Appunti Microbiologia e virologia generale

Microbiologia e virologia 2021/2022 prof. Leporati

Argomenti

• La cellula batterica
• Identificazione colonie batteriche
• Riconoscimento di batteri Gram negativi
• Coltura continua di microrganismi e struttura acidi nucleici
• Ricombinazione microbica
• Elementi trasponibili
• Meccanismi di resistenza antibiotica
• Farmaci antibatterici
• Antibiogramma
• Il regno dei funghi
• Funghi filamentosi
• Prebiotici e probiotici
• Virologia
• Attacco, penetrazione e replicazione dei virus, terapie antivirali
• Famiglie virali
• Classificazione dei virus
• Coronavirus e SARS-CoV-2
• Retrovirus

Microbiologia e virologia generale 23/09/2021

La cellula

Cellula procariotica: Presenta al suo interno capsula, parete cellulare, membrana citoplasmatica, citoplasma, ribosomi, mesosoma, nucleoide e flagello. Le cellule sono prive di un nucleo ben definito e delimitato da membrana nucleare, gli unici organuli presenti al suo interno sono i ribosomi. La membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico che può presentare proteine integrali, di membrana, periferiche ed alcuni lipidi come il colesterolo. Essa ha una funzione regolativa nel passaggio di sostanze.

La parete cellulare ha funzione protettiva, contro la pressione osmotica e fornisce resistenza. È presente in tutti i batteri ad eccezione dei micoplasmi ed alcuni archebatteri. La componente principale è il peptidoglicano, polimero costituito da acido N-acetilmuramico (NAM), N-aceteliglucosammina (NAG) e amminoacidi. La parete è responsabile del comportamento al Gram, da cui si delineano due grandi famiglie, Gram + e Gram -, protezione nei confronti della lisi, è il punto di attacco dei fagi e di numerosi antibiotici, determina la forma del batterio. È inoltre sede di specificità antigenica.

Colorazione di Gram

In relazione alla diversa composizione della parete cellulare, è visibile una colorazione diversa sul vetrino. Definisce in modo rapido e veloce che terapie effettuare, ad esempio una distinzione tra meningococco e pneumococco è fondamentale in clinica.

• Positivi: colore blu-violetto. Presentano una parete più spessa e compatta a più strati, con acidi teicoici, mono e polisaccaridi. Presentano specificità antigenica, una struttura altamente polare che si oppone a molecole idrofobiche come l’acqua. Permette al batterio di sopravvivere in un ambiente ipotonico. Nella fase della decolorazione, il colorante non riesce ad uscire ed il batterio rimane colorato.
• Negativi: colore rosso-rosato. Presentano una parete più sottile collocata tra la membrana esterna e la citoplasmatica. Sono assenti acidi teicoici. Non è in grado di contrastare il passaggio di molecole idrofobiche. Essi, quindi, presentano una seconda membrana plasmatica, che sormonta la membrana del batterio. È formata da fosfolipidi e da una molecola chiamata LPS: lipopolisaccaride di superficie. È responsabile dell'azione endotossica del batterio ed è costituita da tre elementi: lipide A, due zuccheri acido chetodesossioctonico (KDO) + eptoso e l’antigene O. A causa della sua natura lipidica non consente il passaggio di molecole idrofiliche. Risulta quindi molto più difficile attaccare un Gram -.

Forme batteriche

• Cocchi: sono cellule sferiche, spesso disposte a coppie come Diplococchi o diplobacilli sono Gram +.
• Bacilli: sono cellule cilindriche tipiche di Streptococchi o streptobacilli di Gram - disposti in catene.
• Coccobacilli: forme intermedie.
• Vibrioni, spirilli, spirochete: Sarcine disposti a gruppi di otto.

Movimento della cellula batterica

I batteri si dividono in base al numero di flagelli: I Monotrichi possiedono un solo flagello, gli Anfitrichi presentano due flagelli alle estremità, i Lofotrichi più flagelli a formare un ciuffo mentre i Peritrichi hanno più flagelli sparsi su tutta la superficie.

Composizione di un flagello

Varia in base al Gram, è di forma elicoidale e fuoriesce dalla cellula. Presenta un corpo basale o cinetostoma accomunata dalla presenza di un anello MS immerso nella membrana citoplasmatica e protone-motrice complessato con proteine MOT che permettono il moto grazie ad un'azione e proteine FLI che invertono la rotazione dell'uncino.

