Biochimica clinica

Grandezze e unità di misura

Convenzione Internazionale per la standardizzazione delle grandezze e delle unità di misura: Biochimica clinica Sistema SI = Sistema Internazionale di Unità.

Grandezze e unità di misura

Parametro Tradizionale Internazionale.

• Sodio mg/dL mM
• Potassio mg/dL mM
• Cloro mg/dL mM
• Calcio mg/dL mM
• Magnesio mg/dL mM
• Ferro µg/dL µM
• Rame µg/dL µM
• Urea mg/dL mM
• Creatina mg/dL mM
• Creatinina mg/dL mM
• Glucosio mg/dL mM
• Lattato mg/dL mM
• Bilirubina mg/dL µM
• T4 mM
• Cortisolo µg/dL µM

La concentrazione è la quantità di sostanza in un determinato volume, da più diluito a più concentrato. I risultati delle analisi di laboratorio sono spesso espressi con unità di misura diversa e le unità di concentrazione usate possono essere differenti tra laboratori. Le quattro principali unità di misura sono: molarità (M, mM, nM), unità di misura internazionale; percentuale (%); quantità di massa (g/L, mg/mL, mg/dL); parti per milione (ppm), per miliardo (ppb) e per trilione (ppt) usati soprattutto in tossicologia.

Nel SI la concentrazione è espressa per mol/m³ (M), l’urea mM, Cu proteine in g/dL M; Glucisio mg/dL mM tradizionale o g/L internazionale. Intervalli di riferimenti in numeri variano tantissimo nelle diverse misure, es il cortisone in unità internazionale ha concentrazione 36-81 nM nel cavallo, mentre in unità classiche 1,30-2,93 M.

Una mole di una sostanza pesa la sua massa molecolare espressa in grammi (g = PM x moli).

• Glucosio (PM = 180 Da) 1 mole = 180 g 2 moli = (180x2)
• Cortisolo (PM = 362 Da) 1 mole = 362 g 1,5 moli = (362x1
• Bilirubina (PM = 585 Da) 1 mole = 585 g (~ ½ Kg)
• Insulina (PM = 5800 Da) 1 mole = 5800 g (~ 5 kg)
• Emoglobina (PM = 65000 Da) 1 mole = 65000 g (65 kg)

Una mole di sostanza contiene 6,02x10²³ particelle (atomi, ioni, molecole, unità di formula) di quella sostanza, è una quantità di molecole. Il peso della mole dipende dal peso della singola unità (peso molecolare della sostanza), es 1 mole di glucosio pesa 180 g/mol, 3 moli di glucosio 3x180=540 g/mol. Dato che composti diversi hanno pesi molecolari diversi, a parità di numero di particelle hanno massa diversa (NB: se so il peso molecolare della sostanza-Da, so quanto pesa 1 mole).

Il numero di moli di una certa quantità di una sostanza equivale al suo peso in gramMOLE x moli). Massa molecolare espressa in grammi (g=PM diviso il peso molecolare (moli = g / PM).

Una mole di una sostanza pesa la sua massa molecolare espressa in grammi (g = PM x moli).

• 180 g di Glucosio (PM=180) 180 g /180 1 mole
• Glucosio (PM = 180 Da) 1 mole = 180 g 2 moli = (180x2) = 360 g
• 360 g di Glucosio 360 g /180 2 moli
• Cortisolo (PM = 362 Da) 1 mole = 362 g 1,5 moli = (362x1,5)=543 g
• 500 g di Glucosio 500 g /180 2,7 moli
• Bilirubina (PM = 585 Da) 1 mole = 585 g (~ ½ Kg)
• 362 g di Cortisolo (PM=362) 362 g / 362 1 mole
• Insulina (PM = 5800 Da) 1 mole = 5800 g (~ 5 kg)
• 724 g di Cortisolo 724 g / 362 2 moli
• Emoglobina (PM = 65000 Da) 1 mole = 65000 g (65 kg)
• 1,5 Kg di Cortisolo 1500 g / 362 4,14 moli

Alcuni multipli e sottomultipli decimali (prefissi)

Multipli e sottomultipli decimali

Il numero di moli di una certa quantità di una sostanza equivale al suo peso in grammi diviso il peso molecolare (moli = g / PM).

