Appunti microbiologia enologica

Appunti di microbiologia enologica

Presentazione 1: Analisi microbiologiche

Metodi di prova

I metodi di prova possono essere:

• Normalizzati: pubblicati nelle norme internazionali (ISO), europee (EN), nazionali (UNI) o pubblicati da enti riconosciuti.
• Non normalizzati: derivano da modifiche, integrazioni o estensioni di metodi normalizzati oppure sono metodi sviluppati internamente dal laboratorio. Devono essere validati.

Definizioni

• Analita: quantità particolare sottoposta a misurazione (UNI ENV ISO 13843:2003). La Norma UNI EN ISO 16140:2005 lo definisce anche come “componente misurato dal metodo di prova. Può essere rappresentato da un microrganismo”. In un metodo microbiologico l’analita è costituito da uno o più microrganismi presenti in una determinata matrice.
• Insensibilità: caratteristica di metodo analitico di non essere influenzato da modesti cambiamenti nelle procedure.
• Microrganismo (m.o.): colonia (che può essere contata) di batteri, lieviti e muffe, prodotta nelle condizioni specificate da un metodo di prova.
• Microrganismo target (m.o. bersaglio): microrganismo oggetto della prova.
• Colonia, UFC, germe, propagulo: entità vivente in grado di produrre crescita in un terreno nutritivo (UNI ENV ISO 13843:2003). L’entità vivente può essere una cellula vegetativa, un gruppo di cellule, una spora, un grappolo di spore o micelio micotico.
• Ceppo type: microrganismo univocamente identificato a livello di specie e ceppo, del quale sono note alcune caratteristiche, conservato presso collezioni microbiologiche ufficiali. Utilizzato come riferimento.

Validazione o verifica dei metodi di analisi

Determinazione delle caratteristiche prestazionali di un metodo analitico (validazione) o verifica sperimentale che il metodo soddisfi i criteri di qualità derivati per via teorica o da terzi (verifica). Per i metodi quantitativi occorrerà determinare le principali caratteristiche prestazionali (specificità, selettività, ripetibilità, riproducibilità atc.); per i metodi qualitativi occorrerà valutare, attraverso l’uso di ceppi di riferimento, la capacità di identificare la specie oggetto discriminando organismi contaminanti. Per i metodi normalizzati si parla di verifica, per quelli non normalizzati di validazione.

Caratteristiche prestazionali

• Incertezza di misurazione: parametro associato al risultato di una misurazione che descrive la dispersione dei valori che potrebbero ragionevolmente essere attribuiti all’oggetto di valutazione.
• Accuratezza di misura (della determinazione): approssimazione alla concordanza fra il risultato di una prova ed il valore di riferimento accettato.
• Accuratezza relativa: grado di corrispondenza fra il risultato ottenuto con un metodo di riferimento e quello evidenziato da un metodo alternativo applicato su un campione identico.
• Linearità: dipendenza lineare del segnale rispetto alla concentrazione dell’analita.
• Precisione: approssimazione della concordanza fra risultati di prove indipendenti ottenute in condizioni predeterminate. La precisione non è correlata al valore vero o ad un valore specificato. Di solito è espressa in termini di imprecisione e calcolata come scarto tipo dei risultati delle prove.
• Ripetibilità: congruenza fra risultati delle misurazioni successive dello stesso misurando effettuate nelle stesse condizioni di misurazione. Per estensione: congruenza fra risultati di due successive determinazioni relative ad un identico campione, condotte nelle stesse condizioni analitiche.
• Riproducibilità: congruenza fra i risultati delle misurazioni dello stesso misurando effettuate nelle stesse condizioni di misurazione. Per estensione: congruenza fra risultati di determinazioni eseguite su un identico campione condotte in condizioni analitiche diverse.
• Selettività apparente o presunta (F): rapporto fra il numero di colonie di riferimento e il numero totale di colonie presenti nello stesso volume di campione.
• Sensibilità: frazione del numero totale delle colture o colonie positive correttamente individuate nel corso di una valutazione presuntiva.
• Specificità: frazione del numero totale di colture o colonie negative correttamente individuate durante una ispezione presuntiva.

Metodi di analisi

È possibile suddividere i metodi di analitici microbiologici in metodi di coltura dipendenti e indipendenti. I primi si basano sulla separazione dei microrganismi dal substrato e riprodurli in mezzi sintetici, solidi o liquidi, che ne permettano lo studio. Il problema è che nella fase di estrazione sfugge la reale composizione del mezzo: in un mezzo sintetico le dinamiche di sviluppo sono diverse. Un esempio è la conta su piastra. I metodi di coltura indipendenti consentono, mediante approcci basati su tecniche strumentali o molecolari, di osservare o caratterizzare la popolazione microbica direttamente, senza estrazione. Un esempio è la conta al microscopio o la citofluorimetria.

