mettono in una piastra di Petri, un vassoietto di plastica con vaschettine con coperchio. Si lascia il medium a contatto con il materiale per un certo tempo nell'incubatore a 37 gradi, questa temperatura è un vincolo. Controllo gli effetti dopo una settimana prendo il medium che è stato a contatto con il materiale e ci coltivo le cellule. Semino le cellule di linea e le coltivo su una vaschetta nuova, le faccio crescere e se il materiale ha rilasciato sostanze citotossiche queste cellule muoiono. Invece, se questo materiale non ha rilasciato sostanze citotossiche non vedo la differenza con l'inizio. Questo è il test di citotossicità indiretta perché non metto a contatto il materiale con le cellule ma uso il medium comune e viene fatto su n cellule.
• La citocompatibilità diretta: è un esperimento in cui il materiale che vogliamo valutare viene messo nella piastrina di Petri ma insieme a lui vengono coltivate sopra anche le cellule. Si usa il materiale, un medium nuovo e le cellule così da andare a valutare il contatto tra le cellule e il materiale.

Il materiale che rilascia di più è il polimero, in generale i materiali rilasciano ioni metallici, i metalli, che se sono pochi non creano danni, sono pericolosi se sono tanti. Monomeri, contaminanti, lubrificanti, stabilizzanti, plastificanti, antiossidanti sono sostanze che possono essere tossiche o non tossiche. Questi residui vengono fagocitati dai macrofagi che le inglobano all'interno della cellula. Quindi in generale materiali che rilasciano non vanno bene. D'altra parte, non esistono materiali che non rilasciano, quindi per minimizzare il rilascio devo pensare alla chimica.

Per capire poi se una cellula è viva o morta faccio le analisi colorimetriche in particolare tramite MTT che si lega alle cellule vive. Permette di visualizzare qualitativamente la distribuzione delle cellule. In particolare, si usano due metodi quello spettroscopico, misuro l’assorbenza del sale, cioè l’MTT ridotto, che aumenta con il numero di cellule vive, e quello alamar blue, i nuclei vivi sono blu quelli morti viola, guardo solo quale colore prevale.

Biocompatibilità in vivo

La vera biocompatibilità però è quella in vivo che viene valutata impiantando il dispositivo in materiale vivo. Appena impiantata la protesi ho la necessità di un periodo di guarigione detto processo infiammatorio al termine del quale non dovrei avere nessuna differenza nel materiale vivo rispetto a com’era prima dell’intervento. Il processo infiammatorio è una risposta fisiologica dell’organismo mediato da proteine e cellule. Ad esempio, nel caso di protesi d’anca se dopo circa 3 mesi ho ancora questo processo significa che la protesi non ha funzionato correttamente. Inoltre, può succedere che ci siano micromovimenti tra protesi e tessuto che lo accoglie che portano a far fallire la protesi a causa di una microdistruzione biologica oppure posso trovare l’osso non ben formato ma con un callo o una parte infiammata. Invece nel caso di protesi vascolare devo garantire che questa si deformi e inoltre un altro aspetto che può portare problemi è che questa è immersa in tessuto connettivo molle e quindi non sarà ferma rispetto al tessuto in cui è immersa.

Colture cellulari

Consiste nel mantenimento di cellule in laboratorio, i primi tentativi furono svolti nel ‘900 ma si ebbe un grande sviluppo negli anni ’50.

Prima cosa importante da fare è la classificazione delle cellule in base ad alcuni parametri:

• Presenza di nucleo: quindi procariote piuttosto che eucariote.
• Provenienza: quindi cellule primarie o cellule di linea continua.
• Meccanismo di crescita: quindi cellule ancoraggio dipendenti, colture in monostrato, o cellule in sospensione, colture in sospensione.
• Morfologia: abbiamo le cellule simil-epiteliali, aderiscono al substrato, appaiono piatte e di forma poligonale, le cellule simil-linfoblasti, non aderiscono al substrato, rimangono in sospensione e sono sferiche, e le cellule simil-fibroblasti, aderiscono al substrato, bipolari ed appaiono allungate.