Pili o fimbrie

Molto più piccoli, servono per aderire alle mucose e alle superfici. Sono costituite da proteine dette piline. Particolari pili sono i fattori F fondamentali nella coniugazione.

Spore batteriche

Alcuni Gram + danno origine a strutture dette spore (forme di resistenza) che si replicheranno in condizioni ottimali. Possono essere endospore, che si originano dalla cellula madre. Possono essere più grandi (Clostridium) o più piccole (Bacillus) in base al batterio. Danno una latenza metabolica, il DNA è circondato da corteccia, mantello/rivestimento ed esosporio ed in seguito sono espulse in stato di quiescenza.

• Clostridium botulinum, la germinazione della spora produce una tossina che impedisce il rilascio di acetilcolina portando a paralisi flaccida. L'intossicazione avviene in seguito a ingestione di cibo contaminato.
• Clostridium tetani, colpisce la terminazione del motoneurone con conseguente paralisi spastica. È possibile vedere risus sardonicus. La morte avviene in seguito ad insufficienza respiratoria.
• Bacillus anthracis, causa la malattia del tosatore.

Cellula eucariotica

Presenta al suo interno i mitocondri e un nucleo poroso, delimitato da due membrane e ben strutturato. La membrana plasmatica è selettiva, forma e rigidità sono dati dal citoscheletro. I ribosomi batterici sono differenti, grazie a questo possiamo utilizzare antibiotici specifici, salvaguardando la cellula sana. I virus sfruttano il nucleo e i mitocondri durante la replicazione.

Microbiologia e virologia generale 28/09/21

Identificazione delle colonie batteriche

L'identificazione di colonie batteriche: Piastre di colture batteriche sono fondamentali per il riconoscimento nella diagnostica clinica. Esistono diverse tipologie di terreni:

• Di trasporto: Mantengono vitale il batterio, contengono tutte le strutture nutritive. Solitamente sono liquide e successivamente andrà seminato.
• Ricchi e di arricchimento: Sono estremamente ricchi contenendo numerosi fattori di crescita.
• Selettivi: In esse crescono solo determinati tipi di batteri.
• Differenziali: Possono crescere colonie di differenti colori distinguendo microrganismi differenti.

Nutrimenti nei terreni di coltura

• Peptoni: Insieme di composti idrosolubili ottenuti per idrolisi delle proteine.
• NaCl: In base alle necessità osmotiche differenti.
• Zuccheri: Come glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari, come ad esempio con i lieviti.
• Arricchimenti come estratti che forniscono fattori di crescita e Sali inorganici, supplementi selettivi specifici ovvero antibiotici o a spettro meno definito, indicatori coloranti che permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio esaminato determinando un viraggio di colore a valori critici di pH.

Tipi di terreni

• Columbia blood agar base: Terreno principe su cui cresce tutto, è di uso generale, ed è utilizzato anche con i lieviti. Se il terreno è pulito si può essere abbastanza sicuri che il campione sia incontaminato.
• Agar sangue: I Gram crescono tutti uguali sulla piastra, occorre quindi seminarli sull’ Agar MacConkey.
• Hektoen: Differenziale e selettivo per isolare Salmonella e Shigella. È presente il tiosolfato, quando cresce la salmonella presenta un tipico odore.
• MacConkey: Fondamentale per la crescita dei Gram -, si vedono bene le colonie dei diversi batteri. La salmonella non cresce più su questo terreno. I Gram + non riescono a crescere su di esso.
• Agar Salt Mannite: Selettivo per l’isolamento dello stafilococco aureo. Le colonie appaiono giallo-oro brillante.

Diversi fattori che influenzano la crescita batterica

Troviamo la temperatura che comporta la distinzione in psicofili 0°-20°C, mesofili 10°-50°C, termofili 40°-75°C e ipertermofili 70°-110°C. I maggiori batteri utilizzati crescono a 37°C. Il pH acidofili <6, neutrofili 6-8 e alcalofili >8, la concentrazione salina e la presenza di ossigeno Aerobi obbligati vivono solo in presenza di O₂, aerobi-anaerobi facoltativi, anaerobi obbligati e microaerofili.

Le fasi di crescita

• Latenza: nella quale si ha l'adattamento all’ambiente.
• Crescita esponenziale: in cui il microrganismo si replica molto velocemente.
• Stazionaria: il numero totale dei microrganismi in rapporto rimane costante.
• Declino: si esauriscono i nutrienti.