Metodi quantitativi e qualitativi

• Quantitativi: determinazione della carica microbica, possono avere diversi gradi di selettività in modo da discriminare determinate specie piuttosto che nessuna. Es. conta su piastra, MPN, conta microscopica, citofluorimetria.
• Qualitativi: verifica della presenza/assenza di uno specifico microrganismo. Es. verifica presenza patogeni, monitoraggio Brett.

Conta su piastra

Si basa sulla crescita in un terreno solido sintetico dei microrganismi presenti nel campione; questi formano degli ammassi visibili ad occhio nudo chiamati colonie. In base alla composizione del terreno è possibile discriminare le specie presenti. I terreni sintetici sono formulati contenenti risorse necessarie allo sviluppo microbico (zuccheri, azoto, vitamine, sali etc.) e si trovano in forma liquida o gel (agar). È possibile distinguere i terreni sintetici per crescita microbiologica in generici, preferenziali e selettivi.

• Terreni generici: adatti allo sviluppo di un vasto numero di specie microbiche; è comune osservare una sottostima di specie microbiche esigenti. Es. PCA.
• Terreni preferenziali: favoriscono lo sviluppo di alcuni generi o specie grazie alla presenza di fattori nutrizionali specifici. Es. WL, MRS+Tj.
• Terreni selettivi: contengono agenti per inibire lo sviluppo di molte forme microbiche, permettendo sviluppo e osservazione di specie altrimenti difficili da osservare. Es. WLd.

Aspetti critici

• Campionamento: i m.o. non sono dispersi in maniera omogenea nel campione, ma tendono ad aggregarsi per cause fisiche (es. precipitazione) o biologiche (fonti nutritive). Hanno anche importanza la presenza di altri m.o., la pulizia, la sanificazione e la formazione di biofilm.
• Trasporto e conservazione del campione: per i campioni in fermentazione il trasporto deve essere rapido, sotto i 10°C.
• Analisi: la manualità dell’operatore influisce sull’analisi; anche la composizione microbiologica del campione (specie più vigorose) influisce.
• Incubazione: tempi lunghi, analisi non adeguata a tempi industriali rapidi.

Riconoscimento morfologico dei principali generi di lievito

• Saccharomyces cerevisiae: cresce vigorosamente su WL Nutrient Agar in 3/4 giorni, originando colonie circolari dal diametro notevole e colore variabile dal crema al verde. Le diverse gradazioni cromatiche possono indicare la presenza di ceppi diversi; la colonia ha elevazione tipicamente umbonata, superficie liscia opaca e consistenza cremosa. Non cresce su Agar Lisina.
• Torulaspora delbrueckii: cresce su WL Nutrient Agar, in 4 giorni dà origine a colonie non distinguibili da S. cerevisiae, di colore crema che possono manifestare sfumature verdi al centro più o meno intense; hanno elevazione umbonata, superficie liscia opaca e consistenza cremosa. Cresce su Agar Lisina.
• Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata): cresce su WL Nutrient Agar in 4 giorni con colonie di colore verde intenso con profilo tipicamente piatto, superficie liscia opaca e consistenza burrosa. Cresce su Agar Lisina e su WL differenziale.
• Candida stellata: cresce in 4 giorni su WL Nutrient Agar con colonie di colore verde pisello, che col tempo diventano più scure al centro, mentre i bordi restano chiari; l'elevazione delle colonie è a cupola o umbonata. Cresce su Agar Lisina e su WL differenziale.
• Saccharomycodes ludwigii: cresce bene in 4 giorni su WL Nutrient Agar con colonie di colore verde chiaro, elevazione umbonata-convessa, superficie liscia opaca e consistenza cremosa. Cresce su Agar Lisina ma non su WL differenziale. All'osservazione microscopica presenta cellule apiculate molto grandi.
• Schizosaccharomyces pombe: cresce bene su WL Nutrient Agar in 4 giorni con colonie puntiformi, intensamente colorate in verde, che hanno superficie liscia opaca e consistenza burrosa. Cresce su Agar Lisina. L’identificazione di questa specie è facilitata dall’osservazione microscopica per la caratteristica divisione per scissione delle cellule.
• Rhodotorula spp: cresce bene su WL Nutrient Agar in 4 giorni con colonie di inconfondibile colore rosa intenso. Le colonie hanno forma convessa, lievemente umbonata, superficie liscia e mucosa e consistenza burrosa. Cresce su Agar Lisina.
• Metschnikowia spp: cresce bene su WL Nutrient Agar in 4 giorni con colonie dal diametro ridotto, di colore crema sfumato al rosa. Le colonie sono convesse, a volte leggermente rugose di consistenza farinosa, e producono sulla superficie inferiore un pigmento rosso brunastro che si diffonde anche nel terreno. Cresce su Agar Lisina.
• Pichia membranaefaciens: cresce bene su WL Nutrient Agar in 4 giorni, le colonie assumono una colorazione crema-grigia con sfumature azzurre, convessa, la sua superficie è rugosa e la consistenza farinosa. Cresce su Agar Lisina.
• Pichia anomala (ex Hansenula anomala): cresce bene su WL Nutrient Agar, dopo 4 giorni le colonie hanno colore crema o azzurro-grigio, ma assumono una colorazione decisamente azzurra dopo 8. Colonia piatta, superficie liscia e consistenza cremosa, talvolta mucosa. Cresce su Agar Lisina.
• Zygosaccharomyces bailii: cresce bene in 4 giorni su WL Nutrient Agar, le colonie hanno diametro ridotto, colore crema, elevazione a cupola, superficie liscia e consistenza cremosa. Cresce su Agar Lisina e non su WL differenziale.
• Brettanomyces spp: cresce molto lentamente e facilmente è inibito da altre specie più vigorose, pertanto se ne consiglia la conta su terreni differenziali. In 10 giorni di incubazione dà colonie tonde, uniformi, tendenti al verde su terreni colorati come WL differenziale. Cresce in anaerobiosi.

