Biochimica Metabolica

Biochimica metabolica

Alessia Cafarelli

Facoltà di medicina e chirurgia

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Carboidrati

Disaccaridi

• Maltosio: 2 Glucosio. 1-4' .bd a/bD
• Lattosio: Galattosio + glucosio. 1-4' .a bD b- a
• Saccarosio: D glucosio + fruttosio. 1-2'.b-1-4'
• Cellobiosio: Glucosio + glucosio

Polisaccaridi

• Amido: D glucopiranosio. Amilosio ha legami, amilopectina
• Glicogeno: 1-4 e 1-6
• Cellulosa: Glucosio

Enzimi

Chaperonine

• I classe: Hsp70 e Hso90
• II classe: GroEL e GroEs nei procarioti, Hsp50/10 negli eucarioti

PDI: proteina disolfuro isomerasi, rimescola ponti disolfuro

PPI: prolin-cis isomerasi, interconversione cis-trans dei legami della prolina

Amiloidosi

• Primaria: fibrille di catena leggere di immunoglobuline. Reni e cuore
• Secondaria: mutazioni della transretina (si lega a ormoni tiroidei), IAPP (amilina nelle isole pancreatiche)
• Alpha-sinucleina forma corpi di Lewy nel Parkinson

Regolazione dell'emoglobina e della mioglobina

Saturazione frazionale a una pO₂: YO₂ =

Anidrasi carbonica negli eritrociti: CO₂ + H₂O ⇌ H⁺ + HCO₃^-

Cafarelli Alessia His 93 (F8, prossimale), His 64 (E7, distale)

Curva di saturazione spostata a destra (O₂ rilasciato facilmente):

• H⁺ che si lega per l’effetto Bohr a His146 (HC3) e Asp94 (FG1)
• 2,3 BP glicerato stabilizza struttura T
• CO₂
• HbS di anemia falciforme

Curva di saturazione spostata a sinistra (O₂ rilasciato difficilmente):

• Bassi livelli di 2,3 BPG
• HBF, in cui His143 è sostituita da Ser

Enzimi legati alle vitamine

• Vitamina B1: Tiamina pirofosfochinasi trasforma tiamina in TPP (tiamina pirofosfato)
• Vitamina B9: Diidrofolato reduttasi trasforma folato prima in diidrofolato, poi in THF. Metotrexato è antimetabolita usato nel cancro che la inibisce
• Vitamina D: Enzima 25-idrossivitamina D-alpha-idrossilasi nei tubi convoluti prossimali trasforma 25-Hdrossivitamina in 1,25-Hdrossivitamina
• Vitamina K: Epossido reduttasi attiva K trasformandola in idrochinone. Inibita da warfarina
• Vitamina C: Prolina idrossilasi trasforma prolina in idrossiprolina

Legami crociati nel collagene (lisina-lisina)

Lisil idrossidasi (forma allisina), prolin-3-idrossidasi e prolin 4-idrossidasi

Classi di enzimi

• Ossidoreduttasi
• Transferasi
• Idrolasi
• Liasi
• Isomerasi
• Ligasi

Regolazione di alcuni enzimi

• Fosfofruttochinasi 1 regolata negativamente da ATP
• Tripsina fa il primo taglio proteolitico della chimotripsina, il secondo dalla stessa chimotripsina
• Glucosio ossidasi: usato per misurare glicemia attraverso misura colorimetrica
• Anidrasi carbonica: CO₂ + H₂O ⇌ H₂CO₃
• L’acetil salicinico (aspirina) inibisce la ciclo-ossigenasi

NAD

• Ossidazione del lattato: lattato deidrogenasi. OH del lattato ossidato a gruppo chetonico
• Riduzione del piruvato: con His195 e Arg 171. Gruppo chetonico trasformato in gruppo alcolico

Cinetica di Michaelis Menten per enzimi monomerici

½ V_max = k_MV_max [S]V₀ = k_M + [S]

