Biochimica

Biochimica - Proff. Laura Mauri e Cristina Battaglia

Proteine

Conoscere le proteine è necessario per capire il funzionamento delle vie metaboliche dell’organismo e delle molecole che intervengono per il loro funzionamento. Sono le molecole più abbondanti all’interno del corpo, dopo l’acqua. Sono macromolecole e possono avere una dimensione tra i 5000-1000000 Da. Sono costituite soltanto da 20 aminoacidi che, combinandosi in modi differenti, danno vita a una vastissima gamma di proteine. Sono classificate in: solubili e insolubili (in acqua). Viene effettuata questa distinzione perché tutte le reazioni che avvengono all’interno del corpo sono in soluzione acquosa.

Proteine insolubili

• Proteine strutturali, dall’aspetto fibroso (come cordoni: es. il collagene).
• Proteine di membrana: perché le membrane all’interno di cui si trovano sono analogamente insolubili (membrana fosfolipidica).

Proteine solubili: proteine globulari. Possono circolare nel torrente ematico o nel citoplasma cellulare. La solubilità e la struttura di una proteina ne determinano la funzione; le funzioni delle proteine sono numerosissime.

Struttura degli aminoacidi

Le proteine sono una sequenza di aminoacidi, la quale è responsabile del significato della proteina stessa. Gli aminoacidi possono avere due forme:

• Forma indissociata (a).
• Forma zwitterionica (b): sono presenti una carica positiva e una carica negativa.

Chimicamente, qualsiasi molecola con un gruppo aminico e un gruppo carbossilico è un aminoacido; gli aminoacidi delle proteine sono soltanto quelli in forma zwitterionica. La capacità dell’aminoacido di accettare/cedere ioni H⁺ dà la capacità all’aminoacido di fungere da sistema tampone per l’organismo (sistema che permette di mantenere il pH sempre circa a uno stesso valore, pur aggiungendo una base o un acido forte). Gli aminoacidi presenti nelle proteine sono sempre della serie L (essendo il carbonio alfa asimmetrico esistono due enantiomeri - immagini speculari - dell’aminoacido), mentre gli aminoacidi della serie D non possono essere utilizzati dall’organismo (che non li riconosce).

I 20 aminoacidi sono distinti in base al gruppo R; possono essere:

• Apolari.
• Aromatici: il gruppo R è ciclico.
• Polari non carichi: sono resi polari dalla presenza del gruppo OH.
• Polari con carica: nel gruppo R è presente o un altro gruppo carbossilico (carichi -) o un altro gruppo aminico (carichi +).
• Contenenti zolfo.

All’interno delle proteine del corpo sono presenti non solo i 20 aminoacidi essenziali, ma anche alcuni derivati da questi ultimi tramite modificazioni post-traduzionali:

• Glicosilazione: aggiunta di uno zucchero. Può essere:
  • O-glicosilazione: quando lo zucchero viene aggiunto al gruppo -OH dell’aminoacido.
  • N-glicosilazione: quando lo zucchero viene aggiunto al gruppo -NH₃ dell’aminoacido.
• Addizione di lipidi: l’esempio principale sono le proteine di membrana, alla quale sono fissate grazie a una “ancora lipidica”.
• Fosforilazione: meccanismo attraverso cui la funzionalità di alcuni enzimi viene regolata; questi enzimi per attivarsi devono essere fosforilati o defosforilati.
• Legame di ATP: anche in questo caso la funzione è di regolazione.
• Idrossidazione: viene legato un ulteriore gruppo -OH.
• Carbossilazione: viene legato un ulteriore gruppo carbossilico.

Gli aminoacidi si legano tra di loro attraverso la formazione di un legame peptidico. Chimicamente, il legame tra un gruppo carbossilico e un gruppo aminico viene definito ammidico. Attraverso una serie di legami tra i vari aminoacidi si forma una catena lineare. Il legame ammidico ha una parziale valenza di doppio legame, per questo le componenti della catena non possono ruotare su se stessi.

Struttura delle proteine

Struttura primaria

La struttura primaria è data dalla sequenza lineare degli aminoacidi. Questo non dà informazioni sulla struttura e sulla funzione della proteina ma, in base alla sequenza aminoacidica, permette alla proteina di ripiegarsi in un certo modo.

