Appunti di virologia

Virologia

Concetto di virus

Il botanico Ivanowski nel 1892 dimostrò che l’estratto di una pianta di tabacco affetta da malattia poteva trasmettere la malattia ad altre piante dopo filtrazione tramite filtri in grado di trattenere i batteri. I virus sono agenti “filtrabili”. Patologie causate da virus risalgono a moltissimi anni prima di Cristo, ma il concetto di un eventuale agente filtrabile che può causare una patologia proviene dallo studio di una pianta, quella del tabacco. Questa malattia poteva essere trasmessa ad altre piante per filtrazione. Si inizia a parlare di eventuali agenti filtrabili.

Dopo Iwanowski nel 1898, Beijerinick conferma ed estende i risultati ottenuti da Iwanowski: per primo introduce l’idea di virus. Loffler e Frosch individuano “virus filtrabili animali” (afta del bovino): dimostrano che i virus possono infettare anche gli animali, afta trasmissibile da un animale a un altro. Con la febbre gialla, primo virus messo in evidenza. Trasmesso da vettori artropodi, zanzare, ed è endemico in zone paludose in cui non ci sono condizioni igieniche ottimali.

1900, virus filtrabili nell’uomo (febbre gialla - virus trasmesso mediante vettori artropodi come le zanzare). 1908, Landsteiner e Popper dimostrano che i virus possono infettare anche l’uomo (virus della poliomielite – causa molti invalidi e si dimostra che la poliomelite era causata da un virus). 1911, Rous descrisse un virus che causava tumori nei polli – linfoma di Rous (p53 e p21 non sono più controllate sotto infezione virale).

1915-1917, Twort e d’Herelle: identificazione di virus batterici: questi virus verranno impiegati come sistema modello per investigare diversi aspetti della virologia.

Cos'è un virus

Un virus è un agente filtrabile (piccole dimensioni, tra 20-400 nm) costituito da un involucro proteico che contiene e protegge il materiale genetico costituito da una o più molecole di DNA o RNA, mai entrambi. L'involucro serve inoltre per la penetrazione intracellulare del virus (eucariotico, i procarioti invece lo iniettano). Il capside può contenere anche enzimi e proteine leganti gli acidi nucleici, utili nel processo replicativo. In alcuni virus troviamo un rivestimento lipidico chiamato envelope o pericapside. I virus privi di envelope sono chiamati virus con capside nudo.

I virus non sono in grado di replicarsi autonomamente, questo differenzia i virus dagli altri esseri viventi. All'interno di un virione non c'è sintesi proteica e non ci sono i macchinari cellulari per effettuarla. Sono infatti parassiti intracellulari obbligati, si replicano all’interno della cellula ospite utilizzando l’apparato metabolico cellulare per formare i vari componenti (non è in grado di produrre energia e sintetizzare proteine al di fuori della cellula ospite), che verranno assemblati per formare le nuove particelle virali. I virus si replicano, a differenza dei batteri, per assemblaggio delle componenti virali pre-formate.

I virus non possono essere considerati in senso stretto microrganismi: hanno alcune caratteristiche degli esseri viventi in quanto sono in grado di replicarsi, ma nel contempo non hanno alcuna attività metabolica.

I virus si distinguono da altri “parassiti obbligati”, alcuni dei quali sono anche più semplici dei virus:

• Clamidiae: parassiti batterici intracellulari obbligati che dipendono dalla cellula eucariotica per il loro metabolismo. Hanno ribosomi, capacità di produrre energia pur vivendo dentro l’ospite.
• Micoplasmi: piccoli batteri che crescono solo in terreni complessi o adesi a superfici di cellule eucariotiche.
• Protozoi: parassiti intracellulari obbligati di cellule eucariotiche.

Le particelle virali presentano sulla loro superficie “anti-recettori” che riconoscono i recettori sulle cellule bersaglio.

Proteine virali

Proteine funzionali, ad esempio proteine impiegate nella replicazione (DNA/RNA polimerasi virale). Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle virali come costituenti del capside o elemento “virus-specifico” a livello dell’envelope. Proteine che alterano alcune funzioni/strutture della cellula ospite. Proteine strettamente associate agli acidi nucleici.

