Biochimica I – Proteine

Proteine: funzioni generali

Strutturale: mantenimento della morfologia delle varie strutture, compresa l’impalcatura cellulare. Collageno, cheratine, elastina.

Dinamica: proteine di trasporto (emoglobina), enzimi.

Traduzione di energia: trasformazione da una forma di energia ad un’altra. ATPasi, pompe ioniche, actina/miosina.

Difesa immunitaria: immunoglobuline (anticorpi).

Alimentare: amminoacidi essenziali.

Proteine oligomeriche, monomeriche, funzionali, strutturali.

Proteine semplici: solo amminoacidi.

Proteine coniugate: associate ad altre entità ioniche o molecolari.

Struttura delle proteine

La struttura di una proteina è una sola ed è quella nativa, che è corrispondente alla sua funzione biologica e quindi se viene alterata pregiudica la funzione biologica della proteina.

Struttura primaria: numero di residui aminoacidici nella loro sequenza.

Struttura secondaria: conformazione assunta dai tratti di catena polipeptidica; tali conformazioni sono date dalle interazioni deboli che si stabiliscono tra i vari amminoacidi e dunque dipendono dalla sequenza amminoacidica, in natura si sono affermate quelle a più basso contenuto di energia libera. Abbiamo:

• Alfa elica
• Foglietto beta

Una proteina può assumere nei diversi tratti diversi tipi di conformazioni, in alcuni tratti può avere una conformazione del tutto casuale.

Struttura terziaria: la struttura tridimensionale complessiva assunta dall’intera catena polipeptidica data dal ripiegamento e dall’interazione tra le diverse strutture secondarie. Struttura globulare in cui è presente un’alternanza di andamenti ordinati e random.

Struttura quaternaria: è una struttura oligomerica di tipo funzionale. Aggregazione funzionale di vari monomeri, in cui ogni monomero influisce sull’attività di quello accanto, conferendo carattere cooperativo.

Amminoacidi

Struttura degli amminoacidi

I monomeri che costituiscono le proteine sono gli α-amminoacidi. Il gruppo amminico è legato al carbonio adiacente al gruppo carbossilico, sono legati a un atomo di H e ad una catena laterale R che è diversa per ogni amminoacido.

La struttura generica degli amminoacidi ordinari è la seguente:

COOH
|
H-C-R |
NH₂

Per eliminazione di una molecola di acqua, il gruppo amminico di un amminoacido può legarsi al gruppo carbossilico di un altro.

H₂N-CH-COOH + H₂N-CH-COOH --> H₂N-CH-CO NH-CH-COOH + H₂O
I I I I
R R R R

Il legame che unisce due amminoacidi, evidenziato in rosso, prende il nome di legame peptidico. Una catena di più amminoacidi legati attraverso legami peptidici prende il nome generico di polipeptide; uno o più polipeptidi, a volte accompagnati da altre molecole ausiliarie, costituiscono una proteina.

Stereochimica degli α-amminoacidi

Un atomo di C è detto chirale o centro di chiralità o stereocentro o carbonio asimmetrico se legato a 4 sostituenti diversi. Se una molecola contiene un carbonio asimmetrico può avere 2 possibili stereoisomeri distinguibili detti enantiomeri. Gli enantiomeri L e D possono essere distinti perché in soluzione ruotano il piano della luce polarizzata in direzioni opposte.

Tutti gli amminoacidi tranne la glicina (2 dei gruppi legati al C sono uguali) possono esistere nella forma D o L.

Tutti gli amminoacidi incorporati dagli organismi nelle proteine sono nella forma L.

Proprietà delle catene laterali degli aminoacidi

Sono venti e vanno considerati in gruppi:

