Appunti Fisica per la bioingegneria

Indice

• Fluorescenza ........................................................................................................................................ 1
• Microscopio ottico ................................................................................................................................... 8
• Dark, Bright field e fluorescenza ............................................................................................................. 11
• Wide field, microscopia laser ................................................................................................................. 14
• Microscopia ottica non lineare ............................................................................................................... 19
• Microscopia, generazione di seconda armonica .................................................................................. 23
• Microscopia Raman ................................................................................................................................ 28
• Microscopia CARS .................................................................................................................................... 32
• Total Internal Reflection microscopy (TIRF) .......................................................................................... 34
• Microscopia Fret ...................................................................................................................................... 35
• Lifetime fluorescence microscopy FLIM ................................................................................................ 36
• Microscopia con deconvoluzione ............................................................................................................ 37
• Microscopia 4pi ........................................................................................................................................ 38
• Microscopie a super risoluzione .............................................................................................................. 39
• Illuminazione strutturata ....................................................................................................................... 39
• STED: Stimulation Emission Depletion .................................................................................................. 43
• Localizzazione ........................................................................................................................................ 44
• Molecole fotoattivabili (Palm e Storm) ................................................................................................... 45

Appunti di Fisica per la bioingegneria, mancano le prime due lezioni. La Microscopia a foglio di luce è alla fine e sono le informazioni usate nella relazione.

Fluorescenza

La fluorescenza è la capacità che hanno alcuni oggetti o minerali di assorbire una luce di un particolare colore e di emettere luce a un colore diverso. In sostanza è la capacità di far cambiare il colore della luce. Il concetto di fluorescenza fu formalizzato per la prima volta da Stokes, che fece un esperimento ingegnoso all'interno di una chiesa con dei vetri colorati. Lui scelse delle finestre di colore blu e quindi, la luce che attraversava queste finestre veniva filtrata facendo entrare nella chiesa solo una luce blu. Utilizzò poi una soluzione con del chinino e si posizionò a 90 gradi. Osservò la soluzione attraverso dei bicchieri di vino fatti in vetro giallo e in questo modo filtrava tutte le lunghezze d'onda al di sotto dei 400. La luce blu non riusciva a passare dal suo bicchiere di vino e quindi guardando la soluzione di chinino dal suo bicchiere, notava che emetteva luce, ma non era la stessa luce perché aveva un colore diverso a causa del suo bicchiere. Si accorse che la lunghezza d'onda emessa dalla soluzione era maggiore rispetto alla lunghezza d'onda incidente. C'è quindi uno spostamento della lunghezza d'onda tra la lunghezza d'onda di eccitazione e la lunghezza d'onda di fluorescenza, quest'ultima è sempre maggiore della lunghezza d'onda di eccitazione. Questo spostamento si chiama Stokes Shift. In termini energetici vuol dire che la luce di fluorescenza è composta da fotoni a meno energia. In questo caso i fotoni venivano assorbiti dalla chinina.

Come fa la chinina ad assorbire i fotoni? Possiamo approssimare la molecola di chinina come un sistema a due livelli, un primo livello energetico che chiamiamo Ground State e un livello energetico che chiamiamo Banda Eccitata. Ovviamente una approssimazione di questo tipo non può giustificare lo Stokes Shift. Un sistema a due livelli funziona in questo modo:

• Nel momento in cui investiamo il sistema con un fotone, che ha una energia uguale al gap energetico tra un livello e l'altro, succede che il sistema può assorbire energia attraverso una transizione elettronica che si chiama α.
• Quando l'elettrone si trova nel sistema eccitato, ha due scelte cioè o un decadimento spontaneo kr, cioè riemette un fotone spontaneamente, oppure abbiamo un decadimento stimolato cioè sfrutta l'arrivo di un altro fotone per stimolare il suo rilascio energetico.