• 180 g di Glucosio (PM=180) 180 g /180 1 mole
• 360 g di Glucosio 360 g /180 2 moli
• 500 g di Glucosio 500 g /180 2,7 moli
• 362 g di Cortisolo (PM=362) 362 g / 362 1 mole
• 724 g di Cortisolo 724 g / 362 2 moli
• 1,5 Kg di Cortisolo 1500 g / 362 4,14 moli

• 12 tera T 10 1 000 000 000 000
• 9 giga G 10 1 000 000 000
• 6 mega M 10 1 000 000
• 3 kilo k 10 1 000
• 2 etto h 10 100
• 1 deca da 10 10
• -1 deci d 10 0,1
• -2 centi c 10 0,01
• -3 milli m 10 0,001
• -6 micro µ 10 0,000 001
• -9 nano n 10 0,000 000 001
• -12 pico p 10 0,000 000 000 001
• -15 fento f 10 0,000 000 000 000 001
• -18 atto a 10 0,000 000 000 000 000 001

M=n moli/1l. La molarità è l’espressione di concentrazione (quantità di sostanza in un determinato volume): soluzione, mM=mg/L/es se voglio fare una soluzione di glucosio 1M devo mettere 180g in 1l di soluzione. PM, la mM è in mmoli/L.

Esercizio: valore misurato 3mM intervallo di riferimento 40-60 mg/dL, peso molecolare glucosio ∂ mg/dL?, 180 Da. 3mM=3 mmoli/L [3 mmoli/Lx180mg=540mg]/L=54 mg/dL (NB: da L a dL se L sotto devo togliere uno 0).

Valore misurato 2,5 mg/ml soglia anaerobica 4mM=mmol/L, peso molecolare lattato 90 Da. 2,5mg/∂mM?, ml/90=0,027 mmoli/ml x 1000=27 mmoli/L.

Concentrazione in percentuale (%)

Parti del soluto per 100 parti del solvente: % 100 mL 1000 mL 1 mL 1 dL 1 L 1 g 100 g 1000 g.

La percentuale (%) indica la parte su 100; peso/peso grammi/100 g, peso/volume grammi/100mL (o 1 dL g/dL). 1mL=1g, 100mL=100g 1dL=1hg ∂ 1 hg 1Kg. Grammi /100 g. Grammi / 100 ml (dL). 1000mL=1000g 1L=1kg.

Esercizi: soluzione fisiologica 0,9% NaCl=0,9g NaCl in 100mL, 0,9g:100mL=x:1L x=0,009g. Preparare 1 L di soluzione al 3% glucosio: 3g:100mL=x:1000mL x=30g glucosio. Preparare 2,5L di soluzione 0,9% NaCl: 0,9g:100mL=x:2500mL x=22,5g NaCl.

Concentrazione in parti per milione (ppm) e parti per miliardo (ppb)

Concentrazioni usate con soluti presenti in tracce e per miscele di mangimi medicati, ecc..

I ppm sono 10^-6, ppb 10^-9; ppm= mg/L (Kg)= (g)= g/t; ppb= (Kg)=g/mL g/L 2cento 1/10 ng/mL (g)= mg/ton. Sono molto utilizzati in tossicologia.