• Amminoacidi alifatici: hanno un gruppo R alifatico con la catena che è crescente in termini di C. Glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina.
• Amminoacidi con catene laterali contenenti zolfo o gruppi ossidrilici: sono più idrofilici degli alifatici. Serina: funzione alcolica e interviene nelle reazioni di esterificazione; metionina: è un amminoacido essenziale, è il donatore di gruppi metilici, senza l’apporto necessario si instaurano patologie (anemie…); cisteina: si distingue per 2 aspetti, la catena laterale si dissocia a pH elevato; tra le due catene laterali di cisteina si può avere un’ossidazione che porta alla formazione di un ponte disolfuro, il prodotto di quest’ossidazione è detto cistina, maggiore è la quantità di cisteina, maggiore è la compattezza della proteina; treonina.
• Amminoacidi aromatici: contengono gruppi aromatici e avendo anelli con doppi legami coniugati assorbono fortemente la luce nella regione dello spettro ultravioletto corrispondente. Fenilalanina: è uno degli amminoacidi più idrofobici ed è un amminoacido essenziale; tirosina: è importante perché è un residuo amminoacidico importante nel recettore per l’insulina, ha carattere idrofobico e si dissocia a pH elevato; triptofano: amminoacido essenziale che ha nel gruppo aromatico un pirrolo.
• Amminoacidi basici: quando un gruppo carbossilico diventa carbonilico, cioè perde la carica negativa, il suo gruppo amminico diventa da primario a secondario, cioè perde la capacità di coordinare un protone e quindi non presentano cariche se non a livello delle catene laterali. Sono fortemente polari perciò si trovano sulla superficie esterna delle proteine dove possono essere idratate dall’ambiente acquoso circostante. Istidina: meno basico dei tre; lisina; arginina.
• Amminoacidi acidi e ammidi corrispondenti: sono tutti amminoacidi sintetizzabili. Le ammine presentano un gruppo C=O. Aspartato: la cui ammina è l’asparagina; glutammato: la cui ammina è il glutammato. NH₂
• Amminoacido ciclico: prolina: anello alfa iminoacido, porta a punti di discontinuità nella struttura primaria che influenzano la secondaria e la terziaria.

Struttura secondaria

Le proteine possono assumere diverse strutture ma ci sono delle restrizioni a cui devono attenersi.

Gli atomi che costituiscono il legame peptidico stanno su un piano.

• Perché O, N, C, fra loro si distribuiscono a carattere di =. La distanza tra C e N è intermedia tra = e -. Quindi atomi tenuti insieme da = non possono ruotare, gli atomi sono su un piano e l’unica possibilità di rotazione è a monte di questo piano.
• La carica presente sui gruppi R. Gruppi R carichi sono presenti nei residui di glutammato e aspartato e in quelli basici. Quando i residui in base alla posizione tridimensionale si trovano vicini possono esercitare attrazione o repulsione.
• Le dimensioni dei gruppi R.

Pauling scoprì strutture che rispondevano a tutti questi requisiti.

• α-elica: è una struttura stabilizzata da legami a idrogeno tra H del gruppo amminico e il gruppo carbonilico che segue tre posizioni dopo e che in virtù dell’avvolgimento si confronta con NH che si trova a distanza compatibile per formare un legame a H. I legami a H hanno basso contenuto energetico ma trovandosi tutti sull’asse di avvolgimento nella stessa direzione contribuiscono al mantenimento della struttura.

I legami a H sono localizzati entro una singola catena polipeptidica. L’elica si ripete ogni 18 residui e corrisponde a 5 giri: presenta 3.6 residui per giro.

Ogni O carbossilico forma un legame a H con il protone amminico del quarto residuo successivo nell’elica, quindi ogni legame a H chiude un’ansa formata da 13 atomi. Importante è la dimensione del gruppo R, quando grazie alla rotazione gruppi R di grandi dimensioni si trovano vicini e possono non essere alloggiati, creando destabilizzazione.

La struttura ad elica è caratteristica delle cheratine, proteine fibrose, ossia caratterizzate da una sola conformazione, con funzione strutturale presenti in tutte le formazioni cornee.

• Foglietto β: ha una struttura distesa e i gruppi R sono al di sopra e al di sotto del piano. Caratterizzata da una serie di peptidi che decorrono affiancati tra loro con un andamento che può essere parallelo o antiparallelo.

Parallelo significa che i peptidi iniziano tutti con l’estremità carbossilica da un lato e quella amminica dall’altro.

Nell’antiparallelo abbiamo un’alternanza di direzione N—C, i polipeptidi affiancati hanno polarità opposta.

I legami a H sono tra catene adiacenti.

I residui R sono localizzati nello spazio tra i foglietti ortogonalmente. Questi residui hanno a disposizione spazi tra loro variabili ma sempre limitati, altrimenti non ci sarebbe la robustezza necessaria, visto che si tratta di proteine di sostegno. Per questo troviamo gruppi laterali con catene R di modeste dimensioni.

• Elica 3₁₀ si può riscontrare in alcune proteine ma non è diffusa come l’α-elica.
• β-elica, sebbene sia stericamente possibile, non è mai stata osservata.

