Biochimica clinica

Biochimica clinica - Prof. Giancarlo Goi

Introduzione

Le fasi cliniche dell’analisi di materiale biologico di un paziente prevedono:

Fase pre-analitica

Il medico si pone un quesito e sceglie i test da effettuare sul paziente, attraverso i quali viene prelevato del materiale biologico e trasportato nel laboratorio. Durante la fase pre-analitica è fondamentale seguire protocolli specifici ed evitare errori.

Fase analitica

Vengono effettuate le analisi del materiale biologico, all’interno del laboratorio di biochimica clinica.

Fase post-analitica

Vengono analizzati clinicamente i risultati ottenuti. Il medico può in questo modo rispondere al quesito posto nella fase pre-analitica e fare una diagnosi.

La qualità

È il rapporto tra le prestazioni fornite ed i bisogni di chi ha richiesto tali prestazioni (concetto relativo). L’errore è una componente eliminabile, ma è comunque necessaria educazione, informazione e preparazione scientifica specifica del personale. Affinché gli errori non vengano ripetuti viene utilizzata l’analisi del processo: vengono analizzati gli errori compiuti ed il rischio di compiere errori durante la prestazione fornita, in modo tale da “imparare dall’errore”.

Sono inoltre poste delle condizioni di base per la gestione del rischio:

• Documentazione volontaria degli errori: comprendere di aver commesso un errore (è da distinguere l’errore con lo sbaglio) permette di migliorare i protocolli.
• Unità di gestione del rischio: analizza le documentazioni volontarie degli errori.
• Budget aziendale per la sicurezza: le strutture ospedaliere sono obbligate a disporre di un fondo utilizzabile esclusivamente per la sicurezza.
• Acquisto di beni e servizi: è necessario evitare che le strutture diventino obsolete.

Errori

Gli errori possono essere classificati.

Errori disorganizzativi

• Derivanti dall’abilità di eseguire un compito semplice ed automatico (ad esempio un prelievo di sangue).
• Derivanti dal mancato rispetto di regole provenienti da istruzioni specifiche (a causa di fretta o eccessiva fiducia in sé stessi): misidentificazione del campioni e del paziente, errata somministrazione di farmaci.
• Sono presenti nuove tecnologie e metodi, che impediscono di violare le regole.

Errori cognitivi

• Errori commessi nell’eseguire azioni tipicamente basate sul ragionamento, sul giudizio o sulla valutazione (in questo caso ci si trova in condizioni non standard).
• Errori analitici: precisione, accuratezza, mancanza di linearità, interferenti.

Tipi di campione biologico

È presente una enorme quantità e varietà di fonti, a partire dalle quali fare indagini.

Utilizzo dei dati di laboratorio

Ottenuti gli esami di laboratorio, è necessario chiedersi se gli esami indicano la presenza di una malattia. Il medico risponde a questo quesito in base al contesto:

Attendibilità delle misurazioni

Non sempre il valore ottenuto dalle analisi può essere interpretato attraverso gli intervalli di riferimento. È importante capire l’attendibilità del valore misurato: sono presenti numerose forme di variabilità.

Variabilità biologica

Ogni individuo è “unico” anche per la presenza delle sostanze presenti nel sangue. Ma esiste inoltre una variabilità biologica all’interno dell’individuo: le misure degli analiti presenti nel sangue di un individuo possono variare nell’arco della giornata. In generale vengono definite:

Variabilità biologica controllabile

• Influenze genetiche (polimorfismi), influenze fisiologiche (età, sesso, etnia, fumo, esercizio fisico, ecc.), assunzione di farmaci, risposte fisiopatologiche generali dell’organismo (traumi, stress, infezioni, interventi chirurgici, ecc.).
• Anche i ritmi biologici influiscono sulla variabilità biologica controllabile: i bioritmi sono variazioni spontanee, regolari e periodiche, per questo motivo prevedibili. Con l’invecchiamento possono essere influenzati e modificarsi.

I ritmi biologici sono identificati da:

• Mesor: livello approssimato (medio) del bioritmo.
• Acrofase: è il tempo in cui il bioritmo studiato raggiunge il proprio valore massimo.
• Ampiezza: differenza tra mesor ed acrofase.
• Periodo: durata di un ciclo completo, è compreso tra due acrofasi.