• 6 milione 1/10⁹
• 12 miliardo (bilion) 1/10
• 12 tera T 10 1 000 000 000 000
• Soluzione fisiologica: 0.9% NaCl 0.9 g NaCl in 100 ml
• 6 12 ppm: 10
• 9 trilione 1/10 ppb: 10
• 9 giga G 10 1 000 000 000
• Soluzione 5% di glucosio 5.0 g Glucosio in 100 ml
• 6 mega M 10 1 000 000
• Pesi - volumi Pesi - volumi Conc grassi nel latte intero: 4 % 4.0 g grassi in 100 ml
• 3 kilo k 10 1 000
• Ton - ton - Preparare 1 L di soluzione al 3 % di glucosio 30 g di glucosio (3 g : 100 mL = x g : 1000 mL)
• 2 etto h 10 100
• Preparare 2.5 L di sol. fisilogica (0.9% NaCl) 22.5 g di NaCl (0.9 g : 100 mL = x g : 2500 mL)
• Kg - Kg - L L 1 deca da 10 10
• µg= g / t/ mL (g) = -1 deci d 10 0,1
• g - g -mL mL -2 centi c 10 0,01
• = ng / mL (g) = mg / t mg - mg -µL µL -3 milli m 10 0,001
• -6 micro µ 10 0,000 001
• pg / mL (g) = µg / t µg - µg -nL nL -9 nano n 10 0,000 000 001
• ng - ng -pL pL -12 pico p 10 0,000 000 000 001
• -15 fento f 10 0,000 000 000 000 001
• pg - pg -fL fL -18 atto a 10 0,000 000 000 000 000 001

Esercizio: 8ppm=8g/mL; 0,3ppm=300ng/mL; 2ppm=2mg/Kg; 7ppb=7ng/mL; 0,2ppb=200g/t.

Tetracicline nel latte 0,5ppb (limite di legge); se in un campione di latte la concentrazione di tetracicline è 0,04g/mL, viene superato il limite? 0,04g/mL=0,04ppm=40ppb (non può essere utilizzato).

La presenza di enzimi nel sangue può indicare che un tessuto è danneggiato. La quantità degli enzimi si esprime con l’intensità (velocità) della reazione catalizzata, la velocità degli enzimi è direttamente proporzionale alla velocità della reazione da essi catalizzata.

Ci sono due sistemi per vedere quanto va veloce la reazione:

• Sistema tradizionale ∂ quantità di enzima in grado di convertire 1mole di substrato in prodotto in 1 minuto (mol/min)
• SI ∂ katal (kat), quantità di enzima che converte 1 mole di substrato in prodotto in 1 secondo (moli/sec), normalmente si usano i sottomultipli.

Esercizio: preparare 10mL di una soluzione di un antibiotico a concentrazione 1mg/mL avendo a disposizione una soluzione iniziale madre con concentrazione 25mg/mL. 1mg/mL x 10mL=10mg 25mg/mL:1mL=10mg: x mL x=10/25=0,4mL antibiotico, 10-0,4=9,6mL fisiologica.

V1 x C1=V2 x C2 oppure uso V1=(10,1)/25=0,4mL.

Metodi di analisi biochimiche in laboratorio

Lo sviluppo del colore è dovuto al diverso comportamento delle onde elettromagnetiche nei confronti della soluzione considerata.

I metodi di analisi biochimiche in laboratorio possono essere diretti o indiretti:

• Analisi indiretta ∂ rilevano e quantificano analiti dopo reazioni o dopo separazione degli altri componenti del campione; le reazioni possono essere chimiche, enzimatiche o immunochimiche, le separazioni si classificano in elettroforesi e cromatografia.
• Analisi diretta ∂ si considera l’analita, quindi si rilevano e quantificano gli analiti di interesse biochimico clinico senza una separazione o una reazione chimica/biochimica; si diversificano metodi elettrochimici, es calcolo pH, e la fotometria atomica.

La differenza principale è che nel caso dell’analisi diretta si vede subito l’analita, mentre in quella indiretta sono necessarie delle reazioni (spesso più di una); in entrambi i casi comunque alla fine si vanno a vedere le onde elettromagnetiche (sinonimo di energia radiante), misurate attraverso il luminometro, metodi fotometrici (es analisi urine-indiretta), immunochimici con reattivi marcati, metodi non specifici di colorazione degli acidi nucleici (analisi del DNA-onde elettromagnetiche fluorescenti alla luce UV). NB: applicazione delle onde elettromagnetiche in tutti i tipi di analisi di laboratorio.

Energia radiante

L’onda elettromagnetica è una radiazione le cui caratteristiche più importanti da considerare in laboratorio sono: lunghezza d’onda distanza tra due picchi (fra un punto in un ciclo e lo stesso nel ciclo successivo), a seconda della lunghezza d’onda si hanno diversi colori.

