Appunti Morfologia umana I

Citologia microscopia

Per studiare la cellula dobbiamo utilizzare degli strumenti di risoluzione. Il potere di risoluzione è la capacità di uno strumento di far vedere due punti come distinti. Viene definito con la formula di Abbe, cioè: · 2.

Dove:

• = Lunghezza d’onda della luce.
• = Apertura numerica: n è il coefficiente di reazione del mezzo attraverso cui la luce passa 2 (aria n=1).
• Semiangolo che si forma tra obiettivo e campione. Con la formula si ha il potere di = risoluzione in micrometri.

Il potere di risoluzione si può aumentare accrescendo il valore di n. Il massimo è 1,6 ed è il valore dell’olio.

Il potere di risoluzione dell’occhio umano è di 0,1mm. Possiamo vedere le cellule più grandi come adipociti e oociti. Per tutte le altre dobbiamo utilizzare il microscopio.

Il microscopio può essere:

• Ottico: posso vedere strutture non più piccole di 0,2 micrometri come ad esempio cellule epiteliali, globuli rossi e batteri. Le immagini appaiono a colori (utilizzando dei coloranti) e bidimensionali.
• Elettronico: posso vedere strutture più piccole di un nanometro come proteine e virus. Ci sono due tipi di microscopio elettronico:
• A trasmissione: le immagini appaiono bidimensionali in bianco e nero.
• A scansione: le immagini appaiono tridimensionali in bianco e nero.

Preparazione campione

La struttura biologica, prima di essere osservata al microscopio, deve essere trattata, in modo da non alterarne la vitalità e far sì che gli enzimi non inizino i processi di autodegenerazione. Si procede quindi con la fissazione: si usano fissativi chimici. Le cellule muoiono ma mantengono la forma che avevano al momento dell’escissione. La fissazione viene fatta utilizzando la formalina.

Si procede con una disidratazione: il campione deve essere stabile nel tempo, quindi viene sostituita l’acqua con un mezzo più stabile come l’etanolo. Questo avviene con passaggi in alcool a titolazione crescente. Il campione deve essere sezionato in modo sottile, per far passare la luce.

Prima di questo però il campione deve poter essere messo in una struttura geometrica per consentire il sezionamento. Per questo viene incluso in un cubo di paraffina (fusione 58/60 gradi). L’etanolo e la paraffina non sono però miscibili, quindi c’è bisogno di un intermezzo. Questo è un diafanizzante, un solvente organico come lo xilolo o toluolo. Il campione viene quindi immerso nel solvente, che si sostituisce all’etanolo. Il solvente viene poi sostituito dalla paraffina liquida, il campione viene messo in uno stampo, si solidifica e si forma un cubo.

A questo punto possiamo sezionare il campione utilizzando un microtomo: si formano delle sezioni sottili che vengono adagiate sul vetrino per l’osservazione. Sono incolori, quindi devono essere colorate.

I diafanizzanti rendono anche il campione più chiaro e permeabile alla luce.

In caso di osservazione di adipociti si verifica un problema: il grasso è infatti solubile in etanolo, quindi al microscopio si osserverebbero delle strutture cave nella cellula, poiché le gocce lipidiche sono state sciolte. I campioni di questo tipo vengono quindi congelati e inclusi in un gel OCT senza paraffina. Il campione viene sezionato attraverso un criostato, un microtomo chiuso in un congelatore, a -80 gradi.

In microscopia elettronica si utilizza lo stesso processo di fissazione con aldeidi, si procede con una disidratazione con acetone e inclusione in resine dure, che se colpite con un fascio elettronico non si sciolgono.

In microscopia ottica, inoltre, si verifica un ulteriore passaggio: la colorazione. Si utilizzano coloranti a base acquosa e si sfruttano le affinità delle strutture biologiche per i coloranti, chiamate affinità tintoriali:

• Basofilia: una struttura basofila reagisce con un colorante basico che ha una carica positiva. Un esempio è l’ematossilina che ha un colore viola.
• Acidofilia: una struttura acidofila reagisce con un colorante acido che ha una carica negativa. Un esempio è l’eosina che ha un colore rosa.

Per la colorazione si utilizza anche la reazione PAS (Periodic Acid Schiff), in cui utilizziamo la fuxina. Questa reazione prevede un pretrattamento con l’acido periodico e un reattivo di Schiff. È una colorazione specifica degli zuccheri: l’acido periodico rompe il legame 1-2 glicolico, si formano ossidrili ossidati ad aldeidi che reagiscono con Schiff e assumono il colore fuxia.