Colorazione di Gram

Consente di dare definizione e morfologia del batterio, senza effettuare la coltura. Viene effettuata in pochissimo tempo e non necessita di grandi attrezzature. È molto utilizzata in clinica.

Allestire e fissare il preparato:

1. fenicato di nicolle sul vetrino per 1'
2. Violetto di genziana, eliminare l’eccesso di colore.
3. 1' Lugol
4. Decolorare con alcol fino a che il preparato non cede più colore 10"
5. Lavare con acqua distillata. 1'
6. Colorante di contrasto, Fucsina o Safranina o Eosina. di colore rosso.
7. Lavare con acqua distillata.
8. Asciugare.
9. Osservare a 1000x in immersione.

Il comportamento alla colorazione varia in base alla presenza di Gram + o Gram -. Gram + disidratazione della parete cellulare con alcol, riduzione della permeabilità, permane il primo colorante: Violetto. Impossibile assorbire il rosso. Batteri colorati in Blu-Violetto. Gram - LPS solubilizzata dall’alcol, aumento permeabilità membrana esterna, eliminazione del primo colorante, assorbimento del colorante di contrasto: Rosso. Batteri colorati in Rosso.

Colture nei terreni

In un tampone cutaneo, seminiamo prima su Agar sangue, successivamente MacConkey e Candida. Occorre sapere che terreni usare ed in che momento. In un’analisi gastrointestinale utilizzeremo il Hektoen, non cercheremo mai E. Coli. In un’urina Sangue e MacConkey.

Terreno Agar Sangue: In essa si distinguono solo i Gram + che danno colonie differenti. Per effettuare il riconoscimento da materiale respiratorio per prima cosa andiamo sotto cappa.

Terreno Agar Sale Mannite: Lo stafilococco aureo rende il terreno giallo fermentando la mannite.

Terreno Agar MacConkey: La piastra è rosa, su di essa crescono i Gram -, quando fermentano il lattosio la piastra resta rosa, se non sono in grado la piastra diventa gialla. In base alla morfologia capiamo se è presente la capsula, in Klebsiella rispetto ad E. Coli la piastra presenta colonie mucose simili ad un liquido.

Staphylococcus aureus, cicciotto e con emolisi, lo confermiamo con Agar mannite. Streptococcus agalactiae, è in grado di superare la placenta, pericoloso durante il parto può dare meningite fulminante. È di gruppo B. Enterococcus faecalis e streptococcus pyogenes: A catalasi negativa, appartengono a streptococchi o enterococchi, non formano bolle con acqua ossigenata.

Microbiologia e virologia generale 30/09/21

Riconoscimento di batteri

Identificazione di colonie batteriche: piastre di colture batteriche per il riconoscimento nella diagnostica clinica.

NB: Streptococchi/enterococchi = catalasi negativa, forma coccoide ma formano delle catenelle. Stafilococchi = catalasi positiva, forma coccoide a grappolo.

Terreno agar sangue – Crescono Gram + (che possiamo distinguere), Gram (che non possiamo distinguere ad eccezione del Proteus Mirabilis, le colonie sono costituite da una patina verdastra che copre la piastra e odore forte) e lieviti.

Riconoscimento

Pneumococco:

• Pneumococco (1) → Coltura pura, colonie mucose, traslucide, verdastre, è capsulato (causa di una mutazione resistenza maggiore agli antibiotici) ed è un Gram +. Materiale respiratorio: attraverso acqua che viene inalata nei bronchi e poi ripescata si cerca la presenza di eventuali batteri nelle vie profonde (che devono essere sterili scelta di un agar sangue). Se attacca le vie respiratorie e arriva al cervello può causare la meningite da pneumococco.
• Pneumococco (2): Verdastro, piccolo, non mucoso, secco, a pedina di dama (colonie incavate, tipico del pneumococco). All’interno vi è un antibiotico (optochina) → il pneumococco è sensibile e nella zona circostante non troviamo il batterio. In questo caso è di un bambino: ferita infetta che non guarisce (batterio che ai trova nelle alte vie respiratorie viene portato sulla ferita perché i bambini tendono a leccarsele).