Struttura secondaria

Descrive il ripiegamento della catena proteica, ma solo in alcune zone. Le principali sono:

• Alfa-elica: è una struttura a spirale formata da legami a idrogeno (tra il carbossile dell’aminoacido sopra e l’amina dell’aminoacido sotto), in cui i gruppi R degli aminoacidi vengono esposti verso l’esterno della proteina.
• Beta-pieghe: una parte di catena è parallela a un’altra e sono tenute insieme da legami a idrogeno. La proteina assume una conformazione a ventaglio. Può essere:
  • Antiparallelo: una parte carbossi-terminale verso destra e una parte amino-terminale verso destra.
  • Parallelo: entrambe le parti sono carbossi-terminale a destra e amino-terminale a sinistra.

Le proteine si ripiegano sempre allo stesso modo: ciascuna proteina ha una specifica struttura secondaria.

Struttura terziaria

Comprende il ripiegamento finale della proteina, quindi la sua struttura tridimensionale. I legami che tengono insieme la struttura terziaria sono: legami a idrogeno, ponti disolfuro o legami ionici; questi legami tengono vicini due aminoacidi che sono tra loro distanti nella catena lineare. Denaturazione: perdita della struttura terziaria della proteina (che si srotola) a causa di: variazioni di pH, variazioni di temperatura, presenza di solventi organici. Può essere: reversibile o irreversibile dopo la rimozione dell’agente denaturante. La struttura terziaria è generalmente la struttura funzionante della proteina. Anche in questo caso ciascuna proteina ha una specifica struttura terziaria.

Struttura quaternaria

Non tutte le proteine hanno una struttura quaternaria. È data dall’unione di più catene peptidiche (subunità). Queste proteine, se le subunità non si associano, non sono funzionanti.

Emoglobina e mioglobina

L’emoglobina e la mioglobina sono proteine che legano ossigeno (un gas, apolare). La differenza tra mioglobina ed emoglobina è dovuta a una differente capacità di queste proteine di legare l’ossigeno. Entrambe sono proteine solubili, costituite da catene peptidiche definite globine. La mioglobina presenta 8 tipologie di catene alfa (153 aminoacidi). L’emoglobina presenta due tipologie di catena: alfa (141 aminoacidi) e beta (146 aminoacidi).

La mioglobina è costituita da una singola catena peptidica (solo struttura terziaria). L’emoglobina presenta due catene alfa e due catene beta (ha anche una struttura quaternaria) accoppiate: alfa1-beta1 e alfa2-beta2, in entrambi i casi tenute insieme da interazioni forti; le due coppie sono invece tra di loro tenute insieme da reazioni più deboli.

Gruppo prostetico (eme)

La caratteristica principale di entrambe le globine è la presenza di un gruppo eme: ha una forma ad anello, all’interno del quale è presente lo ione ferroso Fe²⁺ (che rimane sempre nel suo stato ridotto). Il Fe²⁺ è in grado di formare 4 legami:

• Forma 4 legami con gli azoti centrali dell’anello porfirinico dell’eme.
• Forma 1 legame con l’istidina Fe8.
• Forma 1 legame con: ossigeno/monossido di carbonio/monossido di azoto.

N.B. L’eme non si lega alla CO₂ (una parte di CO₂ si lega all’emoglobina, ma a una delle estremità N-terminali delle catene globiniche). Il monossido di carbonio e l’ossigeno si legano perpendicolarmente all’eme, formando un legame molto forte. Considerando l’eme singolarmente: il monossido di carbonio forma un legame 25 mila volte più forte che l’ossigeno; questo avverrebbe se non fosse presente la globina: perché il ferro a contatto si ossiderebbe allo stato di Fe³⁺. All’interno della globina invece il ferro si trova in una struttura apolare, in questo modo l’acqua non può entrare ad ossidare l’eme e l’ossigeno (apolare) entra. L’eme è ancora in grado (anche nella condizione normale in cui si trova) di legare il monossido di carbonio con più affinità rispetto all’ossigeno, ma in questo caso il legame con il monossido di carbonio è “solo” 250 volte più forte del legame con l’ossigeno. Questo permette all’eme di legare sempre l’ossigeno perché è l’unico gas presente, ma se fosse presente il monossido di carbonio (fuga di gas) l’eme si legherebbe preferibilmente a questa molecola (perché ha più affinità). Quindi la globina aumenta la capacità dell’eme di legare ossigeno e di mantenerlo legato, e quindi di trasportarne una maggiore quantità.

Differenza emoglobina-mioglobina

L’emoglobina trasporta ossigeno (si trova nel sangue), mentre la mioglobina funziona da deposito di ossigeno (si trova nel muscolo).