Introduzione alla cellula

La cellula è l’unità fondamentale di tutti gli esseri viventi. Per essere definita tale deve almeno una volta nella vita aver avuto:

• Metabolismo.
• Irritabilità: risposta agli stimoli esterni.
• Movimento.
• Ciclo riproduttivo (spesso le cellule sono ferme in G₀).

Generalmente le cellule sono grandi tra 7µm e 20µm. Il “gold standard” è l’eritrocita, con dimensioni di 7,7/7,0µm.

“La forma rispetta la funzione”: le cellule assumono la forma migliore per lo svolgimento delle attività, ad esempio: il neurone ha un corpo cellulare voluminoso, con grandi ramificazioni. Questo permette scambi migliori con altre cellule per la trasmissione del segnale. L’eritrocita ha una forma a disco biconcavo: questo gli permette di passare in spazi angusti, permette alle diverse cellule di non impilarsi l’una sull’altra provocando dei trombi e permette un aumento di superficie senza aumentare il volume, che migliora di molto gli scambi O₂/CO₂.

Membrana plasmatica

La cellula è delimitata da una membrana plasmatica costituita da lipidi e proteine. Tra i lipidi troviamo:

• Fosfolipidi: sono disposti in un doppio strato di fosfogliceridi e sfingolipidi.
• Colesterolo: importante per la fluidità di membrana.

Al microscopio i lipidi sono elettrondensi, appaiono come due linee scure separate da una trasparente (code). Lo spessore è di 7,5/10nm.

Per quanto riguarda le proteine, si distinguono:

• Proteine idrofobiche: sono intrinseche. Se hanno due domini (intracellulare ed extracellulare) sono proteine transmembrana.
• Proteine idrofiliche: sono estrinseche. Si ancorano con legami deboli ad alcune molecole.

Ancorati al versante extracellulare di membrana, troviamo i glicidi. Questi sono catene di zuccheri che possono essere ancorate a lipidi o proteine. Insieme vanno a formare il glicocalice della cellula.

Negli eritrociti, il glicocalice è ricco di acido sialico a carica negativa, che fa sì che le cellule non interagiscano fra loro. Il glicocalice, in questo caso, determina anche il gruppo sanguigno di un individuo. Oltre agli eritrociti possiamo fare alcuni esempi: le cellule dell’epitelio intestinale hanno un glicocalice molto ricco, costituito anche da enzimi che scindono le grosse macromolecole, per permetterne l’assorbimento. L’adesione delle cellule epiteliali alla membrana basale è mediata dal glicocalice. Nella vescica, l’urina è tossica: le cellule a contatto con essa hanno un glicocalice molto spesso che funge da barriera.

Le proteine di membrana possono inoltre fungere da recettori di diverso tipo:

• A sette domini transmembrana con proteina G: in ambiente extracellulare troviamo una specie di mano, in intracellulare alcune proteine che innescano un segnale a catena.
• Ad attività enzimatica intrinseca: formato da una proteina transmembrana in cui il dominio extracellulare si lega ad una proteina, l’intracellulare a un enzima attivato dalla porzione extracellulare che spesso procede per fosforilazione.
• Annessi a canali ionici (ionotropici) o sono canali ionici: complesso recettore-ligando si apre e lascia passare gli ioni.

Trasporto di membrana

Il trasporto di membrana permette gli scambi tra l’interno e l’esterno della cellula. Questo può essere:

• Passivo (secondo gradiente): avviene senza spese di energia e può essere per:
• Diffusione semplice: molecole non polari come O₂, CO₂ o etanolo.
• Diffusione facilitata: c’è bisogno di alcune proteine che fungono da trasportatori o da canali, come acquaporine mediano il passaggio di acqua, di GLUT che mediano il passaggio di glucosio e canali ionici. Il trasporto avviene finché il gradiente esterno alla cellula e quello interno non sono in perfetto equilibrio.

I canali ionici possono inoltre essere regolati. Si possono attivare in modi diversi:

• Voltaggio dipendenti: differenza tra potenziale interno ed esterno.
• Ligando dipendenti.
• A controllo meccanico: se membrana stirata i canali si aprono.
• Attivo (contro gradiente): avviene con dispendio di ATP attraverso, ad esempio, pompe ioniche o trasporto accoppiato Na⁺/glu.

