Appunti di Biochimica e biochimica applicata

Le proteine

Le proteine sono le macromolecole più abbondanti in tutti i tipi di cellule e con molte funzioni:

• Strutturale, materiali per costruire ogni struttura (fibre di tendini e legamenti, tela del ragno, albumina);
• Contrattili, permettono i movimenti muscolari (actina e miosina);
• Di riserva, con funzione energetica e scorta di nutrienti essenziali (ovalbumina nell’albume dell’uovo, riserva di amminoacidi per l’embrione);
• Di difesa, anticorpi;
• Trasporto, emoglobina;
• Segnale, messaggeri tra cellule per coordinare le attività corporee (ormoni);
• Enzimi, catalizzatori chimici (idrolasi).

Possono avere un ruolo negativo come fattori antinutrizionali (inibitori dell’amilasi nella cariosside del frumento), tossine prodotte da microorganismi contaminanti e allergeni. Sono composte da C, N, O e H. Il monomero di base è l’amminoacido, infatti una proteina è formata dall’insieme di questi a formare catene polipeptidiche. Se si hanno almeno 100 amminoacidi è una proteina, se di meno si tratta di un polipeptide.

Amminoacidi

Gli amminoacidi per la formazione delle proteine sono 21 (il 21° è la seleniocisteina), si combinano in ordine diverso per formare proteine differenti. Gli amminoacidi sono formati da un gruppo amminico, un carbonio alpha, un gruppo carbossilico e un gruppo alchilico variabile, dal quale dipende la tipologia di amminoacido. Sono classificati in base alle catene R, che determinano in base alla polarità la tendenza a interagire con l’acqua. Hanno tutti COOH e NH₂ libero non sostituito legato al carbonio alpha e sono legati a quattro gruppi diversi.

Eccezioni:

• La prolina ha COOH e NH₂ liberi non sostituiti, legati al carbonio alpha. Si ha un gruppo imminico e si forma un ciclo;
• La glicina ha un H al posto di R, quindi può legare due H. Il C in alpha non è asimmetrico, ovvero chirale con 4 sostituenti diversi.

Gli amminoacidi che hanno un centro asimmetrico nel carbonio alpha hanno due stereoisomeri, isomeri ottici o enantiomeri: D (destra) e L (sinistra). Le proteine contengono solo L-amminoacidi.

Un amminoacido è essenziale se non può essere sintetizzato dall’organismo, ma deve essere introdotto con l’alimentazione (origine animale: carne, uova). Quelli semi-essenziali si devono introdurre solo nello sviluppo, perché in età adulta vengono prodotti dall’organismo. Possono essere classificati in base a: catene laterali, polarità e pH.

Classificazione degli amminoacidi

• Apolare: catene idrocarburiche sature, idrofobici (glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina). La prolina ha una struttura ad anello con la catena laterale e il gruppo amminico, differisce dagli altri amminoacidi per il gruppo imminico, poco polare.
• Aromatici: catene aromatiche, non polari e partecipano a interazioni idrofobiche (fenilalanina, tirosina, triptofano). I gruppi -OH della tirosina e NH del triptofano possono formare legami a idrogeno.
• Polari non carichi: senza carica (serina, treonina, cisteina, metionina, asparagina, glutammina). I loro gruppi R sono più idrofilici di quelli non polari, i gruppi funzionali formano legami a idrogeno con l’acqua. La polarità di serina e treonina è data da -OH, quella della cisteina da -SH, asparagina e glutammina da gruppi ammidici -CONH₂.
• Polari con carica positiva: basici, che accettano protoni (istidina, lisina, arginina). L’istidina è debolmente basica e l’amminoacido libero è non ionizzato, quando si trova in una proteina può recare carica positiva o essere neutra.
• Polari con carica negativa: acidi, che donano protoni.
• Amminoacidi non standard: presenti nelle proteine ottenuti dalle modificazioni post-traduzionali e non presenti nelle proteine.

Gli amminoacidi sono solidi cristallini, solubili in acqua e quindi solidi ionici. Allo stato cristallino sono in forma anfoionica. La loro natura dipolare è dimostrata dai punti di fusione molto più alti rispetto a molecole organiche di pari massa. Possono essere in forma non ionica, senza cariche, o in forma zwitterionica, con entrambe le cariche al punto isoelettrico (anfoione).