Un sistema di questo tipo non può spiegare lo Stoke shift perché abbiamo le stesse energie e perché questa è anche una approssimazione. Gli spettri delle molecole sono molto complessi, una molecola può assorbire energia non solo per transizioni energetiche elettroniche, ma anche vibrando (accumulo per vibrazione) oppure con una rotazione. Abbiamo delle bande rotovibrazionali molto fitte. Quindi le transizioni energetiche possiamo vederle come l’insieme di transizioni elettroniche che sono quelle grandi, ma accompagnate a queste abbiamo delle bande rotovibrazionali. Un sistema di questo tipo può generare lo Stokes Shift. La prima banda del livello rotovibrazionale la chiamiamo S e la seconda banda del primo livello elettronico eccitato S₁. Supponiamo che un elettrone si trova a fondo banda quindi, quando mandiamo ed eccitiamo la molecola con un fotone, che ha una energia uguale a una transizione energetica garantita tra i livelli S₀ e S₁, la molecola si può eccitare. Una volta eccitata quello che avviene è un rilassamento rotovibrazionale, cioè la molecola perde energia arrivando a fondo banda del primo livello elettronico eccitato (questo succede per scambi termici con le molecole vicine). A seguito di questo rilassamento che è estremamente veloce (picosecondi), la molecola quindi ha due modi per decadere, o radiativo kr e cioè rilascia un fotone emettendo luce oppure tramite un decadimento non radiativo non emettendo luce knr (per esempio per collisioni termiche, chimica). Questo processo può spiegare l'emissione dei fotoni kr, che hanno una energia minore. La perdita di energia è dovuta proprio a quella fase di rilassamento che fa quindi rilasciare un fotone ad energia minore ma a lunghezza d'onda maggiore. Chiamo S₀(t) e S₁(t) la probabilità di trovare un elettrone nelle due bande. La somma deve essere sempre uguale a 1.

Se faccio la derivata rispetto al tempo:

Il primo termine è col segno -αS₀ poiché vado da S₀ a S₁, il secondo termine è la somma dei kr e knr per S₁. Ci sarà in un momento, una fase stazionaria in cui ci saranno molecole che escono e tante molecole che entrano, questo momento lo trovo ponendo a zero.

Possiamo risolvere adesso l'equazione sostituendo a S₀ il valore 1-S₁. τ è detto tempo di vita media del sistema eccitato. Andiamo a quantificare S₁ perché così posso quantificare i fotoni di fluorescenza. Infatti, così so quale è la probabilità che avvenga l'evento kr. Kr moltiplicato per S₁ mi rappresenta proprio il rate che avvenga la transizione: ma se questa transizione induce la fuoriuscita di un fotone, il rate della transizione è anche uguale al rate di fotoni, cioè a quanti fotoni escono fuori. Questo rate di fotoni che escono fuori lo posso scrivere uguale alla potenza di fluorescenza (w) diviso quanto è l'energia del singolo fotone di fluorescenza. Ottengo alla fine l'equazione per la potenza di fluorescenza.

Possiamo avere due regimi:

Il primo regime è dove ατ è molto minore di 1 che equivale a dire che α è molto minore di kr e knr. Quindi questa molecola ha una probabilità in uscita verso S₀ molto minore della probabilità in ingresso da S₁. Posso quindi determinare alfa. Ricordo inoltre a quanto fosse uguale la potenza grazie alla sezione d'urto e mi trovo il valore della potenza. q è per definizione definito kr /(kr +knr). Il fattore q ha un senso fisico importante si chiama quantum yield, potenza quantica. Essa rappresenta quanto è grande kr rispetto ai canali di uscita. Se kr, ad esempio, è uguale a zero significa avere una pessima molecola fluorescente. Se kr fosse 1 avremmo il caso opposto. È ovvio che questa equazione ci dice che più è forte l'intensità della luce più abbiamo fluorescenza, in più è proporzionale alla sezione d'urto di assorbimento perché deve saper assorbire, e infine proporzionale a q.