In caso però di molecole molto ingombranti, il trasporto di membrana potrà procedere per:

Endocitosi

• Endocitosi: processo in cui la macromolecola viene internalizzata nell’ambiente cellulare. L’endocitosi può essere:
• Clatrina indipendente: chiamata anche pinocitosi. La cellula internalizza il materiale esterno senza scegliere. Il meccanismo è mediato dalla caveolina, una proteina transmembrana presente in zattere lipidiche sulla membrana plasmatica. Questa polimerizza e si forma un’invaginazione (caveola). I lembi si avvicinano, si stacca una vescicola che contiene un fluido con soluti (la caveolina III è la più abbondante e la più utilizzata dalle cellule muscolari lisce).
• Fagocitosi: tipica dei macrofagi che internalizzano parassiti. Questi vengono riconosciuti da recettori sulla membrana. Si agganciano con pseudopodi che abbracciano il parassita. Avviene un riarrangiamento del citoscheletro. La cellula sa cosa internalizza.
• Macropinocitosi: filamenti di actina del citoscheletro si riarrangiano formando grossi spazi vuoti e attraverso pseudopodi si chiudono delle vescicole chiamate macropinosomi.
• Clatrina dipendente: la Clatrina è una proteina che si trova in ambiente intracellulare subito al di sotto della membrana plasmatica e può legarsi ad altre clatrine. Quando polimerizza, la clatrina si attiva.

Nell’endocitosi clatrina dipendente, la cellula esprime sulla sua membrana un recettore per una certa molecola. Quando è presente il complesso recettore-ligando, il recettore cambia conformazione e richiama clatrina attraverso una proteina di intermezzo, l’adattina. Quando sono partiti diversi segnali, la clatrina polimerizza, si crea un avvallamento nella membrana plasmatica, e poi un’invaginazione poiché i lembi si avvicinano. Si chiudono e si forma una vescicola.

Questa all’esterno è circondata da clatrina, all’interno ha il complesso ligando-recettore. La vescicola si approfonda, la clatrina viene riciclata e la vescicola resta nuda. La vescicola rimane comunque uno spazio circondato da membrana e quindi controllato, poiché all’interno ci potrebbe essere del materiale tossico.

La vescicola incontra un grande corpo vescicolare, l’endosoma precoce, che ha un ambiente acido con un pH di 6. Il recettore perde affinità per la proteina, i recettori liberi vengono vescicolati verso la membrana plasmatica e la proteina libera rivescicolata in MVB (corpi multi-vescicolari). Questi vanno più a fondo e si fondono con un endosoma tardivo, con un pH di 5/5.5. Vi arrivano vescicole anche da altri organuli, come il Golgi, che contengono idrolasi acide.

Questi enzimi scindono grosse molecole in piccole. Se il pH si abbassa sotto 5 si forma un lisosoma (organulo digestivo). MVB può anche fuoriuscire dalla cellula, il contenuto viene captato dalla cellula adiacente e in questo modo le cellule possono comunicare. Le sostanze rilasciate dagli MVB sono dette esosomi.

Esocitosi

• Esocitosi: processo in cui la cellula rilascia materiale in ambiente extracellulare. Può essere:
• Costitutiva: capacità di ogni cellula di rilasciare materiale all’esterno.
• Regolata: capacità solo di alcune cellule di rilasciare dietro stimolo ormonale.

In tutti e due questi processi, da organuli membranosi si formano delle vescicole che tendono a risalire verso la superficie della cellula, si fondono con la membrana e rilasciano il contenuto all’esterno.

L’esocitosi può avvenire anche per gemmazione. In questo caso le macromolecole non sono libere nell’ambiente extracellulare ma sono contornate dalla membrana plasmatica. Si forma un’estroflessione che si allontana dalla membrana plasmatica e si stacca. La gemmazione avviene anche all’interno della cellula, poiché il materiale può essere, ad esempio, liberato nel citoplasma.

Citoplasma

Il citoplasma cellulare è composto da organuli e da inclusi, immersi in una sostanza gelatinosa chiamata “ialoplasma”. Gli organuli possono essere:

Organuli amembranosi

• Amembranosi:
• Ribosomi o Poliribosomi: sono costituiti da una subunità maggiore e una minore che si associano durante la traduzione. Sono caratterizzati da Svedberg: 80S è il complesso eucariota. (60S: 5S, 5,8S e 28S; 40S: 18S). Inoltre, i ribosomi possono essere:
• Liberi: dispersi nel citoplasma. Si associano e traducono proteine se trovano RNA disperso. Le proteine rimangono disperse nel citoplasma e possono avere destini diversi. Si possono muovere vicino alla membrana e interagendo possono diventare proteine estrinseche di membrana. Si possono muovere ed inserire in organuli membranosi come nucleo o mitocondrio, ma se devono arrivare alla membrana plasmatica di cui prima, hanno bisogno di aiuto perché solitamente gli aminoacidi sono polari e la loro integrazione nella membrana sarebbe impossibile.
• Adesi al RER: traducono categorie proteiche diverse. Il meccanismo di traduzione dei ribosomi adesi al RER parte sempre nel citoplasma. L’mRNA prodotto al livello del nucleo, interagisce con i ribosomi nel citoplasma. Alcuni mRNA hanno una sequenza idrofobica che costituisce uno stop poiché viene riconosciuto da SRP (signal recognition particle) che abbraccia il ribosoma. SRP si lega al controrecettore sulla membrana del RER. In automatico SRP allontanata da sito di traduzione, questa riparte, proteina entra in traslocatore e poi nel lume del RER, fino alla sequenza segnale di stop.

