Appunti esame biologia dello sviluppo

Distinzione tra protostomi e deuterostomi

In base alla formazione del celoma distinguiamo i metazoi in protostomi e deuterostomi. I protostomi si riproducono per schizocelia mentre i deuterostomi si riproducono per enterocelia. Un’altra caratteristica dei deuterostomi è quella di possedere le cavità amniotica. In base alla presenza o meno della cavità amniotica si distinguono organismi anamni e organismi amnioti. La cavità amniotica ha reso possibile lo svincolo della riproduzione dall’ambiente acquatico.

Caratteristiche dello sviluppo

Le caratteristiche principali dello sviluppo sono:

• Ordine e diversità
• Continuità della vita

Ordine perché lo sviluppo è caratterizzato da una serie di eventi che rispettano tempi precisi; la diversità è data ad esempio da tutte le diverse cellule che si trovano all’interno dello stesso embrione; tutte queste caratteristiche permettono la continuità della vita.

Fasi della vita di un organismo

Nella vita di un organismo si distinguono due fasi principali: nella prima fase si assiste al differenziamento dei tipi cellulari e quindi alla morfogenesi e all’accrescimento ossia l’aumento in dimensioni (raggiunta una certa taglia si raggiunge la maturità sessuale); nella seconda fase si ha invece la riproduzione.

Riproduzione sessuale

La riproduzione sessuale o gametica ha tre fasi fondamentali:

• La formazione dei gameti
• La sessualità e l’unione dei gameti
• Lo sviluppo, ossia l’accrescimento dello zigote

La sessualità non è un processo riproduttivo ma è un processo di adattamento che garantisce una maggiore varietà di DNA. Due batteri, ad esempio, possono comunicare tra loro mediante un ponte citoplasmatico e quindi attraverso pili, ma alla fine di questo processo non si osserverà un aumento del numero di individui. Parliamo quindi di sessualità e non di riproduzione.

Modelli di riproduzione

Esistono poi anche altri modelli. Due parameci formano un ponte citoplasmatico. I micronuclei vanno incontro a meiosi formando otto micronuclei aploidi. I macronuclei e tutti i micronuclei eccetto uno degenerano. Il micronucleo rimasto si divide formando un micronucleo stazionario e un micronucleo migrante. I micronuclei migranti attraversano il ponte citoplasmatico e fecondano i micronuclei stazionari dei partner. Si forma un nucleo diploide che andrà incontro a mitosi e genererà un nuovo macronucleo e due micronuclei.

Un altro modello è dato dalla riproduzione sessuata di Chlamydomonas: quando due ceppi si uniscono possono generare una cellula diploide che può compiere meiosi formando quattro nuovi organismi aploidi. Nei batteri e nei parameci parliamo di sessualità mentre in Chlamydomonas parliamo di riproduzione in quanto il numero di individui aumenta.

Esempi di riproduzione complessa

L’uovo del riccio di mare è particolarmente complesso. Presenta un involucro gelatinoso che attira lo spermatozoo e offre protezione. Subito sotto c’è un’altra membrana chiamata membrana vitellina a livello della quale si fermano gli spermatozoi. Osserviamo poi la membrana plasmatica al di sotto della quale si trovano i granuli corticali. Nel citoplasma ci sono i soliti organelli e il nucleo è centrale. Anche nei mammiferi gli spermatozoi si legano a livello della zona pellucida. Lo spermatozoo si muove grazie al flagello. Se si effettua una sezione trasversale del flagello di spermatozoo di mammifero si osservano l’assonema centrale con le fibre esterne. L’assonema presenta la struttura 9+2 ed è formato da nove coppie di microtubuli periferici e da due coppie di microtubuli centrali. Le nove coppie periferiche sono costituite da due microtubuli uniti tra loro: un tubulo A (con due bracci di dineina che si protendono verso i tubuli B) completo e un tubulo B che si associa al tubulo A per completarsi. La fecondazione avviene ad opera di un solo spermatozoo mentre gli altri verranno allontanati.

Benefici della riproduzione sessuale

La riproduzione sessuale è estremamente complicata eppure è la modalità di riproduzione che caratterizza gli organismi più evoluti. Il problema del sesso è quindi comprendere quali benefici esso comporti a fronte dei suoi costi, in modo da poterne giustificare la comparsa e la diffusione per selezione naturale nel corso dell’evoluzione. L’ipotesi del Red Queen è un’ipotesi evolutiva che spiega il vantaggio della riproduzione sessuale. Il sesso è necessario per rimanere in gara coevolutiva contro i propri parassiti. I genomi dei microparassiti (virus, batteri) evolvono rapidamente. Un clone, per la sua omogeneità genetica e superiore potenzialità riproduttiva, è un bersaglio più vulnerabile per i microparassiti rispetto ad una popolazione sessuale rappresentata da molti genomi diversi in quanto ricombinati, per cui quest’ultima potrebbe recuperare il costo della sessualità in termini di fitness.