Se consideriamo adesso α molto maggiore di 1, significa che alfa è molto maggiore di kr+knr e che quindi il canale di uscita è molto più probabile di quello di ingresso. Quindi in questo caso la potenza della saturazione deriva da tutte componenti costanti, questo spiega semplicemente la saturazione. Immaginiamo che io aumento l'intensità e inizio a sparare fortissimo i fotoni, ad un certo punto i fotoni non avranno più tempo di andare in ingresso a S₀. Rimangono intrappolati in S₁, poiché prima di decadere loro si trovano su S₁ e l'ordine di vita è dei nanosecondi quindi, se mando un fotone prima che lui sia sceso in S₀ il fotone non serve a nulla. Quindi se ho popolato tutto S₁ sono vincolato da kr. Non ha senso mandare tanta energia perché poi si raggiungerà la saturazione.

Tutte queste considerazioni non corrispondono alla realtà. Gli elettroni si accoppiano con spin antiparalleli, stato di singoletto. Questo ci serve per capire come si dispongono i vari elettroni negli strati di energia. Il problema è che quando eccitiamo la molecola non c'è più il principio di esclusione, quindi, non devono per forza stare nello stato di singoletto ma si possono accoppiare in diverse configurazioni. Possiamo avere lo stato di singoletto, oppure lo stato tripletto. Quando siamo in S₀ gli spin sono accoppiati in modo antiparallelo per avere la risultante di momento angolare uguale a zero. Quando noi eccitiamo la molecola non c'è più alcun principio di esclusione che tenga, quindi questi due si possono accoppiare in vari modi, o stato di singoletto oppure stato di tripletto dove il momento è diverso da zero. Lo stato di tripletto lo abbiamo a causa delle interazioni tra gli spin elettronici e nucleari e non ha una banda energetica uguale.

Uno spettro molecolare è questo: possiamo avere anche uno stato di tripletto cioè un altro livello rotovibrazionale quasi uguale a S₁ ma con una energia più bassa in cui però la configurazione dei due spin è in uno stato di tripletto diverso da S₁. A causa di urti con le molecole si può generare intersisting crossing, cioè l'urto fra le molecole crea uno scambio di spin, questo intersisting è di una grandezza di millisecondi e rispetto a kr e knr ha una tempistica diversa. È poco probabile quindi entrarci ma è anche poco probabile uscirci. Quindi la molecola che poi genera uno strato di tripletto rimane intrappolata nel suo stato (dark) e la probabilità che poi ne esca è comunque bassa. Questo genera il photo blinking, nel grafico sono quelle perturbazioni in basso. Quindi questo per dire che la molecola genera una potenza che è sempre la metà di quella che potrebbe offrire perché metà della vita lo passa nello stato dark.

Può succedere che la molecola può andare in uno stato irrecuperabile k bleaching e quindi non è in grado di generare fluorescenza. Lo hanno scoperto perché hanno notato proprio che dopo un po’ la fluorescenza perdeva di intensità. A volte, comunque, il tripletto può generare un kt che è radiativo e può emettere luce. In questo caso si parla di fosforescenza. La fluorescenza serve per marcare determinate cellule e tessuti in modi diversi. Ovviamente è difficile inserire delle sonde nelle cellule e ci sono diversi metodi. Grazie alla scoperta di questa medusa fosforescente si è scoperta una proteina fluorescente capace di assorbire luce blu e illuminarsi di verde. Questa proteina è chiamata GFP (Green Fluorescence Protein) e ha rivoluzionato la microscopia. Basta quindi fare una manipolazione genetica per far in modo che la cellula la produca, posso anche scegliere il dove nella cellula.