Riconoscimento batteri, colorazione di Gram

Si basa sulla differenza nella composizione chimica della parete cellulare dei Gram + e Gram -. Nei Gram negativi la parete è ricca in lipidi ed ha una composizione in peptidoglicano molto ridotta, che si lascia permeare dall’alcol con cui si decolora il complesso violetto di genziana-iodio lasciando incolore la parete cellulare, che è colorata in un secondo momento dal rosso di safranina. Al contrario, la parete dei positivi contiene una gran quantità di peptidoglicano e una scarsa concentrazione di lipidi; lo spessore del peptidoglicano e la disidratazione prodotta con l’alcol, non consentono all’alcol di entrare nella cellula, conservando la colorazione blu-violetta del complesso genziana-iodio.

Un altro metodo di riconoscimento è quello della catalasi, un enzima per la degradazione del perossido di idrogeno in H₂O e ossigeno gassoso. Se presente nei batteri analizzati, si noterà la produzione di effervescenza. I batteri lattici non lo possiedono => no effervescenza.

Conta su piastra e analisi dati

Prima di tutto è necessario verificare che le piastre siano contabili, ovvero colonie ben differenziate tra loro. Contare le colonie presenti in due diluizioni successive, verificando che sia rispettata la diluizione decimale attraverso gli appositi test analitici. Il numero N di microrganismi presenti nel campione, espresso come ∑ =UFC/mL, si calcola tramite la seguente formula: ∗1.1∗ Il numero di colonie da tenere in considerazione va da 10 a 300; se sono più di 300 ma comunque distinguibili è possibile dividere la piastra in 4 ed effettuare una stima contando solo 1 quadrante.

Filtrazione su membrana

Variante della comune conta su piastra Petri utilizzata in campioni nei quali si ritiene vi sia una carica microbica molto bassa e dunque non misurabile in modo accurato mediante conta diretta su piastra Petri. Nel settore enologico, le applicazioni sono legate al Brett in vini in conservazione e controllo di sterilità per vini imbottigliati. In pratica un volume noto di fino è filtrato su una membrana da 0.2 μm; le membrane sono poi posizionate su un terreno di coltura dove si imbevono di nutrienti e sulle quali ci sarà un'eventuale crescita microbica.

∑ = ∗Espressione del risultato: il risultato è espresso in UFC/Vs mL, con Vs = volume filtrato grazie alla formula dove Vtot è la somma dei volumi filtrati.