Grafico:

• Sull’asse delle x è rappresentata la pressione parziale dell’ossigeno (che nei polmoni è prossima 100 mmHg, mentre nei tessuti periferici circa 30-40 mmHg).
• Sull’asse delle y è rappresentata la saturazione dell’ossigeno (quante molecole di emoglobina o mioglobina sono legate all’ossigeno).

Il grafico dell’emoglobina ha una forma sigmoidale: a livello di una pressione di 100 mmHg la saturazione è massima, mentre quando arriva a una pressione parziale di circa 40 mmHg la saturazione crolla verticalmente (quindi l’emoglobina perde tutto l’ossigeno, quindi lo cede). Il grafico della mioglobina è un’iperbole: la mioglobina perde ossigeno quando la pressione parziale dell’ossigeno è prossima agli 0 mmHg. La mioglobina ha una affinità per l’ossigeno molto elevata, mentre l’emoglobina più bassa:

• L’emoglobina funge infatti da trasportatore in quanto, avendo bassa affinità, lo cede facilmente.
• La mioglobina funge invece da deposito in quanto, avendo alta affinità, è molto difficile che lo perda (a parte quando serve, cioè quando la sua pressione parziale è prossima agli 0 mmHg).

L’emoglobina è costituita da 4 globine che cooperano tra di loro: il legame positivo di una globina all’ossigeno influenza positivamente il legame con l’ossigeno di un’altra globina (e così vengono influenzati i legami di tutte e 4 le globine). Questo spiega la rapida salita della saturazione con l’innalzamento della pressione parziale.

Emoglobina effettori allosterici

Esistono molecole in grado di modificare l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno, definite effettori allosterici:

• Effettori negativi (temperatura, H⁺, CO₂, 2.3-difosfoglicerato): diminuiscono l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno; la curva dell’emoglobina si sposta verso destra, ovvero l’emoglobina libera l’ossigeno più facilmente (anche a pressioni parziali di ossigeno più elevate).
• Effettori positivi (CO): aumentano l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno; la curva dell’emoglobina si sposta verso sinistra, ovvero l’emoglobina rilascia l’ossigeno a pressioni parziali più basse.

Effetto Bohr

Gli ioni H⁺ e la CO₂ diminuiscono l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno. Questo viene definito effetto Bohr: rilascio di molecole di ossigeno da parte dell’emoglobina a causa dell’influenza di queste molecole/ioni. L’emoglobina ossigenata quando nei tessuti periferici incontra un ambiente acido: gli ioni H⁺ si legano all’emoglobina rendendola HHb (emoglobina deossigenata) e si libera l’ossigeno. Nei polmoni invece l’emoglobina si lega all’ossigeno, rilasciando gli ioni H⁺, perché la sua pressione parziale è molto elevata.

Trasporto di ossigeno

1. Nei polmoni arriva HHb (emoglobina deossigenata), che lega ossigeno e rilascia H⁺ diventando Hb-O₂ (emoglobina ossigenata).
2. Hb-O₂ si porta ai tessuti arteriosi, attraverso il sangue arterioso, dove incontra una elevata acidità ed una scarsa pressione parziale di ossigeno. N.B. L’ambiente acido è causato dall’unione delle molecole di H₂O e CO₂ che si formano durante il metabolismo: le due molecole subiscono una reazione, per mezzo dell’enzima anidrasi carbonica, e formano HCO₃^- (bicarbonato - un sale).
3. HCO₃^- viene trasportato ai polmoni attraverso il plasma, dove si dissocia in H₂O e CO₂ (che vengono eliminate nell’atmosfera).

Emoglobina fetale

Questa emoglobina presenta le catene gamma al posto delle catene beta. Per questo motivo non può legare il 2,3-bifosfoglicerato (che si lega solo alle catene beta) e quindi ha una maggiore affinità per l’ossigeno: questo permette all’emoglobina del feto di prendere l’ossigeno dall’emoglobina della madre tramite la placenta. Al momento della nascita viene sostituita con l’emoglobina adulta, altrimenti l’ossigeno rilasciato nei tessuti periferici non sarebbe sufficiente.

Il collagene

Il collagene, come l’elastina, è una proteina fibrosa presente nel tessuto connettivo. La prevalenza di queste due proteine dipende dalle proprietà dei tessuti che costituiscono:

• Le fibre di collagene sono più resistenti alla tensione (prevalgono nei tendini)
• Le fibre di elastina sono dotate di una certa elasticità (prevalgono nei legamenti).