Stafilococco aureo: Colonia emolizzata (dove ci sono le colonie la piastra è più chiara perché sono stati distrutti i globuli rossi), colonia bianca, cremosa, NON fermentanti → NB: lo stafilococco ha un enzima (=catalasi) che utilizza ossigeno se verso gocce di acqua ossigenata su una colonia questa produce bolle. Nel sangue rilascia tossine che si legano alle cellule dell’endocardio causando pericardite. Se voglio essere sicura che sia stafilococco aggiungo un terreno agar sale di mannite.

Enterococco: No emolisi, colonie piccole e grigie, NO catalasi (=NO bolle con acqua ossigenata). Pericoloso nelle ferite, a livello vaginale, urine e gola.

Streptococchi

• Streptococcus piogens (streptococco di tipo A): Colonie bianche ma più piccole, alone intorno più grande, molto emolizzati, puntiformi. NO catalasi (=NO bolle con acqua ossigenata), produce streptolisina di tipo A → Causa tonsillite e faringite se entra nel sangue causa la scarlattina rilascia tossine (“TAS”), se entra in una ferita causa la fascite necrotizzante (distrugge il muscolo). Penicillina iniettiva e quando fallisce vi è la rimozione delle tonsille.
• Streptococcus agalactia (streptococco di tipo B): Produce una streptolisina di tipo B, catalasi negativo, emolitico. Si trova nell’intestino, pericoloso nelle urine e vagine: → diventa pericoloso durante il parto bambino si infetta: meningite fulminante.

NB: SONO TUTTI GRAM +, i primi due provengono dall’apparato respiratorio mentre gli ultimi due da un tampone.

Agar sale mannite

Ha normalmente il colore rosa (dove abbiamo due colonie di stafilococco epidermidis); mentre in basso il colore giallo è dovuto alla presenza dello stafilococco aureo.

Enterobatteri

• Abitano nell’uomo e negli animali, principalmente si trovano nell’apparato digestivo. Nell’insieme sono:
• Gram -
• Asporigeni (NON producono spore)
• Mobili se provvisti di flagelli, immobili altrimenti
• Quasi sempre provvisti di pili
• Aerobi, anaerobi facoltativi

Agar MacConkey

Normalmente è rosa e porta alla crescita di batteri Gram - (terreno selettivo). Batterio fermentante il lattosio = colore rosa. Batterio NON fermentante il lattosio = colore giallo.

E. Coli

Cresce rosa perché fermenta il lattosio, non produce la capsula, colonia secca e distinguibile. Ha un incavo all’interno dovuto alla morte dei batteri più vecchi (la colonia parte dal centro e via via si allarga, i batteri “vecchi” che stanno morendo cadono all’interno). In mezzo vi sono anche dei “pallini” non fermentanti gialli → Proteus. Si può trovare a livello intestinale perché fa parte dell’intestino.

Proteus

Cresce giallo perché non fermenta il lattosio (NON identificabili). Vive nell’intestino ed è pericoloso se entra in una ferita.

Klebsiella

“Cicciotta”, “cremosa”, cresce rosa perché fermenta il lattosio ma è una colonia a cupola (batterio → capsulato forma di resistenza ai farmaci). Nell’ultima spatolata si riescono a riconoscere le colonie (che sono molte). Normalmente vive nell’intestino, è pericoloso se entra nei bronchi (si può anche respirare e può essere trasmesso tramite le “gocce” del respiro). Nella vaginite da Klebsiella porta a delle perdite (può colpire il sistema urinario sia a livello di vescica, sia a livello della vagina) - Può trovarsi nell’acqua.

Enterobacter cloacae

Gram -, NON fermentante, a cupola, produzione della capsula, traslucida (simile alla Klebsiella).

Serratia marcescens/sanguinis

Gram -, non fermenta il lattosio (colonie giallo-rosato/rosso sangue nel Sabouraud Agar). Presente nelle acque, NON si trova nel nostro organismo (è un ambientale). Piastre di bambini con età fra le 2-3 settimane (morti): batterio entrato in bambini nati prematuri, mai usciti dall’ospedale → dentro al disinfettante per le mani.

Altri batteri

• Pseudomonas aeruginosa

Agar sangue – Sembra limatura di ferro, traslucide, colore del ferro, Gram - colonie piatte. Si trova ovunque ad eccezione del corpo umano (pericoloso ovunque si trovi). Fatica a crescere in questa piastra se c’è uno stafilococco aureo. Agar MacConkey Molto simile ad altri batteri (ma ha un odore caratteristico) e appaiono verdastre (alcune sono in grado di produrre tio).