Le colture cellulari possono essere usate in diversi campi: possono essere usate come sistemi modello, per lo studio di farmaci, processi d’invecchiamento, biocompatibilità, tumorigenicità e biologia molecolare, per la terapia cellulare o genica e nell’ingegneria dei tessuti.

Crescita cellulare

Come avviene la crescita cellulare?

Per prima cosa bisogna fornire periodicamente nuova superficie così che le cellule possano proliferare, in particolare quando le cellule sono nella log phase. La maggior parte delle cellule animali cresce in monostrato su un substrato solido, il processo può essere visto nel grafico e viene suddiviso in più fasi:

• Lag phase: fase durante la quale le cellule non si dividono, aderiscono al substrato.
• Log phase: fase di proliferazione in cui il numero di cellule cresce esponenzialmente.
• Stationary phase: quando la superficie a disposizione coperta la proliferazione rallenta fino a cessare, il numero di cellule rimane quindi costante.
• Death phase: se la coltura viene protratta ulteriormente nel tempo si arriva alla morte cellulare.

Un’altra importante fase è quella di espansione della popolazione cellulare, per prima cosa vi è lo scongelamento e la formazione di una sospensione di cellule che poi con la semina vengono trasferite in contenitori. Successivamente vi è una fase di incubazione fino a che le cellule raggiungano la semi-confluenza. Le cellule vengono distaccate e suddivise in piastre sulle quali vengono conservate per congelamento.

Importante è la conservazione cellulare che mantiene le cellule quiescenti e garantisce la presenza di scorte. Avviene nel seguente modo la sospensione viene conservata in criovials depositate in un contenitore per azoto liquido.

Medium per colture cellulari

Importante come abbiamo visto prima è anche il medium per colture cellulari che ha il compito di mantenere un ambiente biochimico simile a quello naturale, fornisce i nutrienti essenziali, mantiene costante il pH e fornisce anche un’indicazione visiva dello stato di salute delle cellule. Il medium base è composto da amminoacidi, carboidrati, vitamine, sali e elementi in tracce. A questo vengono poi aggiunti additivi come la glutammina, antibiotici, siero, fattori di crescita, ormoni, o amminoacidi non essenziali.

Una volta che le cellule sono nel terreno di coltura il mantenimento delle condizioni vitali viene garantito da un incubatore per colture cellulari che va a controllare temperatura, umidità relativa e composizione atmosferica. Tramite questo si può controllare anche il pH, le colture cellulari infatti liberano molti ioni H+ generando acidificazione, per risolvere il problema si usa un sistema tampone che mantiene il pH nonostante il rilascio di ioni e quello più usato è a base di bicarbonato.

Infine, un ultimo importante parametro da mantenere è la sterilità cioè la totale assenza di batteri e altri microrganismi. Le principali fonti di contaminazione sono il contatto con attrezzi non sterili, errori accidentali e l’ingresso di particelle per via aerea. Per preservarla si usano filtri, incubatori, strumenti sterilizzati in autoclave e la cappa a flusso laminare. Quest’ultima è una cappa ventilata aperta frontalmente con vetro protettivo, va a filtrare l’aria trattenendo il 99,97% delle particelle, però non sterilizza semplicemente evita la contaminazione.

Le proteine

Sono numerose e fondamentali nel corpo umano, sono utilizzate per creare biomateriali, sono un materiale biologico, autograft, se sottoposte a sterilizzazione possono essere usate come matrice, e sono lo strumento di comunicazione tra cellule.

L’unità funzionale ovvero il monomero sono gli amminoacidi.

Sono tra di loro differenziati dal gruppo laterale R.

Possono essere:

• Positivi, lisina, arginina, istidina.
• Negativi, acido aspartico, acido glutammico.
• Neutri, serina, treonina.
• Casi speciali, glicina.
• Idrofobici o idrofilici.

Il punto isoelettrico, pl, è il pH a cui la concentrazione