Proteine fibrose

Le proteine fibrose hanno una forma allungata e, a differenza delle proteine globulari, sono costituite da un unico elemento di struttura secondaria: eliche o strutture β.

Sono in genere caratterizzate da elevata resistenza meccanica alla trazione, rigidità e compattezza, ma alcune sono flessibili ed elastiche. Sono quindi particolarmente adatte a svolgere funzioni strutturali.

Una di esse, il collageno è la più abbondante delle proteine fibrose nei vertebrati.

Il collagene

È la proteina più abbondante presente nei vertebrati, con concentrazioni che variano in funzione della specie dal 20 al 40%. È la sostanza principalmente presente nei tessuti connettivi. Si presenta sotto varie forme: nelle ossa, con precipitazione di cristalli di idrossiapatite, nei tendini, sotto forma di fibre allineate, nella cornea, nel cristallino, nella parete dei vasi, associata all’elastina.

Collageno

Proprietà: resistenza, rigidità, insolubilità.
Quantità: 20-40% in tutte le proteine.
Localizzazione: extracellulare.
Struttura: polimorfa, non meno di 12 tipi diversi di collageno con altrettanti tipi di catene costituenti.
Unità fondamentali: tropocollageno (dimensioni 30 nm X 1,5 nm).

Non c’è ancora una stima precisa sui tipi di collageno, da 15 a 19 secondo le ultime teorie. I vari tipi di collageno si distinguono nella sequenza primaria delle catene che costituiscono il tropocollageno, l’elemento fondamentale.

Il collageno di tipo I, il più diffuso, è caratterizzato dalla mancanza di cisteina e triptofano. Le peculiarità del collageno variano a seconda della funzione.

Nell’uomo è maggiormente presente nel muscolo e nelle ossa e nella pelle, ma è distribuito più o meno ovunque. Facendo una micrografia elettronica del collageno si vedono fibre dotate di una striatura periodica, che è il risultato dell’allineamento delle unità di tropocollageno.

Le fibre di collageno sono date dalla polimerizzazione di tropocollagene.

Il tropocollagene è una proteina dotata solo di struttura secondaria, è una tripla elica, di tre catene di polipeptidi, ciascuna lunga circa mille residui.

Le singole catene sono eliche sinistrorse che si avvolgono l’una all’altra in senso destrorso, stabilendo legami H. Ciò garantisce che non si potrà svolgere spontaneamente, infatti lo srotolamento in un punto centrale porterebbe ad un superavvolgimento.

In questa struttura troviamo alcune peculiarità:

• La struttura tipica dell’elica del collageno è dovuta alla particolare sequenza amminoacidica delle catene, che è costituita per oltre un terzo da glicina e per almeno un quinto da prolina e idrossiprolina. Presenta una sequenza primaria ripetitiva: GLY-PRO-OHPRO-GLY.
• Un residuo ogni 3 deve giacere in prossimità del centro della tripla elica, e può essere esclusivamente una glicina, perché qualsiasi altra catena R sarebbe troppo ingombrante.
• Legami idrogeno intercatena fra il gruppo R della glicina e il gruppo ossidrilico sui residui di prolina.
• Presenza atipica di prolina in maniera abbondante, di norma incompatibile con la struttura ad elica. La prolina è presente sempre all’esterno della triplice elica, sono residui rigidi, planari, idrofobici ed essendo periodici danno insolubilità, rigidità e contribuiscono a dare un andamento ordinato. Presenza di lisina, che forma i siti di attacco per i polisaccaridi e permette anche la formazione di legami crociati.
• Presenza di idrossiprolina e idrossilisina. In natura non esistono transfer per le forme idrossilate perciò il processo avviene a proteina già assemblata.

Vediamo come avviene:

Il precursore non idrossilato del collagene è detto procollagene, dove i residui di prolina sono situati a due residui dalla glicina.

Questo è il substrato preferito dalla procollagene-prolina idrossilasi, un enzima che necessita di un atomo di Fe ferroso, di acido ascorbico, O molecolare, α-chetoglutarato; che verrà ossidato a succinato e CO₂.

L’acido ascorbico riduce l’O₂ di cui un atomo è incorporato dal succinato e l’altro nel gruppo ossidrilico dell’idrossiprolina.