Il principale beneficio del sesso sarebbe che esso consente di contrapporre alla roulette genetica dei microparassiti, in grado di produrre sempre nuovi genomi per mutazione, la roulette genetica della sessualità, in grado di produrre sempre nuovi genomi attraverso i meccanismi della segregazione cromosomica, ricombinazione allelica e cariogamia. Di fronte all’attacco di un microparassita molto aggressivo, l’estinzione di un clone può essere scongiurata solo da una nuova mutazione efficace. In una popolazione sessuale, invece, la diversificazione ricombinativa dei genomi è già una difesa efficace contro l’estinzione, anche in assenza di nuove mutazioni.

Linee di pensiero nella biologia dello sviluppo

Nella storia si sono avute due linee di pensiero: la linea di pensiero dell’epigenetica e la linea di pensiero del preformismo. L’epigenetica è una branca della genetica che studia le proprietà delle cellule che vengono modificate dall’ambiente nel quale vivono. Il preformismo afferma che nello spermatozoo si trova già precostituito in miniatura, con tutte le sue parti, l’animale adulto.

mRNA materni e processi epigenetici

Nel citoplasma della cellula uovo oltre al nucleo si trovano mRNA materni. Questi sono estremamente labili ma sono presenti fino a circa i 50 anni d’età. Ciò è possibile in quanto questi mRNA sono protetti grazie a proteine dalle RNasi. Anche a livello dello spermatozoo sono presenti mRNA e RNA non codificanti che intervengono nei processi epigenetici.

Modelli di sviluppo embrionale

L’analisi sintetica dello sviluppo tiene conto del fatto che gli eventi molecolari, le risposte e le interazioni cellulari e lo sviluppo dell’embrione si controllano l’un l’altro in modo ciclico. Tra i vertebrati il principe dei modelli è il modello di Zebrafish. La fecondazione è esterna e i gameti vengono rilasciati in acqua. Lo sviluppo embrionale avviene a carico delle riserve presenti nella cellula uovo. La segmentazione porta lo zigote da una forma unicellulare a una forma pluricellulare. Le cellule si formano sopra il tuorlo. La segmentazione prosegue, inizia la gastrulazione e quindi il differenziamento dei foglietti embrionali e infine si ha l’organogenesi. La fase embrionale termina nel momento della schiusa e si ottiene la larva. Dalla larva si passa poi allo stato adulto e, raggiunta la maturità sessuale, verranno di nuovo prodotti i gameti.

Altro modello è quello degli anfibi come Xenopus. In questo caso la segmentazione è totale. La fase larvale ossia il girino è una forma di vita acquatica. Con la metamorfosi si avrà lo sviluppo degli arti e quindi il passaggio alla terra ferma. La metamorfosi avviene grazie a dei segnali.

Ultimo modello è quello mammifero del topo. In questo caso sia la fecondazione sia lo sviluppo dell’embrione avvengono all’interno delle vie genitali femminili. Viene definito neotenia il fenomeno evolutivo per cui negli individui adulti di una specie permangono caratteristiche morfologiche e fisiologiche tipiche delle forme giovanili. Tra i caratteri neotenici nell’adulto vi sono teste proporzionalmente grandi e gambe proporzionalmente corte.

Tecniche classiche di studio della biologia dello sviluppo

Vediamo quali sono le tecniche classiche per lo studio della biologia dello sviluppo. L’analisi dei frammenti di DNA è stata resa molto più veloce e potente dall’applicazione della tecnologia dei microarray o biochip, che è stata sviluppata negli anni ‘90 del secolo scorso. Si tratta di sottili supporti di materiale plastico o vetro su cui si trovano molte migliaia di pozzetti, ciascuno contenente pochi picogrammi di una diversa sonda di DNA a singola elica. I biochip vengono sfruttati per identificare la presenza e l’espressione di un gene in un dato tipo cellulare o, più in generale, per tracciare il profilo di espressione di quel tipo cellulare in un dato momento. Sfruttando il gran numero di pozzetti, infatti, è possibile effettuare in un solo test la ricerca contemporanea di moltissimi geni, realizzando in poche ore quel che un tempo avrebbe richiesto anni di lavoro di laboratorio. Questa tecnica è stata scavalcata dalla tecnica RNA-seq.