Funzioni delle proteine virali

• Protezione del genoma. Le proteine strutturali si assemblano a formare un guscio proteico stabile intorno al genoma, che sono in grado di riconoscere e incorporare al loro interno durante l’assemblaggio. Così non può essere degradato dalle proteasi. Alcuni virus hanno evoluto in maniera precisa alcuni meccanismi in modo da riconoscere solo DNA o RNA virale, altri invece riconoscono anche altri acidi nucleici ma sono delle eccezioni.
• Interagiscono con le membrane dell’ospite per formare l’envelope.
• Trasferimento del genoma. Il virus è un sistema biologico che si è evoluto per trasferire il proprio genoma. Le proteine virali devono assolvere a questa funzione interagendo con la membrana della cellula ospite, attraverso gli antirecettori che riconoscono e legano i recettori sulla superficie della cellula. Inoltre sono essenziali per eventi quali la scapsidazione del genoma, la fusione dell’envelope con membrana dell’ospite e il trasporto del genoma all’interno della cellula.
• Altre interazioni con l’ospite. Per garantire un ciclo infettivo efficiente o resistere al sistema immunitario. Alcune proteine interferiscono con capacità di difesa dell'ospite, alcuni virus si sono evoluti per distruggere il sistema di difesa dell'ospite, ancora prima di distruggere le cellule del sistema immunitario stesso. Interazioni con componenti cellulari per permettere trasporto a livello dei siti di “assemblaggio”.

Struttura della particella virale

Hanno strutture diverse, si distinguono le icosaedriche e le filamentose. Le forme sono associate al fatto che devono proteggere in maniera efficiente l'acido nucleico. La particella virale consiste di un genoma di acido nucleico rinchiuso in un rivestimento proteico, detto capside [part. virale = capside + ac. nucleico]. Può essere presente anche un pericapside, detto envelope.

Conseguenze delle caratteristiche virali

• I virus per resistere in natura devono essere infettivi. Se i virus perdono la capacità di entrare nella cellula non sono più infettivi, e quindi vengono eliminati. Virus con strutture difettive non sono infettivi. La struttura dev'essere quindi costituita di tutte le sue parti e devono essere tutte funzionali, se il virus perde la capacità di entrare nella cellula, il virus non riesce più a permanere in natura senza "protezione". HIV permane per poco nell’ambiente, perde velocemente i rivestimenti proteici.
• I virus devono essere in grado di utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i propri componenti. Se i virus entrano nella cellula, non è detto che possano utilizzare i macchinari cellulari per produrre i propri componenti, dunque perde la sua funzionalità.
• Parallelamente, i virus devono codificare proteine specifiche per ogni processo da loro richiesto e non effettuabile dalla cellula.
• Le diverse componenti virali preformate devono essere in grado di autoassemblarsi.

Agenti non convenzionali

Oltre ai virus ci sono agenti non convenzionali quali i viroidi e i virusoidi. I viroidi sono stati identificati nelle piante. Sono costituiti da solo RNA con attività catalitiche. L’RNA non codifica per proteine e si replica nel nucleo. Si chiamano anche ribozimi, patogeni per le piante e sfruttati per approcci di terapia genica. I virusoidi, costituiti da RNA e proteine, sono virus che hanno perso proteine importanti per la loro replicazione. Quindi non sono in grado di replicarsi senza un virus helper. Nelle cellule di mammifero il virus dell'epatite delta è un virusoide, ha bisogno di un virus helper. La replicazione avviene nel citoplasma.

Tra gli agenti non convenzionali ci sono anche i prioni. Si tratta di proteine in grado di autoreplicarsi e di autotrasmettersi e si ritiene siano responsabili di molte patologie. In realtà ad oggi è ancora un'ipotesi perché non sono rispettati i postulati di Koch, manca la dimostrazione che questa proteina purificata e inoculata sia in grado di dare origine ai sintomi propri di queste patologie. Non c'è ancora oggi un protocollo che garantisca la riproducibilità dell'esperimento.

- PrP e PrPsc Nelle nostre cellule esiste la PrP particolarmente espressa nel SNC e ha funzioni omeostatiche. Può diventare patogena nella forma PrPsc. La differenza tra la PrP normale e quella patologica è il folding. Quella normale è alfa elica quella patologica è a foglietto e precipita. Sono ancora oggi "un'ipotesi". Questi agenti patogeni sono costituiti solo da proteina in grado di catalizzare la trasformazione della forma normale in forma patologica.