Meccanismo d’azione di alcuni enzimi

• Lattato deidrogenasi (LDH): Riduzione dell’acido piruvico ad acido lattico
• Chimotripsina (serina proteasi): ha Asp 102, His 57 e Ser 195. Rottura di proteina
• Aspartato proteasi: categoria che comprende pepsina (monomero), proteasi dell’HIV (dimero) e transaminasi (monomero). Attaccano prima di tutto le proline
• Pepsina: contiene Asp 32 (basico) e Asp 215 (acido). Usa H₂O
• Transaminasi + piridossale fosfato: mediano trasferimento di amminogruppo di amminoacido su un chetoacido
• Glucosio 6 fosfato deidrogenasi: ossidazione del gruppo aldeidico di monosaccaridi in gruppo carbossolico (acidi aldonici)

α-Amilasi salivari e pancreatiche

• Scindono legame alpha 1-4 dell’amido in due alpha-D-glucopiranosio
• Contengono glutammato 233 e aspartato 197
• 5 isoforme: 3 salivari (geni AMY1A-C) e 2 pancreatiche (geni AMY2A-B)
• Idrolasi Endoglicosidasi: attaccano estremità riducenti
• Sono prodotte attive (Proteasi digestive si attivano solo nel duodeno)
• Quando chimo acido arriva nel duodeno, secretina e colecistochinina promuovono secrezione del succo pancreatico
• Richiedono ioni calcio e cloro

MGAM: Maltasi-glucoamilasina N-glicosilata a singolo passo. Esoglicosidasi: attacca estremità non riducente di maltosio o destrine. Mantengono configurazione anomerica.

Saccarasi-isomaltasi (SI)

• Isomaltosio: disaccaride di due alpha-D-glucopiranosio con legame alpha 1-6
• Saccarosio: Glucosio + fruttosio. Legame alpha glucosio 1-2 fruttosio
• Mantengono configurazione anomerica

Lattasi

Scinde lattosio in D-galattopiranosio e D-galattopiranosio. Legame beta 1-2 glicosidico (o alpha). Lattosio prodotto solo dall’epitelio delle ghiandole mammarie sotto stimolo della prolattina.

Trasportatori SGLT e GLUT

Trasportatori SGLT

• SGLT 1: 1 negli eritrociti, 2 nel tubulo renale. Trasporto attivo secondario di glucosio e galattosio insieme a 2 Na. Km per glucosio di 0.1-0.6 mM
• SGLT 2: nel tubulo renale prossimale. Km di 50-100 volte più alta di SGLT1
• Florizina inibisce SGLT1-2
• ATPasi: pompa di tipo P. SGLT accoppiati a Na, dal lume verso il citoplasma. Inibita dal vanadato (analogo dello stato di transizione)

Trasportatori GLUT 1-12

• Geni SLC2A. Inibiti dalla citocalasina B. Trasporto facilitato bidirezionale
• GLUT 1: km tra 1 e 3 mM. Unico trasportatore degli eritrociti. Lavora in Vmax a digiuno per il glucopiranosio. Ubiquitario
• GLUT 2: sempre presente in membrana latero-basale di enterociti (solo nelle fasi iniziali della digestione si trova anche in membrana apicale), degli epatociti e delle isole Beta del pancreas. L’insulina lo allontana dalla membrana apicale. Trasportatore passivo, coadiuva SGLT1. Km di 15 o 20 mM
• GLUT 3: trasportatore del tessuto nervoso. Permette il superamento della barriera emato-encefalica
• GLUT 4: km di 5 mM. Sensibile a insulina che lo recluta in membrana dei miocardiociti grazie a AMP-K (chinasi dipendente da AMP) tramite vescicole di endocitosi. Sotto sforzo viene reclutato in membrana dei miocardiociti perché aumenta AMP e si attiva la glicolisi
• GLUT5: per fruttosio. Livello apicale, passivo. Km di 10/15 mM. Fruttosio esce da membrana basale con GLUT 2

Via dell’esocitosi alternativa ai trasportatori

• Glucosio 6 fosfato traslocasi 1 (G6PT1): trasforma glucosio in glucosio 6 fosfato e lo trasloca nel RE. Gene SLC37A4. Può anche trasportare galattosio
• Glucosio 6 fosfatasi: idrolizza G6P nel RE. Esocitosi del glucosio ai tessuti attraverso il circolo portale e da qui al fegato. Poi dal fegato va al circolo sistemico

Glicolisi

Prima reazione: fosforilazione del glucosio. Irreversibile.

Esochinasi I-III e GK (Glucochinasi nelle cellule beta del pancreas e epatociti). ES II espresso soprattutto nei tessuti sensibili a insulina. Hanno Aspartato.