Variabilità biologica non controllabile

In ogni momento la concentrazione delle componenti del sangue è il risultato di un equilibrio dinamico, controllato da forze che tendono a mantenerlo regolato fino ad un valore fisso, che è il punto emostatico.

• Variabilità intra-individuale: oscillazione intorno al punto emostatico, caratteristica di ciascun componente e di ciascun individuo.
• Variabilità inter-individuale: il punto omeostatico di ciascun componente varia da individuo ad individuo.

Variabilità analitica

Quando vengono effettuate delle misurazioni con degli strumenti, il valore misurato non è mai lo stesso. È necessario quindi misurare le fonti di errore, per mantenere la strumentazione sotto controllo.

N.B. V_osservato = V_vero + E; V=valore, E=errore. Il V_vero è incognito; attraverso il V_osservato è possibile stimare il V_vero, al quale ci si avvicina di più quanto più lo strumento (o il metodo) utilizzato è preciso ed accurato.

La scelta del metodo per la misurazione viene effettuata anche in base al costo della strumentazione. È importante ricordare che l’errore totale E_tot = E_casuale + E_sistematico. Ogni metodo è affetto da queste due tipologie di errore. In base alla tipologia di errore si parla di: precisione ed accuratezza.

Imprecisione

È dovuta ad E_casuale, che è ineliminabile. Misurando più volte uno stesso parametro: si ottiene una distribuzione a campana di tutti i valori misurati (gaussiana o normale); si ha un valore medio attorno al quale si distribuiscono tutti i valori misurati.

In laboratorio la misurazione viene effettuata una sola volta: il valore ottenuto può coincidere con il valore medio o con valori maggiori o minori del valore medio. ± 2DS (DS= deviazione standard) è la probabilità al 95% che un dato sia compreso nella distribuzione.

Inaccuratezza

È dovuta ad E_sistematico, che è invece eliminabile. L’E_sistematico è la differenza tra V_medio dell’E_casuale ed il V_vero.

Unendo imprecisione ed inaccuratezza

Ci sono 4 tipologie di metodi (considerando un valore vero):

• Metodo preciso (i valori sono molto simili) ed accurato (i valori sono vicini al valor vero).
• Metodo poco preciso (i valori sono distanti tra loro) ed accurato.
• Metodo preciso e poco accurato (i valori sono lontani al valor vero).
• Metodo poco preciso e poco accurato.

N.B. L’inaccuratezza può essere eliminata calibrando gli strumenti. L’importante è quindi riuscire ad essere precisi.

Controllo di precisione ed accuratezza

• Metodo definitivo: è un metodo ad altissima precisione e privo di impurità (esente da cause note di inaccuratezza). Il metodo definitivo produce degli standard primari che viene utilizzato in una catena di osservazione per controllare il metodo di routine. Il metodo definitivo non può essere sempre utilizzato per due motivi principali: a) tempo, b) costi.
• Metodo di riferimento: viene prodotto a partire dagli standard primari, ottenuti attraverso il metodo definitivo. È un metodo dotato di alta precisione e con una lieve inaccuratezza (se ha queste caratteristiche garantisce la validità del metodo definitivo). Il metodo di riferimento produce degli standard secondari che hanno una matrice simile a quella dei campioni e vengono utilizzati per produrre il metodo di routine.
• Metodo di routine: è meno preciso ed accurato rispetto ai precedenti. Utilizzando un kit, prodotto a partire dal metodo di riferimento, possono allinearsi con esso (e quindi con gli standard secondari). Attraverso i metodi di routine vengono effettuate le misurazioni di routine negli istituti ospedalieri sui pazienti.

Regole di allarme e di rigetto

Si preparano degli strumenti con: campioni (sangue del paziente) e standard (valori considerati standard delle componenti ematiche), che vengono confrontati.

Lo strumento procede misurando contemporaneamente campioni e standard: se gli standard rimangono nelle due DS significa che lo strumento funziona correttamente.

Al contrario, se sfora dalla DS o per valori tutti maggiori (o minori) del valore medio: sono “campanelli di allarme” che indicano un malfunzionamento dello strumento.

N.B. Nel grafico sopra citato: nei rombi sono rappresentate le valutazioni effettuate (numero di valori all’interno del numero di DS); in base al risultato si può accettare o rifiutare la serie e comprendere la precisione ed accuratezza dello strumento.