Microscopio ottico

Questo è un microscopio ottico, è costituito da un corpo chiamato stativo che è la parte meccanica del microscopio. È molto complessa da un punto di vista meccanico, questo perché c’è il bisogno di una stabilità che è proporzionale al livello risolutivo. Abbiamo due tipi di microscopio, dritto o invertito. Il primo, il microscopio dritto ha l'obiettivo verso l'alto rispetto al campione, quindi il sistema di illuminazione con il condensatore che convoglia la luce è posto sotto. Sono comodi perché il campione viene messo a testa in su. Tutto il sistema di acquisizione però è sbilanciato rispetto al resto del sistema. Possiamo al massimo avere meno precisione perché la stabilità meccanica può essere compromessa. Il microscopio invertito invece ha una configurazione opposta, cioè il condensatore e il sistema di illuminazione è verso l'altro e il campione verso il basso. È più stabile, però il campione viene messo a testa in giù.

In microscopia o usiamo la tecnica di assorbimento o quella di diffusione. Per fare questo si utilizzano delle radiazioni, usiamo infatti delle lampade alogene al tungsteno. Abbiamo una lampada ad alta potenza e un sistema di ventilazione per evitare che esploda. Abbiamo poi una lente di collettore che serve per raccogliere la luce e spedirla verso il microscopio. Per creare una illuminazione uniforme, si porta inizialmente il filamento ad alte temperature, quindi con emissione da corpo nero con uno spettro accettabile. La luce deve essere convogliata, in questo caso non abbiamo una sorgente puntiforme, infatti, se avessimo una sorgente puntiforme potremmo mettere la sorgente al fuoco di una lente convergente in modo che i fasci che escono dalla sorgente e che usciranno dalla lente saranno collimati, e, quindi avremo una propagazione di onda piana e un fronte d'onda omogeneo. In questo caso invece non abbiamo una sorgente puntiforme ma un filamento di una lampadina con le sue dimensioni. Il trucco è come sfruttare tutta la luce del filamento per fare una illuminazione uniforme.

Per prima cosa potremmo utilizzare un sistema che riproduce l'immagine del filamento dove c'è il nostro oggetto. Così avremo una alta efficienza di trasferimento della luce però abbiamo un’immagine non uniforme. Un approccio utilizzato è l’illuminazione di Kohler. Si mette una lente di collettore in prossimità della lampada, questa lente convergente è posta a una distanza f rispetto al filamento; quindi, i punti luminosi distribuiti lungo il filamento vengono raccolti con angoli diversi ed escono dalla lente collimati con angoli diversi dall'altro. Utilizzo un'altra lente detta field lens che va a riformare l'immagine del filamento in una certa posizione e, in prossimità del filamento viene posto un condensatore. Il condensatore è una lente ad alta apertura numerica che focalizza estremamente la luce. Si crea quindi una immagine sulla lente ed essa si comporterà come la prima lente, i fasci così usciranno collimati. L 'idea è quella di mettere il campione nel fuoco della lente del condensatore. Nel secondo fuoco del condensatore quello che abbiamo sono tutti i punti del fascio collimati che andranno a convogliarsi. Abbiamo il punto di massima illuminazione ed è estremamente uniforme. Il condensatore è una lente complessa dove abbiamo diverse lenti all'interno. Infatti, le lenti semplici presentano le aberrazioni ottiche. Esse sono di due tipi, monocromatiche e cromatiche. Sono una sorta di “difetti”. Le prime sono delle aberrazioni che riguardano una singola lunghezza d'onda dove la lente non si comporta come ci saremmo aspettati. La seconda invece riguarda i colori cioè ci accorgiamo che i colori si comportano in maniera diversa. La più grande forma di aberrazione si chiama sferica, in genere si dice che le aberrazioni sono dei difetti ma non è così, la lente esegue il suo compito, nella realtà però alcune approssimazioni che si fanno non corrispondono a verità. In particolare, una lente biconvessa in condizione standard ha un punto di fuoco che convoglia tutti i fasci che si propagano paralleli all'asse ottico, essa segue questa formula che dipende dalla geometria della lente:

Quindi qualunque fascio va a cadere nel fuoco. In realtà non è così, i fasci che sono più vicini all'asse ottico principale, vengono focalizzati in un punto di fuoco che è più distante rispetto ai fasci che sono più distanziati.