Punto isoelettrico e proprietà degli amminoacidi

COOH = COO^- + H⁺ acido debole. NH₂ + H₂O = NH₃⁺ + OH^- base debole. A pH neutro c’è forma anfoionica. A pH acido si ha la forma cationica e l’equilibrio è verso sinistra, il gruppo COOH non si dissocia ma NH₂ prende H⁺ (non c’è carica in COOH). A pH basico si ha la forma anionica, COOH si dissocia ma NH₂ non acquista H⁺.

Punto isoelettrico = la concentrazione dell’anione e del catione sono uguali, la carica netta è nulla. L’amminoacido non migra se sottoposto ad un campo elettrico. Il pI è una caratteristica di ogni singolo amminoacido. Nella elettroforesi si separano le proteine in base alla carica. Gli amminoacidi migrano nel polo opposto rispetto alla carica.

Possono essere: glucogenici, generano glucosio; chetogenici, generano corpi chetonici ovvero energia; entrambi, otteniamo acido piruvico o un intermedio del ciclo di Krebs. Se non vengono utilizzati gli amminoacidi vengono degradati perché non si ha una riserva proteica. Quando si demoliscono si producono sostanze da utilizzare.

Gli amminoacidi si uniscono con legami peptidici, non si rompono per ebollizione ma con azione prolungata di acidi o basi concentrati o con enzimi proteolitici. Il legame viene formato tra un amminoacido di inizio, con NH₂ libero, che lega il gruppo carbossilico al gruppo amminico del secondo amminoacido. Avviene una reazione di condensazione e si perde H₂O. Il carbonio di -COOH si lega a N del gruppo amminico. Si può ripristinare la situazione di prima solo tramite idrolisi acida. La catena può allungarsi ad entrambe le estremità. Energia di legame = 100 Kcal/mol.

Legame peptidico

• Legame doppio parziale, più corto del legame singolo (carattere 60% legame singolo, 40% doppio);
• Rigido e planare (per il legame doppio), non si ha rotazione;
• Tipo trans, per le interferenze steriche tra i gruppi -R;
• NH e C=O non hanno cariche ma sono polari e formano legami a idrogeno.

La catena polipeptidica ha un legame coda-testa, un gruppo N-terminale e un gruppo C-terminale, senza formare diramazioni. Si legge dalla N-terminale verso C-terminale. La formazione in successione di legami peptidici genera la catena principale da cui protrudono le catene laterali dei diversi amminoacidi. Le catene polipeptidiche hanno una polarità. La maggior parte degli oligopeptidi e peptidi presenti in natura hanno una struttura lineare con estremità N-terminale e C-terminale libere. Esistono anche oligopeptidi ciclici. In molti casi le estremità dei polipeptidi sono modificate. Ogni proteina ha una sequenza specifica che viene codificata dalla sequenza nucleotidica del DNA.

Strutture delle proteine

La proteina può avere 4 strutture:

• Struttura primaria, data dalla sequenza di amminoacidi, è sede delle mutazioni genetiche (inserimento errato dell’amminoacido) e lineare;
• Struttura secondaria, conformazione della catena, è indipendente dai gruppi R e si distingue in alpha-elica e beta-foglietto;
• Struttura terziaria, tridimensionale (forma gomitolo) per folding, relazioni locali o remote dei gruppi R e localizzazione dei ponti -S-S-;
• Struttura quaternaria, interazioni covalenti tra più catene.

Struttura primaria

Nel 1953, Frederick Sanger individuò le sequenze amminoacidiche delle due catene polipeptidiche dell'insulina. Sanger stabilì che le proteine sono chimicamente ben definite. Tutte le proteine: hanno una composizione di amminoacidi fissa, una sequenza di amminoacidi definita, un peso molecolare costante. Oggi, sono note le sequenze amminoacidiche di centinaia di migliaia di proteine differenti. Molte sequenze sono state determinate con l'applicazione dei principi di Sanger, ma la maggior parte viene ricavata dalla conoscenza della sequenza nucleotidica del gene che le codifica. Ogni proteina di ogni organismo è dotata di una sequenza definita:

• La sequenza di una proteina costituisce la sua struttura primaria;
• Tutte le molecole di una data proteina di un certo organismo hanno la stessa struttura primaria;
• Proteine corrispondenti (omologhe) di organismi appartenenti a specie diverse presentano strutture primarie simili (diverse solo parzialmente);
• Le catene polipeptidiche sono lineari ma possono presentare ponti disolfuro;
• Una proteina può essere costituita da più catene polipeptidiche;
• La struttura primaria di una proteina corrisponde alla sua struttura covalente: è la sua sequenza amminoacidica e la localizzazione degli eventuali ponti disolfuro.