• Glucosio + ATP + Mg → glucosio 6 P.

Destini del G6P: glicolisi, sintesi di glicogeno o via del pentoso fosfato.

Seconda reazione: isomerizzazione del glucosio 6P in F6P

Fosfoglucosio isomerasi (GPI). Lisina e glutammato.

• G6P F6P.

Destino del F6P: glicolisi, sintesi di UP-N-acetilglucosammina o isomerizzazione in Mannosio 6P. F1,6 BP può diventare UDP-N-acetilglucosammina grazie a GFPT1/2 (glucosamminafruttosio 6 fosfato amminotransferasi) con transamminazione in cui glutammina dona NH₂. Reazione avviene grazie ad altre 2 transferasi e 1 isomerasi. Si forma in mezzo chetammina.

• L-glutammato Glutammina (GLU) + F6P e D-Glucosammina 6P.
• D-GLU 6P + CoA → 2N-acetilglucosammina + UTP + isomerasi UDP-N-Glucosammina.

Terza reazione: fosforilazione del F6P in F 1,6 BP. Irreversibile.

Fosfofruttochinasi 1. Nel muscolo è omotetramero, negli eritrociti eterotetramero.

• F6P + ATP → F 1,6 BP + ADP

Quarta reazione: scissione aldolica

Fruttosio-bifosfato aldolasi.

• F 1,6 BP gliceraldeide 3P (GAP) e diidrossiacetone fosfato (DHAP).

Destini del DHAP: isomerizzazione in GAP, produzione di trigliceridi nel fegato o di fosfolipidi nei tessuti.

Reazione 5: isomerizzazione dei triosi

Trioso fosfato isomerasi (TIM). His95 e Glu165.

DHAP → GAP. DHAP ha diversi destini:

• Isomerizzazione in GAP
• Produzione di trigliceridi (trasformato in glicerolo-3P trasformando il gruppo chetonico in alcolico)
• Produzione di fosfolipidi in tutti i tessuti.

Reazione 6: fosforilazione della GAP

Gliceraldeide 3 P deidrogenasi.

• 1,3G3P + NAD + HPO₄ ⇌ tiosemiacetale tioestere BPG + NADH + H

Il fosforile ad alta energia libera di idrolisi è in C1 nell’1,3-BPG.

Reazione 7: prima fosforilazione a livello del substrato

PGK (Fosfoglicerochinasi). SN2 sul fosforo.

• 1,3 BP Glicerato → 3 P glicerato.

Reazione 8: isomerizzazione del 3 fosfoglicerato in 2-fosfoglicerato

Fosfoglicerato mutasi (è attiva quando fosforilata). Agisce come un Fosfoenzima in condizioni di riposo, come defosfoenzima quando si forma l’intermedio 2,3 BP glicerato.

• 3 fosfoglicerato → 2 fosfoglicerato.

Deviazione della glicolisi negli eritrociti dopo la reazione 8

2,3 BP glicerato è presente in 5 mM negli eritrociti. Negli eritrociti c’è anche la Bifosfoglicerato mutasi che converte il 1,3 BP glicerato in 2,3 BP glicerato. La bifosfoglicerato mutasi è bifunzionale: diventa anche BPglicerato fosfatasi e catalizza idrolisi del fosforile in 2. ATP totale = 0.

Reazione 9: formazione del fosfoenolpiruvato (PEP)

Enolasi. Lys 345 e Glu 211.

• 2 Fosfoglicerato → PEP

Enolasi è inibita dagli ioni Fluoruro (F^-).

Reazione 10: formazione della seconda ATP e trasformazione di PEP in piruvato. Irreversibile.

Piruvato chinasi.

• Fosfoenolpiruvato + Mg → piruvato.

Regolazione della glicolisi

GLUT2 trasporta glucosio fuori dalla cellula. ESOCHINASI I-III DELLA REAZIONE 1 Km di 0.1 mM. Monomerici, agiscono su glucosio, fruttosio e mannosio. Inibizione retroattiva da G6P. Cinetica iperbolica.

• Esochinasi II è inibita dal glucosio 6P, GK non è inibita dal G6P.

Glucosiochinasi (E.C. 2) della reazione 1 negli epatociti

Km 8-10 mM. Saturata a 20 mM. Cinetica sigmoidale, attività cooperativa.