Nella tecnica Whole-mout in situ hybridisation l’embrione viene fissato e reso permeabile alla sonda d’interesse marcata. In questo modo si può verificare dove si trova e quanto è presente quel gene o quella proteina.

Segnali cellulari

La membrana è un doppio strato fosfolipidico. La maggior parte delle proteine transmembrana presentano un dominio extracellulare, uno o più domini transmembrana e un dominio citoplasmatico. Altre proteine sono ancorate al doppio strato lipidico mediante un lipide legato covalentemente alla proteina o direttamente o mediante uno zucchero. Altre proteine sono legate alla membrana mediante adsorbimento a proteine transmembrana. Molte delle proteine di membrana sono glicoproteine dal momento che il loro dominio extracellulare è caratterizzato dalla presenza di carboidrati. Le cellule possono ricevere un segnale detto ligando (che verrà inglobato tramite meccanismi di endocitosi, fagocitosi ecc.) o possono esse stesse segnalare producendo delle molecole che verranno trasportate all’esterno con diversi meccanismi (es. esocitosi).

Tra le proteine transmembrana ci sono per esempio le caderine. Le caderine, una volta organizzatesi in dimeri, prendono connessione tramite il loro dominio extracellulare con le caderine presenti su cellule adiacenti. A livello citoplasmatico le caderine prendono contatto con altre proteine che regolano il citoscheletro della cellula. Le proteine di membrana implicate nel trasporto attraverso la membrana possono agire come canali o come proteine trasportatrici o carriers. I canali si aprono in presenza di segnali specifici e sono responsabili di un trasporto passivo (diffusione). I carriers sono responsabili di un trasporto attivo che invece richiede energia.

Tipi di segnalazione

Una cellula segnale può secernere molecole segnale che si andranno a legare a livello di un recettore presente su un’altra cellula. Si parla in questo caso di segnalazione tramite molecole secrete e non è richiesta vicinanza tra la cellula che segnala e la cellula bersaglio. Una cellula segnale può presentare sulla superficie molecole segnale che verranno poi riconosciute da un recettore su un’altra cellula. Si parla in questo caso di segnalazione tramite molecole di membrana plasmatica ed è richiesta vicinanza tra le due cellule coinvolte.

Se le cellule sono lontane tra loro il segnale entra nel torrente circolatorio e raggiunge il target attraverso un meccanismo d’azione endocrino (ormoni). Se le cellule sono vicine tra loro si parla di segnalazione locale che avviene mediante un meccanismo d’azione paracrino. Se invece le cellule si autoregolano si parla di comunicazione autocrina: è la cellula stessa che libera e risponde al segnale da essa stessa emesso.

Altra segnalazione importante ed estremamente rapida è la segnalazione sinaptica che avviene grazie a neurotrasmettitori. Esiste anche una segnalazione mediante giunzioni GAP. Le cellule connesse dalle giunzioni GAP condividono piccole molecole, comprese le piccole molecole segnale intracellulari, e possono perciò rispondere a segnali extracellulari in modo coordinato.

Morte cellulare programmata

Le cellule che non ricevono segnali vanno incontro a morte cellulare programmata. Le cellule sono in grado di sopravvivere se sono presenti segnali di base per le funzioni essenziali. Se sono presenti anche segnali aggiuntivi allora le cellule sono in grado di proliferare.

Uno stesso segnale non dà necessariamente sempre una stessa risposta. Il tipo di risposta cellulare dipende dal bersaglio e dal recettore presente sul bersaglio. Consideriamo per esempio l’acetilcolina. A livello del muscolo scheletrico l’acetilcolina induce l’apertura dei canali ionici con conseguente contrazione. A livello del muscolo cardiaco l’acetilcolina ha un effetto completamente opposto in quanto determina un rilassamento della cellula. A livello delle cellule secretorie l’acetilcolina stimola la secrezione.

Recettori e segnali

I recettori sul bersaglio possono essere recettori superficiali in caso di molecola segnale idrofilica (proteina) o recettori intracellulari in caso di molecola segnale idrofobica (ormoni steroidei, cortisolo). Quindi i recettori superficiali legano molecole polari che non sono in grado di attraversare il doppio strato fosfolipidico della membrana cellulare. Per quanto riguarda i recettori superficiali questi si possono trovare a livello del nucleo (segnali genotropici) o a livello del citoplasma (il recettore trasloca solo successivamente nel nucleo).

