appunti di biochimica applicata

Tecniche elettroforetiche

L’elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole elettricamente cariche.

Principi generali

Migrazione differenziata in un campo elettrico di molecole elettricamente cariche.

Le particelle che subiscono l’azione del campo elettrico si muoveranno verso il polo di carica opposta.

Risentono di una forza di attrazione (o di spinta).

Forza di attrito - forza che esercitano le altre molecole del sistema sulla particella quando si deve spostare per raggiungere il polo di carica opposta. (Forza frenante)

Legge di Stokes

In un intervallo di tempo, le due forze raggiungono una condizione di equilibrio.

Considerazioni:

• Le particelle si trovano tutte nello stesso mezzo;
• Sono tutte immerse nello stesso campo elettrico;
• La velocità di migrazione di una particella carica sottoposta all’azione del campo elettrico è direttamente proporzionale alla carica e inversamente proporzionale alla massa.

Tecniche elettroforetiche

L'elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole elettricamente cariche.

Principi generali

Migrazione differenziata in un campo elettrico di molecole elettricamente cariche.

Le particelle che subiscono l'azione del campo elettrico si muoveranno verso il polo di carica opposta.

Risentono di una forza di attrazione (o di spinta).

E = V/dt_S = qE

q = intensità di carica

Forza di attrito – forza che esercitano le altre molecole del sistema sulla particella quando si deve spostare per raggiungere il polo di carica opposta. (Forza frenante)

Legge di Stokes: F_c = 6πηv

In un intervallo di tempo, le due forze raggiungono una condizione di equilibrio.

qE = 6πηv

La differenza tra le due forze è costante.

qE = 6πηv

Considerazioni:

• Le particelle si trovano tutte nello stesso mezzo;
• Sono tutte immerse nello stesso campo elettrico;

Si deduce che: E, 6πη = K (costanti)

v = q₄/_r

q = carica della particella

r = raggio della particella

[r è proporzionale alla RM della particella]

La velocità di migrazione di una particella carica, sottoposta all'azione del campo elettrico, è direttamente proporzionale alla carica e inversamente proporzionale alla massa.

Velocità di migrazione

v_m = q/RM

2. particelle con massa diversa si muoveranno all'interno del campo elettrico con velocità diversa.

Mobilità elettroforetica (μ)

μ = _Vm/_E

Particelle con mobilità elettroforetica diversa, sottoposte all'azione dello stesso campo elettrico, migreranno con velocità diversa.

Materiali di supporto

• Alimentatore di corrente
• 2 elettrodi (negativo e positivo)
• Vaschetta per il tampone consente il collegamento tra il supporto e i 2 elettrodi permettendo il passaggio di corrente. La corrente viene trasportata dagli ioni del tampone e dalle biomolecole cariche.
• La matrice (supporto) dove vengono caricati i campioni posti a loro volta in pozzetti creati da un pettinino posto nel gel ancora non polimerizzato.

Le tecniche elettroforetiche sono di diversi tipi a seconda del supporto utilizzato, della cella elettroforetica, di composti presenti ecc... I supporti, degli agenti usati per rilevamento del materiale sottoposto ad elettroforesi, ecc.

Elettroforesi zonale

I materiali impiegati sono:

• Acetato di cellulosa: sostituisce la carta da filtro striscette di carta.

Viene utilizzata per la separazione delle proteine sieriche.

1° La striscia di acetato di cellulosa, che funge da supporto viene inibita con il tampone e poi immersa di due lati in due vaschette contenenti lo stesso.

2° Il siero viene caricato sull’acetato di cellulosa.

3° Si applica la differenza di potenziale.

4° Le proteine del siero che hanno carica negativa si muoveranno verso l’elettrodo di polo opposto (anodo) e viceversa.

6° Si spogano l’eliminatore e si ottiene una serie di strie corrispondenti ad una proteina o ad gruppo di proteine che hanno tutte una carica e una mobilità elettroforetica diversa.

Queste proteine devono essere rivelate e dosate.

Si prende la striscia di acetato di cellulosa e si va a colorare con un opportuno colorante che si lega alle proteine.

Per dosare si intende, effettuare un’analisi quantitativa di una proteina in esame. Per fare ciò si utilizza uno strumento chiamato densitometro.

Un densitometro è uno spettrofotometro, in grado di misurare la trasmissione della luce attraverso la striscia di acetato di cellulosa, convertendo i valori del densitometro