Esochinasi del fegato

Esochinasi del fegato non vengono inibite. La Reazione 1 avviene sempre. GS: glicogeno sintasi. Modulata positivamente da G6P. Attivata da insulina. Sotto stimolo del glucagone viene attivata la glicogenolisi.

Regolazione della GKPR

GKPR: proteina di regolazione della GK. Sotto 5 mM GKPR si lega a GK non covalentemente e la sequestra nel nucleo. F6P stabilizza. Glucosio e fruttosio 1P destabilizzano legame.

Regolazione della PFK1

F6P è modulatore omotropico positivo, effetto cooperativo.

Effettori allosterici negativi che stabilizzano conformazione T di PFK1:

• ATP
• Citrato
• Acil CoA a lunga catena

Effettori allosterici positivi che stabilizzano conformazione R di PFK1:

• AMP, prodotto da adenilato chinasi (2 ADP → AMP + ATP)
• F 2,6 BP. Riduce affinità per citrato e ATP

Il Fruttosio 2,6 BP è modulatore di due enzimi:

• È Attivatore eterotropico positivo di PFK1 (glicolisi)
• È Inibitore allosterico negativo (eterotropico) di FBPasi 1

FBPasi 1: 1,6 BP + H₂O → F6P + HPO₄. Gluconeogenesi.

Enzima tandem: può agire come PFK2 o come FBPasi 2

• PFK2: F6P + ATP → F2,6 BP + ADP
• FBPasi 2 (fruttosio 2,6 bifosfatasi): F2,6 BP + H₂O → F6P + HPO₄

La Fosforilazione dell’enzima tandem sulla Ser 32 attiva l’attività FBPasi. PKA. La Defosforilazione su Ser 32 attiva l’attività PFK2. Da parte di Enzima PP2A (proteina fosfatasi 2A). Insulina promuove la defosforilazione dell’Enzima tandem (attiva PFK2) e attiva allostericamente la AMP fosfodiesterasi PDE (cAMP + H₂O, diminuzione di cAMP inattiva PKA). Nella fase postprandiale tandem sta producendo 2,6 BPGL che attiva PFK1 e glicolisi.

Glucagone o epinefrina/adrenalina promuovono:

• Fosforilazione di tandem (attiva FBPasi2)
• Demolizione di glicogeno
• Attiva adenilato ciclasi (ATP → cAMP + Pirofosfato)
• Il cAMP attiva proteine G e la Protein chinasi A PKA (serina proteina chinasi)

Regolazione della glicolisi nel muscolo e tessuto adiposo

PFK1 M attivata da aumento di F2,6P nel citosol. Sequenza di PFK2 1-32 non fosforilabile, rimane PFK2.

Regolazione della glicolisi nel tessuto muscolare miocardico

Fosforilazione di tandem su Ser466 e Ser 483 sul C-terminale attiva PFK2 (non ha glicogenolisi), indotta da:

• Insulina (via del PI3K)
• Adrenalina (via del PKA)
• AMPK innalza PFK2

Regolazione dell’insulina e glucagone

Defosforilazione (PFK2) dell’enzima tandem indotta da:

• Insulina attiva PDE (fosfodiesterasi) che idrolizza legame del cAMP che diventa AMP (non può più attivare FBPasi2)
• PP2A che risponde all’aumento della concentrazione del modulatore positivo xilulosio 5-P
• Iperglicemia, infatti si favorisce glicolisi
• F6P diventa F2,6 P

Glucagone in ipoglicemia:

• Attiva subunità alpha di proteina G trimerica che attiva adenilato ciclasi
• Il cAMP prodotto attiva PKA (Serina/treonina chinasi)
• Si attiva FBPasi 2

Attivazione della PKA (Ser/Thr chinasi)

Glucagone o epinefrina si legano a recettore, esso attiva proteine G. G alpha stimolatrice attiva adenilato ciclasi idrolizza ATP. Adenilato ciclasi e PKA sono inattivate da insulina.

Regolazione della piruvato chinasi e della decima reazione della glicolisi

Inibitori allosterici:

• ATP
• Alanina nel fegato. Inibisce glicolisi
• Acetil-CoA

PK attivata da:

• F1,6 BP
• AMP (quando viene usato tanto ATP)

Quando PK viene fosforilata la sua attività diminuisce perché aumenta l’affinità per gli inibitori. Viene fosforilata in condizioni iperglicemizzanti. Fosforilazioni da PKA, defosforilazioni da PP2A.