Fatti di proteine prp. Ancora oggi non si sa a cosa servano di preciso, probabilmente serve all'omeostasi delle cellule del sistema nervoso, se muta può creare disfunzioni e può divenire patogena. La patologica è insolubile, precipita come fibrille e dà origine a infezioni tipiche da prioni, necrosi nel cervello (veri e propri buchi).

Sono ancora un'ipotesi perché in realtà "prione" sta solo per proteine e seconda una teoria questi agenti patogeni sono costituiti solo da proteina in grado di autogenerarsi e autocatalizzare la formazione sia della forma patologica che della forma normale. Ciò va contro il dogma della virologia e rimane ancora un'ipotesi perché non rispetta i principi di Koch, manca la dimostrazione che la proteina purificata, inoculata in un animale sia in grado di dare origine ai sintomi.

Virus come agenti infettivi

Non tutti i virus rispondono ai postulati di Koch per una serie di motivi legati alla biologia dei virus. Nonostante ci siano una serie di prove. Infatti non tutti i virus possono essere coltivabili a differenza dei batteri. Per poterli coltivare abbiamo bisogno di cellule suscettibili e permissive all'infezione e molti virus non possono crescere in coltura. Altri sono così patogeni da non poter essere coltivati se non in laboratori ad alto livello di sicurezza. Inoltre alcuni virus essendo altamente specie specifici non hanno un modello animale. Ci sono modelli animali surrogati che possono essere utilizzati. Infatti ad esempio nessuno ha mai purificato l'HIV da un individuo e inoculato in un altro. Nonostante ciò ci sono numerose prove della relazione tra HIV e AIDS.

Origine dei virus

I virus sono probabilmente “vecchi” quanto la vita sulla terra. Molti virus sono co-evoluti con l’uomo e i popoli antichi conoscevano le malattie virali. Primo documento che riporta un’infezione virale è un geroglifico di Memphis del 1500 a. C. che rappresenta un sacerdote del tempio con i tipici segni della poliomelite. La poliomelite comporta deformità degli arti. Le pustole sono tipiche del vaiolo. Si parla così di “agente infettivo”.

Il vaiolo era endemico in Cina dal 1000 a. C.. L’osservazione, che i soggetti sopravvissuti alle epidemie di vaiolo erano protetti da successive infezioni, ha portato allo sviluppo della pratica della vaiolizzazione. Consisteva nell’inalazione di croste essiccate ottenute da lesioni vaiolose oppure, in successive modificazioni, nell’inoculazione del pus ottenuto da una lesione in una scarificazione dell’avambraccio. Questa pratica è rimasta fino a 2 secoli fa.

Vaccini: prime osservazioni. Edward Jenner: osservò che i mungitori quotidianamente a contatto con il virus vaccinico (cowpox) raramente venivano infettati. Con il virus cowpox raramente si infettavano i mungitori, infatti non è patogeno per l'uomo ma lo è per le vacche. Se inoculo il virus del vaiolo del vaccino nell'uomo, viene stimolato e quando vengo a contatto col virus viene eliminata l'infezione dal sistema immunitario.

Sviluppo: Il 14 maggio 1796, Jenner usò materiale infettato dal virus del vaiolo bovino (virus vaccino) ottenuto dalla mano di Sarah Nemes, una mungitrice di Berkeley nel Gloucestershire per vaccinare James Phipps, un bambino di 8 anni. 1 luglio 1796: Jenner inoculò deliberatamente il bambino con materiale ottenuto da un caso di vaiolo. Il bambino non si infettò!

1885, Pasteur sperimentò la vaccinazione contro la rabbia, utilizzando il termine virus (dal latino veleno) per descrivere l’agente infettivo. Sebbene non discriminasse tra i virus ed altri agenti infettivi, coniò i termini virus e vaccinazione (in onore a Jenner) e sviluppò le basi scientifiche dell’approccio sperimentale per la vaccinazione.

Postulati di Koch

Anche se questi vengono usati per stabilire l’eziologia di agenti infettivi, nel caso degli agenti virali non tutti questi criteri possono essere sempre soddisfatti, per alcuni anche se è collegato virus a patologia, non c’è una conferma che sia responsabile della malattia. Alcuni agenti virali non possono essere coltivati in vitro, solo alcuni possono essere cresciuti in coltura e dunque non posso amplificarli, purificarli e inocularli.