Analisi microbiologica di superfici su piastra

Gli obiettivi possono essere 2: verifica della contaminazione o controllo dell’efficacia di un trattamento per la sanitizzazione. Si può procedere con l’utilizzo di tamponi sterili, raccogliendo la carica microbica presente in una superficie predeterminata e successivamente trasferendo il campione raccolto dal tampone in diluente per microbiologia, dal quale alle piastre Petri. In alternativa ci sono delle piastre Petri con una particolare conformazione per la raccolta diretta del campione. Il risultato sarà espresso in UFC/unità di superficie campionata.

Bioluminetria

Il bioluminometro è uno strumento utilizzato per la verifica del grado di pulizia di superfici; le analisi svolte rilevano la quantità di ATP, quindi la presenza di materiale organico sulla superficie monitorata. Il sistema alla base del bioluminometro prevede l’utilizzo di tamponi che raccolgono l’eventuale carica microbica presente sulle superfici. Il tampone è fatto poi reagire con il complesso luciferina/luciferasi, che genera l’emissione di luce in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione di ATP presente sul tampone. Il bioluminometro misura la luce generata, indicando il livello di contaminazione in RLU (unità di luce relativa).

Microscopia

Potere di risoluzione (PdR): capacità di distinguere due punti dell’oggetto che stiamo osservando ed è relativo alla distanza fra i punti e non al diametro di questi. Il microscopio ottico ha PdR pari a 0.2 μm, quello elettronico 0.0004 μm.

Apertura numerica (AN): l’apertura numerica dell’obiettivo di un microscopio è la misura della sua capacità di raccogliere luce e di risolvere i dettagli del campione ad una certa distanza. Le onde luminose che formano l’immagine passano attraverso il campione ed entrano nell’obiettivo in un cono invertito. Un’apertura maggiore produce un’immagine più risolta e consente di osservare strutture più piccole con maggiore chiarezza.

Per aumentare l’apertura e il potere di risoluzione del microscopio, viene aggiunto un condensatore per generare un cono di raggio sul lato di illuminazione del campione; ciò consente all’obiettivo di raccogliere fasci di luce che sono il risultato di più ampi angoli di diffrazione, aumentando la risoluzione del sistema microscopico. La somma degli angoli di apertura e del condensatore viene definita apertura di lavoro.

Profondità di campo (PdC): rappresenta la distanza fra due piani, al di sopra ed al di sotto del campione da osservare, messi contemporaneamente a fuoco dall’obiettivo; è inversamente proporzionale ad AN.

Applicazioni del microscopio

• Conta delle cellule di lievito durante la fermentazione
• Osservazione della morfologia dei lieviti nelle varie fasi della vinificazione
• Verifica della presenza e della tipologia di batteri
• Controllo qualità rapido su lieviti selezionati
• Controllo di sedimenti e depositi

Conta microscopica dei lieviti

Tecnica microbiologica quantitativa, coltura indipendente. La tecnica si basa sul conteggio delle cellule di lievito presenti in un volume noto attraverso microscopio (utilizzo camera di Burker). Alla conta può essere associata la colorazione con una soluzione blu di metilene che permette di discriminare le cellule vive (incolori) da quelle morte (blu).

Conta lieviti strumentale

Sono disponibili sul mercato strumenti analitici automatizzati che restituiscono una conta delle cellule presenti in una soluzione in base a diverse reazioni chimico fisiche. Restano dubbi circa l’accuratezza del dato in soluzioni reali.

Citometria di flusso

Tecnica che permette la quantificazione e la caratterizzazione di cellule sospese in un mezzo fluido; analisi coltura indipendente che rende possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cellule ad una velocità molto rapida, permettendo una dettagliata analisi qualitativa e quantitativa di un elevato numero di cellule. Una sospensione cellulare è aspirata da un sistema idraulico di precisione, il quale ordina le cellule in un'unica sequenza ordinata; le particelle raggiungono il punto di misura dove incontrano il fascio di luce focalizzata proveniente dal laser, producendo diversi segnali, legati alle caratteristiche fisiche delle cellule ed alla presenza di molecole fluorescenti. I principali parametri sono FSC (forward scatter) che esprime la dimensione, SSC (side scatter) che esprime la complessità cellulare e Fl (fluorescenza) che esprimono la funzione del marcatore legato al cromoforo.

Vantaggi e limiti della citometria di flusso

• Vantaggi: possibilità di analisi multiparametrica, elevato numero di cellule esaminate, rapidità dei tempi di analisi.
• Limiti: difficile analisi di cellule rare, difficilmente separabili dal rumore di fondo, necessità di lavorare con campioni in fase monodispersa, impossibilità di localizzare la struttura cellulare.