Ci sono delle specifiche lunghezze d’onda che la retina riesce a convertire in impulso nervoso (spettro visibile), in particolare vanno da 350 a 800nm, ognuno con diverso colore. In laboratorio biochimico si usano principalmente le misurazioni visibili e gli UV (200-300nm, usati per vedere il DNA). Altri tipi di lunghezze d’onda comprendono raggi X, infrarossi.

Lunghezza d'onda (l). Distanza fra un punto in un ciclo e il punto corrispondente nel ciclo successivo. Lo spettro elettromagnetico è costituito dall'insieme delle onde e può essere diviso in regioni caratteristiche a seconda delle l Wavelength (l).

Metodi basati sull'energia radiante

Le informazioni sull'analita o di un suo prodotto di reazione sono ottenute misurando radiazioni elettromagnetiche.

Intensità ∂ energia che passa attraverso un’area unitaria nell’unità di tempo; legata alla quantità della sostanza presente-quante onde ci sono, colore più o meno intenso. Si misura in watt/m² ed è proporzionale al quadrato dell’ampiezza. In sostanza l’intensità è la quantità di onde elettromagnetiche (dipende da quantità e spessore).

Intensità (I). Energia che passa attraverso un'area unitaria nell'unità di tempo e si misura in watt/m². È proporzionale al quadrato dell'ampiezza.

L'intensità di un fascio di onde elettromagnetiche può anche essere considerata come il numero di fotoni che attraversa una sezione unitaria di un campione nell'unità di tempo: intensità luminosa e flusso luminoso (Lumen, Lux, Candela).

Misurando la lunghezza d’onda delle radiazioni è possibile fare una analisi qualitativa; con l’intensità si fa una analisi quantitativa.

Dopo la reazione nella provetta le onde elettromagnetiche possono essere:

• Assorbite o trasmesse ∂ la metodica è fotometria e spettrofotometria di assorbimento.
• Rifratte o difratte ∂ onde deviate, cambia la rifrazione, metodi turbidimetria, nefelometria o rifrattometria.
• Riflesse ∂ spettroscopia di riflettanza.
• Prodotte ∂ fluorimetria, luminometria, spettroscopia di emissione atomica, non si considera il colore già presente, ma quello che viene prodotto.

• Trasmesse/ Assorbite 1) Fotometria e Spettrofotometria di assorbimento Intensity (I)
• Rifratte/Difratte 1) Turbidimetria, Nefelometria 2) Rifrattometria Refracted
• Riflesse 1) Spettroscopia di riflettanza
• Prodotte 1) Fluorimetria 2) Luminometria 3) Spettroscopia di emissione atomica

Metodi basati sulla misura di radiazioni assorbite

Spettro di assorbimento

Radiazioni assorbite: l’assorbanza misura le onde elettromagnetiche assorbite dalla sostanza, intensità delle onde elettromagnetiche trattenute dalla cuvetta; gli strumenti utilizzati per misurarla sono colorimetro (misura le onde visibili) e spettrofotometro (misura le onde visibili e non), c’è una sorgente di energia, un selettore di lunghezza d’onda e un rilevatore di onde elettromagnetiche. Per la misurazione dei raggi UV bisogna tenere conto che il vetro ferma questi raggi, quindi le provette devono essere di quarzo.

Una specifica onda elettromagnetica viene fermata da una certa sostanza in base alla sua struttura chimica; ogni sostanza ha uno specifico spettro di assorbimento, cioè un’onda elettromagnetica colpisce una sostanza e si ferma in essa solo se la sua lunghezza d’onda è in grado di andare a interferire con la costituzione elettronica della sostanza, l’energia è uguale a quella che fa saltare un elettrone da un livello inferiore a uno superiore.

Un protone o un elettrone ha una sola lunghezza d’onda che viene assorbita, ma una molecola più complessa assorbe diverse lunghezze d’onda in relazione alla sua composizione e visto che ogni molecola è diversa, anche le onde elettromagnetiche assorbite sono diverse. Le molecole in realtà non hanno la capacità di assorbire le onde elettromagnetiche, ma hanno spettri di assorbimento diversi.