Come sono divenuti entità ‘indipendenti’? Unico requisito assoluto: acido nucleico e ODR

• Teoria regressiva: sostiene che i virus siano forme degenerate di parassiti endocellulari. Ma i virus non hanno nessun tipo di attività metabolica e non possiedono il macchinario per la traduzione. Anche mitocondri e cloroplasti possono essere derivati da fenomeni di parassitismo endocellulare ma i virus non hanno i propri rRNA e ribosomi. Rickettsia spp. e chlamydia spp. hanno evoluto in questa direzione. A partire da alcuni batteri si sarebbero evoluti virus che sono entità più semplici rispetto a clamidiae e rickettsia perché mancano di alcuni organelli e apparato per produzione di proteine. È stata dimostrata per mitocondri e cloroplasti questa teoria, sono derivati da batteri molto semplici che sono man mano regrediti e derivano sa questi fenomeni di parassitismi endocellulare. Non si capisce però perché abbiano perso ribosomi e rRNA.
• Teoria progressiva: sostiene che i virus derivino da DNA e RNA cellulari che si sono evoluti verso l’autonomia di replicazione. Ad esempio i virus a DNA si sono evoluti da plasmidi o da elementi trasponibili e i virus ad RNA da mRNA; retrovirus evoluti da retrotrasposoni. L’informazione genetica divenuta capace di codificare proteine di rivestimento.
• Teoria co-evolutiva: sostiene che i virus si siano evoluti parallelamente agli altri organismi con modalità diverse nell’ambito delle varie organizzazioni biologiche.

Dibattito acceso dopo la scoperta di mimivirus, virus giganti, per inserirli come entità biologica nell'albero della vita. Hanno alcuni tRNA dentro il genoma e sono a loro volta infettati da altri virus. Possibile quarto regno dunque. Perché inserire i virus nell’albero della vita. Mimivirus. Virus giganti che possono essere identificati al OM, non hanno DNA che codifichi per RNA ribosomiale, quindi non possono essere classificati tra i batteri e per altre caratteristiche sono stati riconosciuti come virus. Fino al 2003, quando AMPV, ha fatto ridefinire la definizione di virus. Hanno fino a 6 RNA, Entrano nella cellula per endocitosi, dovuto alla grande dimensione di questi virus e ha dei significati riguardo il grande range di cellule che può infettare. Rimane ancora una teoria il fatto che appartengano al quarto regno.

I virus animali

Una volta incontrato l’ospite il virus deve penetrare all’interno della cellula per iniziare l’infezione. (N.B. I virus eucariotici entrano nella cellula, i virus procariotici iniettano il DNA all’interno della cellula).

Tropismo virale: primo concetto per capire patogenesi. E' sicuramente fondamentale per i virus, mentre i batteri possono colonizzare un tessuto o organo preferenzialmente rispetto a un altro, i virus se non incontrano la cellula che possono infettare, non possono instaurare un'infezione. I virus hanno un'affinità precisa per alcuni tessuti o tipi cellulari, alcuni hanno recettori diffusi nelle cellule umane, altri molto specifici. Ciò limita moltissimo la capacità infettiva del virus.

Nei virus animali abbiamo il fenomeno del tropismo virale, cioè l’affinità per specifici tessuti e tipi cellulari. Il tropismo deriva dalla necessità di sfuggire alle difese naturali dell’ospite, quali le barriere fisiche, il Ph e la temperatura. L’insieme dei tipi cellulari di una o più specie animali che consentono la replicazione di un determinato virus prende il nome di spettro dell’ospite. Può essere ampio o limitato. I virus devono sfuggire alle difese “naturali”.. barriere fisiche (cute integra, muco, inibitori aspecifici, IgA), temperatura e pH. Le difese naturali sono molto efficienti e anche se siamo quotidianamente a contatto con virus, non ci ammaliamo automaticamente a meno che non veniamo a contatto con virus evoluti. Alcuni superano la cute tramite la puntura di alcuni insetti, alcuni si trovano nelle secrezioni o a livello delle mucose e le Ig di tipo A sono molto sensibili. La temperatura è un aspetto molto importante, di più rispetto ai batteri, il corpo reagisce aumentando la temperatura così l'infezione batterica viene bloccata, invece alcuni virus, rinovirus, vivono alla temperatura del tessuto, per esempio nelle vie aeree superiori trovano la temperatura adatta perché i loro enzimi funzionano.