Tutte le strutture dipendono dalla primaria. L’organizzazione spaziale degli atomi di una proteina viene detta conformazione. Quella primaria è un insieme dei legami covalenti che uniscono le subunità monomeriche di una proteina, la secondaria si riferisce a disposizioni particolarmente stabili dei residui amminoacidici, la terziaria il ripiegamento tridimensionale e la quaternaria descrive la disposizione nello spazio.

Struttura secondaria

• Alpha elica, riavvolgimento intorno a un asse immaginario. I gruppi R sono rivolti verso l’esterno per evitare l’ingombro sterico. Ci sono legami a idrogeno intracatena (all’interno della catena) tra amminoacidi, i ponti a H sono ogni 3-6 amminoacidi. Il legame si instaura tra H dell’azoto amidico e O del gruppo carbonilico di residui distanti l’uno dall’altro 4 posizioni nella sequenza. Si può avere elica destrorsa o sinistrorsa. Si possono avere delle restrizioni alla stabilità di questa elica tra cui: la repulsione tra i gruppi laterali R, l’impedimento sterico di gruppi R, la presenza di prolina (manca la libera rotazione C alpha N, manca l’idrogeno libero per formare il legame idrogeno), l’interazione tra gruppi R. Questo determina la formazione di segmenti avvolti a caso.
• Beta foglietto, ripiegamenti delle catene per la formazione di ponti a idrogeno tra il gruppo ammidico e carbonilico di catene una accanto all’altra e parallele (intercatena). Anche qui sono rivolte verso l’esterno.
• Strutture supersecondarie, combinazioni di strutture secondarie ad alpha elica e beta foglietto.
• Tripla elica allungata (collagene), con 3 eliche con interazioni a idrogeno. Ogni catena forma un’elica sinistrorsa con tre residui per giro e una distanza tra residui di 2,9 Armstrong.

Struttura supersecondaria

• Sono combinazioni di strutture secondarie ad alpha elica e beta foglietto;
• I beta ripiegamenti si trovano di solito nelle posizioni in cui la catena peptidica cambia bruscamente di direzione. Questi ripiegamenti collegano spesso le estremità di due segmenti adiacenti di un foglietto beta ripiegato antiparallelo e comprendono circa 4 residui amminoacidici.
• Altre superstrutture secondarie: unità alpha alpha tra due alpha eliche, unità beta alpha beta un’alpha elica tra 2 foglietti beta.

Struttura terziaria

Determina la struttura tridimensionale. Si ripiega su se stessa formando un gomitolo. Intervengono legami a idrogeno e i ponti disolfuro per stabilire la struttura (in base alla forza del legame). Anche interazioni elettrostatiche. Ci sono anche interazioni idrofobiche per amminoacidi non polari e permette di tenere l’acqua fuori dalla proteina perché potrebbe interferire con le reazioni, tasca idrofobica. Suscettibile a denaturazione. Due modelli: impaccamento di alpha eliche e una rete di strutture a foglietto beta. I ripiegamenti sono stabilizzati da legami deboli. I residui idrofobici sono all’interno e quelli idrofilici sulla superficie a contatto con il solvente. La struttura terziaria non è rigida, le proteine globulari hanno una certa flessibilità nel loro scheletro e possono andare incontro ad alcune fluttuazioni a breve raggio. È caratteristica di proteine globulari e fibrose. Ogni proteina globulare e fibrosa possiede una struttura terziaria caratteristica, composta di elementi di struttura secondaria ripiegati in modo specifico, per adattarsi al particolare ruolo funzionale che la proteina riveste. Quelle globulari servono per il lavoro chimico della cellula, la sintesi, il trasporto e il metabolismo. Le fibrose svolgono funzioni strutturali e sono costituite dalla ripetizione di un elemento semplice di struttura secondaria.

Struttura quaternaria

Si legano più catene. Molte proteine esistono nella cellula come aggregati di due o più catene polipeptidiche ripiegate, o subunità. Se le catene sono identiche o quasi identiche, si parla di organizzazione omotipica, in caso contrario eterotipica. In entrambi i casi si ha la formazione di proteine multimeriche. Deriva da interazioni deboli tra le catene polipeptidiche che formano complessi proteici detti oligomeri o multimeri, se il numero di subunità è elevato. La struttura quaternaria si riferisce alla relazione spaziale tra i polipeptidi o le subunità all’interno di una proteina. Ad esempio l’emoglobina, un tetramero con subunità uguali a 2 a 2. È eterotipica, ovvero con catene differenti. Un altro esempio è l’icosaedro di virus sferici, un multimero con subunità identiche autoaggreganti.