Sono catalizzate da enzimi, vedi su, prolil monossigenasi e lisil monossigenati, entrambi metalloenzimi che presentano come ione metallico lo ione ferroso; se lo ione ferroso transita passa a ione ferrico, l’enzima non è più in grado di catalizzare la reazione. La necessità di mantenere sempre ridotto lo ione viene realizzata dall’intervento dell’acido ascorbico.

Una forte carenza di vitamina C, scorbuto, porta ad un indebolimento delle fibre collagene, dovuto alla mancata idrossilazione della prolina.

COO- COO-
O + + CO₂
O= COO-
COO- HO
Succinato
α-Chetoglutarato
\Acido ascorbico\
\2+Fe
X N C­NH­ X N C­NH­
Procollagene-prolina
/ \ / II / \ / II
idrossilasi
- C O - C O
Glicina Glicina
II II
O O
Segmento peptidico Segmento peptidico
del procollagene del collagene
contenente
idrossiprolina

Idrossilazione enzimatica dei residui di prolina del procollagene durante la sintesi del collagene. Il destino dei due atomi della molecola di O è indicato in rosa. X è un qualsiasi residuo amminoacidico.

La biogenesi del collagene

Le catene polipeptidiche che daranno origine al collageno sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico rugoso dei fibroblasti sotto forma di un precursore chiamato procollagene che va poi incontro ad una serie di modificazioni postraduzionali. Le varie fasi sono:

• Sintesi delle catene pro: si forma questa catena pro che contiene un numero di residui ridondante rispetto alla catena matura. Questi aa si trovano alle estremità e sono residui polari ricchi di cisteine, questo la rende ancora più solubile e favorisce l’assemblaggio delle tre eliche.
• Monossigenazione: in questa fase avviene l’idrossilazione dei residui di prolina e lisina. In realtà l’H è già presente quindi viene aggiunto solo l’O. Questa reazione avviene come spiegato sopra.
• Glicosilazione: un disaccaride formato da galattosio e glucosio è legato alla 5-idrossilisina. La funzione di tali carboidrati nel collageno è sconosciuta.
• Assemblaggio in procollageno: si organizza in una superelica che è il procollagene. Caratteristica la presenza sull’N-terminale e sul C-terminale di catene che hanno un andamento globulare, dovuto alla presenza di gruppi polari e residui di cisteina che creano un punto d’inizio alla trascrizione dato dalla formazione di ponti disolfuro tra essi, permettono il corretto allineamento delle tre catene e prevengono la formazione prematura del tropocollageno e del collagene all’interno dei fibroblasti.
• Esocitosi: il procollageno viene estromesso dalla cellula per raggiungere la localizzazione extracellulare; una volta esocitato ci sono degli enzimi idrolitici, pro-collageno peptidasi, che allontanano delle sequenze, acquisisce idrofobicità. Vicino ai fibroblasti le varie unità di tropocollageno si uniscono a formare le microfibrille. Si formano legami trasversali a livello delle eliche triple del tropocollageno e le microfibrille si uniscono a formare le fibre del collagene mature. In esse ogni molecola di tropocollageno è spostata di un quarto della sua lunghezza rispetto a quelle vicine, dunque si ha completa sovrapposizione solo ogni 5 molecole. La distanza tra l’estremità C-terminale di una molecola e quella N-terminale della molecola adiacente è di 32 nm e nell’osso è riempita con un fosfato di calcio, l’idrossiapatite.

Per dare stabilità alla struttura interviene la formazione di legami covalenti detti trasversi, o crociati. Perché ciò avvenga è necessaria una reazione a carico dei residui di lisina che interessa il Cε della lisina.

Questa reazione è catalizzata da un enzima, lisil-ossidasi, presente nella regione extracellulare e prevede liberazione del gruppo amminico sotto forma di ammoniaca (NH₃) e di O molecolare (O₂).

Porta alla formazione di allisina, un composto in cui il C della lisina diventa aldeidico.

O NH H₃
II I I
C—C—CH₂—CH₂—CH₂—CH₂—NH₂ --CH₂—CH₂—CH₂—C=O
a b g d e
I
NH O₂
Lisil-ossidasi
LISINA ALLISINA

Questo composto ora può dare origine a una serie di reazioni. Ne esistono di due tipi:

1. Una lisina o un idrossilisina viene ossidata da lisina ossidasi diventando allisina; reagisce poi per sottrazione di una molecola d’acqua con un’altra lisina a formare una base di Schift che viene in seguito ridotta.