Componente imprevedibile della variabilità analitica

• È indipendente dal metodo di analisi.
• Non è sistematica: probabilmente si verifica in una sola misurazione.
• Può essere dovuto a fenomeni di interazione tra il campione ed il metodo, condizionati da modificazioni della matrice del campione che il metodo non è in grado di considerare.

Si parla generalmente di interferenza da: emolisi, farmaci, iperlipidemie.

Contesti medici dell’utilizzo dei dati di laboratorio

Come già detto, ottenuti i risultati delle analisi di laboratorio è opportuno chiedersi se indicano o meno la presenza di una malattia. Sono presenti 3 contesti medici:

1: Sorveglianza di un paziente

I risultati vanno confrontati con i valori ottenuti precedentemente. Una delle variabili implicite nella sorveglianza di un paziente è espressa dalla variabilità biologica intraindividuo. La domanda posta in questo contesto è: se i risultati sono significativamente diversi dai precedenti.

2: Diagnosi

Il confronto viene effettuato con gli intervalli di riferimento. In questo caso è opportuno considerare la variabilità biologica interindividuo. La domanda posta in questo contesto è: se i risultati si trovano negli intervalli di riferimento.

3: Valutazione del livello di rischio

Si utilizzano dei valori decisionali: la variabilità è dovuta a limiti definiti. La domanda posta in questo contesto è: se i risultati si trovano al di sopra (o al di sotto) della soglia indicativa della malattia.

Sorveglianza di un paziente

Viene presa in considerazione una variabilità totale dovuta a: variabilità analitica e variabilità biologica intraindividuo (ovvero la variabilità biologica nel paziente stesso). Il coefficiente di variabilità totale si misura CV_t= (CV_a² + CV_b(intra)²)^1/2.

Il traguardo di imprecisione viene messo in relazione al CV_b(intra) (coefficiente di variabilità biologica intraindividuo): la variabilità analitica deve essere minore o uguale alla metà della variabilità biologica intraindividuo.

Differenza critica

È la più piccola variazione tra due valori successivi, che non può essere spiegata dal coefficiente di variabilità totale e, di conseguenza, deve essere attribuita all’intervento di altri fattori. La differenza critica D_cr = K·CV_t, con K=1,96·2^1/2=2,77 e CV_t=1,12·CV_b(intra). Si ottiene che D_cr = 2,77·1,12·CV_b(intra) = 3,1·CV_b(intra); questo valore è universale, che si può applicare a qualsiasi sostanza venga misurata.

N.B. La variabilità biologica intraindividuale si ottiene attraverso studi specifici, che permettono di ottenere un valore medio. Il coefficiente di variabilità biologica intraindividuo dipende ovviamente dal parametro che si sta misurando. La differenza critica è una percentuale, viene utilizzata per comprendere se la differenza tra il risultati di due analisi consecutive (effettuate su un paziente sorvegliato) è significativa.

Esempio: Il valore di colesterolemia ottenuto con la prima analisi ha un valore di 275 mg/dL. La differenza critica calcolata è del 12,38%. Il 12,38% di 275 è 34. Se il valore di colesterolemia ottenuto con l’analisi successiva ha un valore compreso tra 275-34≤x≤275+34, allora la differenza non è da considerarsi significativa, oltre quei valori invece sì.

N.B. Se vengono effettuate più di due misurazioni: il valore di differenza critica si modifica in base al numero di osservazioni.

Diagnosi

Per effettuare una diagnosi si considera un E_tot dovuto a: E_casuale ed E_sistematico. L’errore totale viene calcolato come: E_tot = B + (1,65·I), con B=inaccuratezza e I=imprecisione. In questo caso l’errore casuale (imprecisione) viene considerata unilateralmente, di conseguenza deve risultare < 1/4 (CV_b(intra)² + CV_b(inter)²)^1/2.

N.B. Il paziente viene confrontato con un gruppo di soggetti ritenuti sani, di conseguenza è importante considerare anche la variabilità interindividuo. L’E_tot risultante dal calcolo sopra proposto è l’errore massimo accettabile in una diagnosi. Quindi se la misurazione di un valore ha un risultato X, il risultato vero (Y) avrebbe in realtà potuto essere compreso tra: X-E_tot ≤ Y ≤ X+E_tot.