I recettori intracellulari per i segnali idrofobici sono formati da un domino che lega il DNA, da un sito di legame dell’ormone a livello dell’estremità COOH e da un complesso che attiva la trascrizione a livello dell’estremità NH. In assenza di segnale questo recettore è legato a un complesso proteico inibitorio e non lega il DNA. Il legame del segnale al recettore porta a una modifica conformazionale del recettore causando il distacco del complesso proteico inibitorio. A questo punto il recettore può legarsi al DNA a livello di sequenze specifiche che sono note. Il legame porterà alla trascrizione dei geni target.

Molecole segnale e risposta cellulare

Le molecole segnale hanno tutte una base composta da colesterolo. Gli ormoni steroidei inducono una risposta primaria che porta alla produzione di proteine specifiche che sono a loro volta responsabili di una risposta secondaria. A volte affinché ci sia una risposta sono necessari due segnali diversi che hanno come bersaglio la stessa proteina. La proteina verrà fosforilata in due punti diversi. I due segnali possono anche agire su due proteine diverse. Queste, una volta fosforilate, si complesseranno e si attiveranno.

Il recettore può essere legato a un canale ionico, a una proteina G o a un enzima. I recettori che si legano a proteine G sono molto frequenti e sono definiti recettori 7-TM (7 pass transmembrane protein).

Secondi messaggeri

Il cAMP è un secondo messaggero molto importante. Esempi di risposte cellulari indotte da ormoni mediate da cAMP sono: sintesi e secrezione dell’ormone tiroideo, secrezione di cortisolo, secrezione di progesterone, demolizione del glicogeno, riassorbimento dell’osso ecc. La chinasi A inattiva presenta quattro subunità di cui due catalitiche e due regolatrici. Le chinasi fosforilano proteine citoplasmatiche inducendo la risposta cellulare.

Un altro secondo messaggero molto importante è lo ione calcio. Il calcio è sempre presente a livello cellulare. All’interno della cellula la concentrazione di calcio è di 10^-7 M mentre all’esterno è di 10^-3 M. Nel citoplasma il calcio è compartimentalizzato (si trova a livello dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico). Alcune molecole sono in grado di sequestrare il calcio (calmodulina).

Modificazioni della membrana

Alcuni componenti della membrana, grazie a dei segnali, possono andare incontro a modificazioni. Un esempio è dato dalle catene degli acidi grassi dei fosfolipidi. In seguito a un segnale si attiva una specifica chinasi PI che va a fosforilare il fosfatidilinositolo (PI) e si forma fosfatidilinositolo 4-fosfato (PIP). Un’altra specifica chinasi PIP va a fosforilare il fosfatidilinositolo 4-fosfato e si forma fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP₂). A questo punto la fosfolipasi C-β taglia il PIP₂ in due molecole ossia il diacilglicerolo (attiva la proteina chinasi C determinando risposte cellulari) e l’inositolo 1,4,5-trifosfato (IP₃) (attiva la via del calcio).

Esistono diverse proteine G (G_s, G_olf ecc.) ognuna con funzioni diverse. Altra classe di recettori è rappresentata dai recettori dotati di attività enzimatica. Un esempio è dato dai recettori delle efrine. Le efrine sono segnali coinvolti nella migrazione delle cellule della cresta neurale. Il legame con le efrine media la dimerizzazione dei recettori. Anche il recettore del GH dimerizza.

Fecondazione

Ci occuperemo di due modelli sperimentali: studieremo infatti la fecondazione esterna nel riccio di mare e la fecondazione interna nei mammiferi. In generale c’è una grande difficoltà di incontro tra i gameti maschili (spermatozoi) e i gameti femminili (cellula uovo). Il movimento dello spermatozoo verso la cellula uovo è guidato da molecole prodotte dall’uovo o da altre componenti della gonade, un processo noto come chemiotassi.

Riccio di mare

Occupiamoci in primis del riccio di mare. I gameti vengono rilasciati all’esterno e si possono trovare anche molto distanti tra loro. Inoltre non è detto che l’incontro fra i gameti venga sempre facilitato dalle correnti d’acqua. Sono dunque necessari dei meccanismi che facilitino l’incontro in acqua dei gameti. Dai gameti di riccio di mare sono state isolate diverse molecole attraenti una, chiamata “resact”, un piccolo peptide formato da 14 amminoacidi, si trova nell’involucro gelatinoso più esterno della cellula uovo. A basse concentrazioni, resact attrae gli spermatozoi in modo specie-specifico, ad alte concentrazioni invece gli spermatozoi perdono la capacità di rispondere alla sua azione perché la risposta è dovuta a recettori specifici.