Lo spettro di assorbimento è un grafico caratteristico di ogni sostanza fotoassorbente (es bilirubina ha uno spettro che assorbe tra 400-500nm) che rappresenta quanto viene assorbito, quindi le onde elettromagnetiche trattenute, rispetto alla lunghezza d’onda; gli atomi hanno spettri a righe-assorbono a valori specifici, le molecole hanno spettri continui, le differenze tra gli spettri di molecole dipendono dalla loro composizione (es colore carne deriva dallo stato chimico delle molecole di mioglobina).

Assorbanza vs lunghezze d'onda danno una curva di assorbimento o spettro di assorbimento caratteristico di ogni sostanza fotoassorbente.

• Atomi Spettri a righe
• Molecole Spettri continui

Negli spettri a righe a seconda della geometria dell’atomo viene prodotta una linea di assorbimento (estremamente atomo-specifica), usata per identificare la composizione chimica dei mezzi che la luce può attraversare, es Ca 442,7nm.

L’assorbanza (ABS) è una trasformazione matematica della trasmittanza (T). La trasmittanza è il rapporto tra l’intensità delle onde elettromagnetiche trasmesse e quelle che sono passate, intensità a una specifica lunghezza d’onda, T=I/I₀, normalmente viene messa in % (T%=Tx100), è priva di unità di misura e può avere valori tra 0 e 1 (in % da 0 a 100 ∂ 0% non è passato niente, 100% è passato tutto).

ABS= log(1/T)=. L’assorbanza di una soluzione è il logaritmo decimale del reciproco della trasmittanza log(100/T%)= 2-log(T%), ha valori che possono andare da 0 a 2. Se ho 0% di onde assorbite, T% 100, ABS è 0; se 99% I assorbita, T% 1, ABS è 2. Esercizio: T=1% ABS=log(100/1)=2, T%=0,1 ABS=log(100/0,1)=3.

Dalla lettura strumentale alla concentrazione dell'analita

(T%) Trasmittanza.

La trasmittanza (T) all’aumentare della concentrazione diminuisce (inversamente proporzionale), la funzione della concentrazione è esponenziale, quindi T diminuisce in modo iperbolico. L’assorbanza all’aumentare della concentrazione aumenta, la funzione della concentrazione è una sigmoide con una regione lineare, quindi il vantaggio è che vedo dove al variare della concentrazione l’assorbanza aumenta o diminuisce (molto meglio usare ABS che T) e trovo il range di linearità del dosaggio (nel range valore varia in modo lineare).

L utilizzo dell assorbanza permette facilmente di evidenziare dove la curva dose risposta perde di proporzionalità: range di linearità del dosaggio. Assorbanza. Concentrazione.

Trasmittanza e assorbanza non dipendono soltanto dalla concentrazione dell’analita, ma anche da intensità della luce incidente, lunghezza d’onda della luce incidente, spessore attraversato, natura chimica della sostanza assorbente, concentrazione del soluto. Concentrazione.

Onde rifratte

La rifrattometria si basa sull’indice di rifrazione, cioè la variazione subita dalla radiazione luminosa quando attraversa un mezzo più o meno trasparente. In veterinaria questo metodo viene utilizzato per valutare indirettamente la presenza di proteine e il peso specifico delle urine (maggiore rifrattarietà indica maggiore presenza di proteine e peso specifico).

Lo strumento usato è il rifrattometro che usa le onde elettromagnetiche, misura l’angolo di rifrazione in un liquido, può essere dotato di una sorgente luminosa e di un sensore che verifica l’angolo deviato dell’onda. L’angolo di rifrazione è maggiore all’aumentare della concentrazione delle sostante presenti, dà solo un’indicazione generale sulla presenza di esse, non dice quali sono e quante.

Altri metodi di tipo indiretto per misurare le onde rifratte sono torbidimetria e nefelometria, che misurano il risultato di reazioni chimiche, biochimiche e immunochimiche che producono precipitati in soluzione non trasparenti alle onde elettromagnetiche, in particolare si formano delle particelle insolubili che producono un insieme di fenomeni di onde elettromagnetiche (assorbimento, riflessione e diffrazione). È come se si usasse uno spettrometro che, al posto di misurare le onde elettromagnetiche as