A questo punto la proteina può essere del tutto libera in RER o avere una parte che attraversa la parete del RER e quindi essere agganciata ad essa. Le proteine all’interno di RER vengono poi coinvolte in alcune modificazioni post-traduzionali, a causa delle quali assumono un corretto folding, vengono idrossilate o glicosilate. Quest’ultimo è un processo molto importante poiché vengono attaccati dei residui zuccherini alle proteine e può essere di due tipi:

• N-glicosilazione su un residuo di asparagina.
• O-glicosilazione su serina o treonina.

A questo punto, le proteine vengono destinate ai vari distretti della cellula. Si ha una gemmazione di vescicole a partire dal Golgi che vanno verso la membrana plasmatica fino a fondersi con essa, in questo caso le proteine avranno diversi destini. A volte le vescicole possono dirigersi verso altri organuli, come un endosoma tardivo. In questo caso potrebbero portare idrolasi acide.

Le proteine libere all’interno del RER saranno riversate all’esterno della cellula e si allontaneranno come proteine di esportazione, mentre le proteine transmembrana si ritroveranno in parte integrate nella membrana e diventeranno proteine intrinseche di membrana se sul versante intracellulare, oppure proteine estrinseche di membrana.

Organuli membranosi

• Membranosi:
• Reticolo endoplasmatico: organulo membranoso che segrega negli spazi. Può essere liscio o rugoso, nel caso in cui il versante citosolico presenti i ribosomi adesi. Il RER ha uno spessore di 6nm ed è composto da tubuli, cisterne e vescicole anastomizzate, elementi fusi tra loro. Il reticolo endoplasmatico liscio ha una membrana che è caratterizzata dall’assenza di ribosomi ed è formato da tubuli e vescicole non anastomizzati tra loro. Occupa meno volume rispetto al RER e le cisterne sono presenti solo in un singolo distretto. Inoltre, nel REL ci sono zone PAM (plasma-membrane associated membrane) che prendono contatto con la membrana plasmatica. Queste permettono lo scambio di ioni calcio. Ci sono anche delle zone MAM (mytochondria associated membrane) che collegano il REL alla membrana mitocondriale esterna.

Per quanto riguarda le funzioni del REL sappiamo che è coinvolto nella sintesi dei lipidi che vengono prodotti sul versante citoplasmatico esterno. Se sono prodotti nel lume, ci sono degli enzimi flippasi che li portano da una parte all’altra della membrana del REL. Il REL è quindi molto sviluppato in cellule di ghiandole esocrine o endocrine che producono un secreto lipidico.

Negli epatociti, il REL è coinvolto anche in fenomeni di detossificazione e glicogeno lisi. Nella detossificazione, il citocromo p450 si occupa delle molecole non idrosolubili (le idrosolubili vengono filtrate dal rene). A livello del fegato le sostanze vengono rese idrofiliche in modo da poter essere smaltite dal rene. Nella glicogeno lisi si creano invece delle scorte di glucosio sotto forma di glicogeno. In situazioni di bisogno, il glicogeno viene scisso in glucosio.

Nelle cellule del tessuto muscolare, il REL viene chiamato reticolo sarcoplasmatico. È molto esteso ed è costituito anche da delle cisterne. È molto sviluppato e percorre l’intera lunghezza della fibra muscolare striata scheletrica. Ha come funzione l’accumulo di calcio che innesca meccanismi di segnalazione.

• Apparato di Golgi: organulo membranoso che si trova tra il RER e la membrana plasmatica. È costituito da una serie di cisterne allungate e appiattite. Le porzioni esterne sono allargate e le cisterne sono impilate: 8 o 10 formano un dittiosoma. Tanti dittiosomi formano il Golgi stesso. La parte del Golgi verso il RER è chiamata compartimento cis, mentre la parte opposta è chiamata compartimento trans. La zona intermedia è il compartimento intermedio. Prima della zona cis ci sono vescico