Intervalli di riferimento

Attraverso un gruppo di individui di riferimento (considerati sani) viene misurato il valore di un dato parametro (es. glicemia) e viene prodotta una distribuzione di riferimento. Attraverso questa distribuzione si ottiene un intervallo di riferimento (compreso tra i valori ± 2DS rispetto al valor medio) con il quale vengono confrontati i risultati diagnostici di un paziente.

N.B. In alcuni casi non è considerata la variabilità biologica intraindividuo, che può essere maggiore (o minore) rispetto alla variabilità interindividuo; questo può rappresentare:

• Un vantaggio: se CV_b(intra) > CV_b(inter), in quanto se il risultato della misurazione sfora dall’intervallo di riferimento può far “scattare un campanello di allarme” nonostante il valore sia corretto (tratteggio blu).
• Uno svantaggio: se CV_b(intra) < CV_b(inter), in quanto se il risultato della misurazione sfora dall’intervallo intraindividuale, ma non dall’intervallo di riferimento interindividuale è possibile “non accorgersi” di una possibile patologia in corso (tratteggio verde).

Gli intervalli di riferimento devono essere ricalcolati periodicamente, specialmente quando viene modificata la tecnica di misurazione o vengono modificati i protocolli della tecnica pre-analitica.

Riassumendo (i primi due contesti)

Valutazione del livello di rischio

Si tratta di livelli di un determinato parametro (es. concentrazione ematica di emoglobina) oltre i quali è necessario decidere di:

• Effettuare una diagnosi più approfondita (per l’Hb valutare la presenza di anemia).
• Intervenire farmacologicamente o chirurgicamente (per l’Hb con una trasfusione).

I valori decisionali (per discernere un individuo patologico da uno non) possono essere stabiliti in base a:

• Calcolo delle probabilità.
• Criteri empirici.
• Consenso di esperti: basato su studi effettuati sulla popolazione.

I valori decisionali possono trovarsi al di fuori (es. glicemia) o all’interno (es. colesterolemia) degli intervalli di riferimento. Quindi i valori decisionali dipendono dalla patologia e dal tipo di decisione clinica.

Situazioni paradigmatiche

Esempio: Valutazione dell’emoglobina ematica. L’intervallo di riferimento maschile per l’Hb è 14.0 - 17.5 g/dL. Una volta misurato il valore del paziente, è necessario:

• Se il valore si trova all’interno degli intervalli di riferimento: confrontarlo con i valori precedenti (con una differenza critica per Hb del 9%).
• Se il valore è inferiore agli intervalli di riferimento: il limite decisionale per la valutazione dell’anemia ha un valore al di fuori (minore) dell’intervallo di riferimento; il limite decisionale è 13 mg/dL.
• Il limite decisionale di panico (è necessaria una trasfusione) è ancora minore; il valore decisionale è 7 mg/dL.

Calcolo delle probabilità

È necessario trovare un analita la cui misurazione permette di distinguere un soggetto sano da uno malato.

• In un test ideale: sarebbe possibile distinguere il 100% dei sani dal 100% dei malati (non esiste).
• In un test inutile: è impossibile distinguere un sano da un malato, in quanto i livelli dell’analita sono identici.
• In un test reale: si distinguono abbastanza facilmente i sani da i malati, ma c’è un certo livello di concentrazione dell’analita che è “border line”, ovvero può essere presente sia nel sano che nel malato.

Test reale

Per distinguere tra sani e malati negli individui che ricadono tra i valori border line non è possibile utilizzare un valore specifico discriminante che divida precisamente i soggetti sani dai soggetti patologici, ma interviene il calcolo delle probabilità. Viene stabilito un valore discriminante e si definiscono:

• Specificità = sani negativi / tot sani. Esprime la probabilità che ad un individuo sano venga misurato un valore di analita al di sotto del discriminante.
• Sensibilità = patologici positivi / tot patologici. Esprime la probabilità che ad un individuo patologico venga misurato un valore di analita al di sopra del discriminante.
• Valore predittivo negativo = sani negativi / tot negativi. Esprime la probabilità che un individuo a cui viene misurato un valore di analita al di sotto del discriminante sia realmente sano.
• Valore predittivo positivo = patologici positivi / tot positivi. Esprime la probabilità che un individuo a cui viene misurato un valore di analita al di sopra del discriminante sia realmente patologico.

Cambiando il valore discriminante, vengono modificati tutti i parametri compresa l’efficienza diagnostica. Il valore di e...