Limiti nelle dimensioni delle proteine

• È più semplice sintetizzare molte copie di una proteina piccola che una sola copia di una proteina molto grande.
• La maggior parte delle proteine che hanno massa superiore a 100.000 possiedono più subunità, uguali o diverse, per evitare la formazione di proteine danneggiate (diminuisce la probabilità di errori durante la sintesi proteica).

Folding proteine

Si deve formare la conformazione nativa, ovvero la struttura tridimensionale stabile a bassa energia e funzionale che permetta di svolgere la funzione a cui è deputata. La forma nativa è la forma biologicamente attiva, poiché inizialmente non hanno una funzione specifica. Durante questo processo le proteine vanno da uno stato ad alta energia della struttura unfolded a uno a bassa energia della struttura folded. Il folding in vivo è facilitato da proteine dette chaperon molecolari, che agirebbero in modo da impedire alla proteina in fase di maturazione di intraprendere un percorso di strutturazione errato, che la condurrebbe ad un processo di aggregazione irreversibile. Questo aspetto è importante per patologie come l’Alzheimer, la fibrosi cistica e il morbo della mucca pazza.

Denaturazione

Agenti denaturanti: calore, pH estremi, soluti (urea), detergenti e solventi organici (alcool o acetone). La perdita della struttura provoca la perdita dell’attività biologica, ovvero la struttura nativa. Può essere reversibile (rinaturarsi) o irreversibile. La rinaturazione è la prova che la struttura terziaria di una proteina globulare è determinata dalla sequenza amminoacidica.

Albume = fluido viscoso trasparente di colore giallino con 90% acqua e 10% proteine. Quando si denatura l’albumina non si può ritornare indietro, perché si ha l’addensamento dell’albume e la formazione di una gelatina bianca opaca. È un fenomeno tipico delle proteine globulari.

Proteine di trasporto

Le proteine possono avere funzione di trasporto, negli animali superiori l’ossigeno deve essere veicolato da una carrier perché ha bassa solubilità in acqua. In natura ci sono proteine che interagiscono con l’ossigeno aumentandone la solubilità in acqua e sequestrandolo per trasportarlo.

PM emoglobina = 66500 Dalton PM mioglobina = 16500 Dalton. Tra queste troviamo l’emoglobina (Hb), che trasporta, e la mioglobina (Mb), che riceve. L’emoglobina risulta essere più grossa. La mioglobina la troviamo nelle cellule del miocardio e del muscolo scheletrico, poiché immagazzina l’ossigeno nel citoplasma e lo rilascia nei mitocondri quando necessario. L’emoglobina si trova negli eritrociti, infatti trasporta O₂ dai polmoni alla periferia e la CO₂ dai tessuti ai polmoni; ha anche la funzione di tamponare il pH del sangue. Nel sangue è necessario un trasportatore dell’ossigeno perché questo gas non è abbastanza solubile da soddisfare le esigenze dell’organismo. Grazie all’emoglobina la capacità di trasporto di un litro di sangue passa da 5 a 250 ml di O₂.

Sono entrambe proteine coniugate. Hanno una porzione proteica, la globina, e una prostetica, eme, al quale si lega O₂ e che conferisce il colore rosso al sangue.

Eme

È un sito di legame per l’ossigeno. L’eme è una ferroprotoporfirina (9, varia in base ai sostituenti), un chelato dello ione ferroso Fe²⁺ con la protoporfirina 9. Le porfirine sono derivati della porfina, composto ciclico con 4 anelli pirrolici legati da ponti metinici. Le protoporfirine si ottengono per sostituzione degli 8 H con gruppi vari come 4 metili, 2 vinili e 2 propanoili. Questi gruppi possono avere 15 possibili combinazioni e formare 15 protoporfirine. Nello spazio interno c’è l’atomo di Fe legato a 4 azoti pirrolici da legami coordinativi. L’atomo di ferro ha 6 legami di coordinazione:

• 4 con N degli anelli tetrapirrolici dell’anello porfirinico;
• 1 con un atomo di azoto della catena laterale di un atomo di istidina;
• 1 con l’ossigeno.

Questi ultimi due legami sono perpendicolari al piano della porfirina. Lega l’ossigeno, solo se è in uno stato di ossidazione 2+. Se si passa allo stato di ossidazione 3, si forma l’emina, con una carica positiva, che non lega O₂. Gli atomi di N coordinati impediscono questa conversione. La porzione proteica legata al ferro permette di far restare fuori H₂O, sennò il ferro cambierebbe stato di ossidazione. Infatti si ha la formazione di una tasca idrofobica con la globina.