Glicogenosintesi

Glicogeno sintasi muscolare (1) è inibita dal glicogeno stesso. GS 2 (epatica) non è inibita dal glicogeno.

Reazione 1

Fosfoglucomutasi (isomerasi, classe 5). Attiva quando è fosforilata su serina.

• G6P → G1P.

Reazione 2 (irreversibile)

UDP-glucosio pirofosfatasi o 1-fosfato uridil transferasi

• G1P + UTP → UDP-glucosio + Pirofosfato

Lo ione pirofosfato verrà idrolizzato dalla pirofosfatasi.

Reazione di innesco della glicogenosintesi

GS incorpora 8-10 residui di glucosio nel glicogeno. La catena di 10 residui è costruita da glicogenina (GN). Agisce trasferendo glucosio dall’UDP-glucosio legato al residuo di Tyr195 (in GN1 nei muscoli) o Tyr 228 (in GN2 nel fegato). Le due subunità alpha 1 e 2 sono sia substrato che transferasi.

Fase di allungamento

GS trasferiscono residui di glucosio dall’mUDP-glucosio all’estremità non riducente. GS attivata da G6P.

Reazione di ramificazione

Enzima ramificante amilo (1-4), (1-6) transglicosidasi. Trasferisce una catena lineare di 7 residui di glucosio da una catena di 11 a un gruppo alcolico primario sul C6. Si forma legame alpha 1-6.

Rigenerazione dell’UTP

Nucleoside difosfato chinasi. Fosforila His in N5.

• ATP + UDP → ADP + UTP

Regolazione della glicogenosintesi

Attivazione della GS

GS A: forma attiva e non fosforilata. Forma R ad alta affinità. GSB: forma inattiva e fosforilata da GSK3 sulle Ser 641-645-649-653. Forma T a bassa affinità. Attivazione di GS per:

• Modificazione allosterica del G6P. Nei muscoli insulina aumenta trascrizione di GLUT4
• Fase post-prandiale
• Defosforilazione indotta da insulina

Fasi della Defosforilazione (attivazione) di GS indotta da insulina:

1. Attivazione di PP1 che usa 3 H₂O
2. Inattivazione della glicogeno sintasi 3 chinasi (GSK3 che usa di solito 3 ATP)
3. Attivazione della PDE che idrolizza il cAMP
4. Attivazione di PP1 (che rimuove fosforilazioni)

Inattivazione di GS indotta da:

• Glicogeno
• Fosforilazione indotta da glucagone e epinefrina

Fasi della fosforilazione di GS:

1. Inibizione di PP1 da parte di PKA
2. Cascate di fosforilazione da parte di PKA, AMPK, caseina chinasi 2 (CK2) e GSK3

PP1 defosforila:

• GS, attivandola
• Glicogeno fosforilasi, inattivandola
• Glicogeno fosforilasi b chinasi, inattivandola

Un destino di UDP – glucosio: diventare acido glucuronico

UDP-glucosio deidrogenasi (UGDH) trasforma UDP-glucosio in acido glucuronico.

• UDP-Glucosio + 2 NAD + H₂O → UDP-D-acido glucuronico + 2 NADH + 3H

La via del pentoso fosfato

Via ossidativa. Attiva in tessuti lipogenici, tessuti stereogenici e ghiandola mammaria durante la lattazione.

Reazione 1 (prima fase)

Glucosio 6 P deidrogenasi (NADP⁺ dipendente)

• D glucopiranosio 6P (semiacetale intramolecolare)+ NADP → delta lattone del 6 fosfogluconato+ NADPH

Reazione 2

6-fosfogluconolattonasi (necessita di Mg) è idrolasi.

• d-lattone del 6 fosfogluconato → 6 fosfogluconato

Reazione 3: decarbossilazione ossidativa di 6-fosfogluconato

6 fosfogluconato deidrogenasi (NADP⁺ dipendente)

• 6 fosfogluconato + NADP → 1,2 enediolo ribulosio 5 P + NADPH

Reazione 4 (seconda fase): isomerizzazione cheto