Il collagene è una famiglia di proteine fibrose che vengono sintetizzate da diverse tipologie di cellule (fibroblasti, osteoblasti, condroblasti, odontoblasti). Sono stati identificati più di 27 tipologie di collagene.

Tropocollagene

Una proteina, per essere definita della famiglia dei collagene, deve avere determinate caratteristiche. L’unità fondamentale del collagene è il tropocollagene, costituito da una tripla elica.

Tripla elica: è un’alfa elica molto stretta, formata dall’associazione, attraverso legami ad H di tre catene-alfa; per ogni giro dell’elica sono presenti solo 3 aminoacidi (ripetizione della terna gly- e altri due aminoacidi). La particolarità della glicina è che il gruppo R è un idrogeno (poco ingombrante): in questo modo le triple eliche si possono avvolgere in maniera stretta, non essendoci un gruppo R ingombrante esterno alla catena.

Le catene di tropocollagene si assemblano a formare fibrilla di collagene, formando dei legami covalenti crociati. Le varie unità di tropocollagene sono tenute insieme anche attraverso legami a idrogeno. Le fibrille si assemblano tra di loro in maniera sfasata e sono separate da un intervallo; questo sfasamento dà il tipico aspetto striato nei preparati istologici.

Sintesi di collagene

Avviene nei ribosomi.

1. Si forma il pre-pro-collagene: un precursore che contiene una sequenza segnale che guida i ribosomi verso il RER.
2. Nel RER l’mRNA viene tradotto nelle catene polipeptidiche, definite pre-pro-alfa1 e pre-pro-alfa2. Queste protrudono nel lume del reticolo e si portano verso il Golgi.
3. Le 3 catene alfa si avvolgono tra di loro (una volta che si sono avvolte l’una sull’altra non sono più possibili modificazioni) formando il pro-tropocollagene.
4. Il pro-tropocollagene abbandona l’apparato di Golgi mediante vescicole di secrezione. Le molecole di pro-tropocollagene sono tuttavia inattive, a causa della presenza di due residui (a livello delle estremità C-term e N-term) che impediscono alle molecole di procollagene di legarsi per formare le fibrille di collagene all’interno della cellula (perché questo romperebbe la cellula). Successivamente all’esocitosi delle molecole di pro-tropocollagene: vengono rimossi i residui in C-term e N-term e in questo modo le molecole di tropocollagene si assemblano spontaneamente in fibrille.

Enzimi

Le reazioni che avvengono all’interno dell’organismo sono reazioni chimiche e seguono tutte le leggi della termodinamica. Una reazione chimica è tale quando sono presenti una serie di reagenti che si trasformano in prodotti. Le reazioni chimiche possono essere:

• Esoergoniche: sono accompagnate da una liberazione di energia (i reagenti contengono una energia libera di Gibbs maggiore rispetto ai prodotti). DeltaG°<0.
• Endoergoniche: viene utilizzata energia affinché queste reazioni possano avvenire (i reagenti contengono una energia libera minore rispetto ai prodotti). DeltaG°>0.

Affinché la reazione possa avvenire i reagenti devono possedere una certa quantità di energia, definita energia di attivazione, attraverso cui raggiungono lo stato di transizione (successivamente al quale la reazione può progredire con la formazione dei prodotti). Spesso non tutti i reagenti possiedono una sufficiente energia di attivazione, motivo per cui il progredire della reazione viene favorito dall’utilizzo di catalizzatori (temperatura, molecole, pH, ecc.). All’interno dell’organismo il ruolo di catalizzatore è svolto da alcune proteine, definite enzimi.

Ruolo degli enzimi: ridurre l’energia di attivazione. Si forma un legame enzima-substrato (substrato=reagente) che permette di costituire degli stati intermedi, a livello dei quali l’energia di attivazione è più bassa di quella totale della reazione. N.B. I prodotti finali hanno lo stesso contenuto energetico del prodotto che si sarebbe ottenuto senza l’utilizzo dell’enzima.

Meccanismo di azione degli enzimi

1. L’enzima reagisce con il substrato, formando il complesso enzima-substrato. Le due molecole sono tenute insieme da un legame che può essere: covalente polare o apolare (a seconda della molecola).
2. Una parte di complesso enzima-substrato libera una certa quantità sia di enzima che di substrato. Questa è la fase più lenta della reazione enzimatica, che quindi ne determina la velocità di reazione.
3. L’enzima permette la trasformazione del substrato in prodotto. Si passa quindi da complesso enzima-substrato a complesso enzima-prodotto.